Name: ニューロスフェアのアッセイを用いたヒト多形性膠芽腫の腫瘍細胞の単離と拡大 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: 学ぶニューロスフェアアッセイを用いたヒト多形性膠芽腫（GBM）由来幹細胞様細胞の単離と拡大培養法。組織処理から細胞培養までの詳細なプロトコルで、腫瘍生物学研究と治療標的探索に有用です。

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脳腫瘍の治療のためのプレストンA.ウェルズジュニアセンター、この作品は、脳腫瘍研究のためのフロリダセンターからの補助金によって支えられている。

1。プライマリGBMのティッシュのコレクション<ol><li>神経膠芽腫mutliforme（GBM）の腫瘍はがんと診断され手術を受けた患者から取得されます。 </li><li>手配は脳神経外科チームと行う必要があります。神経外科医は、神経幹細胞（NSC）10〜15％の抗生物質（Peniciline / Streptomycine）を添加した基礎培地を含む適切なサイズのチューブに切除されたGBMの腫瘍を配置します。冷たい培地は実験室で手術室に提供する必要があります。また、冷HEPES緩衝最小必須培地（HEM）またはリン酸塩は、抗生物質の高濃度で生理食塩水（PBS）もこの目的のために使用できるバッファ。 </li><li>切除した腫瘍組織は、氷上でラボに配信され、ボンネットの下に配置されます。 </li></ol> 2。シングルセル懸濁液中に原発腫瘍の解離<ol><li>オリジナルメディア/ PBSの過剰は、ファルコンチューブから削除され、サンプルは5〜10メートルに2〜3回洗浄し、PBS / NSC基礎培地のlは、血液や破片を除去する。 PBS /培地を除去されており、GBM腫瘍の組織をシャーレに入れられます。 </li><li>組織を小片に切断し、トリプシン処理プロセスのための表面積を大きくする小さな部分に第10号手術用メスの刃で刻まれている。ミンチは、腫瘍の大きさに応じて1〜3分かかる場合があります。 </li><li>みじん切り組織は、予め温めておいた％0.05 37℃の水浴で10〜15分間トリプシン- EDTAの3〜5ミリリットルでトリプシン処理しています。電子ピペットは、15ミリリットルファルコンチューブに小さな腫瘍の部分とトリプシンを転送するために使用されます。 </li><li>大豆トリプシン阻害剤の等量は、潜伏期間の後に酵素のトリプシンを加えて反応を停止されている。 </li><li>トリプシンの不活性化は、上下に数回の中断をピペッティングすることにより確保されている。その後、懸濁液は、5分間約800 rpm（110グラム）で遠心分離することによってダウンしてペレット化です。 </li><li>上清を捨て、組織片を無菌NSC BA 1mlの中に再懸濁されているサル媒体。塊は優しく滑らかな乳白色の単細胞懸濁液が得られるまで（3-7回）上下にピペッティングして解離する。ピペッティングステップ数は、直接ミンチ組織中の粒子のサイズによって異なります。それが細胞死と球形成の減少につながる可能性があるので長いと積極的な機械的解離は避けてください。 </li><li>非解離片や破片を除去するために、基礎培地の10〜15 mlのチューブに添加し、細胞懸濁液を50ミリリットルチューブに40ミクロ​​ンのセルストレーナーで濾過する。 </li><li>フィルタ処理された懸濁液を5分間約800 rpm（110グラム）で遠心分離する。上清はその後破棄されます。 </li><li> Pellettedその後、細胞を細胞計数のための完全なNSCの培地の1〜2ミリリットル中に再懸濁されている。 </li></ol> 3。セル数とめっき<ol><li>細胞懸濁液の10μLを1ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブ0.04％トリパンブルーの90μLに追加されます。 注：他の適当なセルdilutionsを使用することもできます。 </li><li>サスペンションを混在させる上下にピペッティングし。細胞の10μL/トリパンブルー液は細胞密度をカウントするために、血球計数器に転送されます。 </li><li>細胞は0.2％のヘパリンの20ng/ml EGF、10ng/ml bFGFおよび1μl/mlを添加した完全なNSCの培地（9:1の比率でNSC基礎培地とNSC増殖サプリメントの混合物）（2μg/ml）でメッキされています適切な組織培養容器。培地の5、20及び40mlをそれぞれ、T25、T80およびT175フラスコに使用されます。抗生物質は、汚染の可能性を減らすために1:100の濃度で培地に添加してもよい。 </li><li>フラスコを37℃、5％CO 2インキュベーターセットに置かれます。 </li></ol> 4。継代とGBM派生球の拡大： <ol><li>ニューロスフェアは、直径150から200ミクロンの平均サイズに達したときに、文化はサブカルチャーの準備ができています。各フラスコの内容が適切なサイズ滅菌tissで削除して配置されますUEは文化チューブ、そして室温で5分間、800回転（110 g）で遠心分離。 </li><li>上清を除去し、ペレットを％0.05トリプシン- EDTAを1mlに再懸濁されている。 </li><li>最適なトリプシン処理を達成するために、細胞懸濁液を37℃で2〜3分間水浴中でインキュベートされる。トリプシン活性を停止するには大豆トリプシン阻害剤の等量の細胞懸濁液に添加し、細胞懸濁液を静かに上下にピペッティングしています。 </li><li>細胞懸濁液を5分間800回転（110グラム）で遠心分離する。その後、上清を除去し、細胞はNSCの培地1mlに再懸濁する。 </li><li>前述のように細胞数が実行されます。 </li><li>細胞は、増殖因子や、前の部分で説明した適切なサイズの組織培養容器内のメッキを補充した完全なNSCの培地で5 × 10 4細胞/ mlの濃度で播種されています。 </li><li>多湿で37℃でインキュベートしたときの二次ニューロスフェアは7〜10日に形成されています5％CO 2と化されたインキュベーター。 </li></ol> 5。代表的な結果： GBMの腫瘍組織から採取した単一の細胞を播種した後、腫瘍幹様細胞は増殖と（ビデオと図1を参照）3-4日で数個の細胞から成る細胞の小さなクラスターを生成する。これらのクラスターが成長するにつれ、彼らは150から200ミクロンの形式（ビデオおよび図2を参照）の平均粒径が7〜8日でように、より球形、適切な位相明るい球を獲得する。より高い倍率で、健康な球は通常、その周囲にmicrospikesを示しています。培養開始後1-2日以内に、クラスタと同じような大きな球を持つことは、文化の一気飲みで非解離塊の存在によるもので、真球と誤解されるべきではない。原発腫瘍の球培養での残骸の量は、組織の最初のソースで、それは周囲の脳組織を含むかどうかによって異なります。適切な組織の調製技術培地の十分な量の酵素的および機械的解離、およびサンプルのその後のろ過を含むことは文化の小さい破片になる可能性があります。 <img src="/files/ftp_upload/3633/3633fig1.jpg" alt="図1" /> 図1 4日メッキ後のプライマリGBMの球の文化。腫瘍幹様細胞は増殖と3-4日で細胞の小さなクラスターを生成する。オリジナルの倍率、20倍。 <img src="/files/ftp_upload/3633/3633fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。8日間めっき後のパッセージone GBM球の文化を。オリジナルの倍率、20倍。

<ol><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li>
<li>Siebzehnrubl, F. A., Vedam-Mai, V., Azari, H., Reynolds, B. A., Deleyrolle, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Adult+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22+Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Adult Neural Stem Cells.</a> Methods Mol Biol. 750, 61-77 (2011).</li>
<li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Expansion+of+the+Adult+Mouse+Neural+Stem+Cells+Using+the+Neurosphere+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (45), e2393-e2393 (2010).</li>
<li>Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+Embryonic+Mouse+Neural+Stem+Cell+Culture+Using+the+Neurosphere+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (47), e2457-e2457 (2011).</li>
<li>Eramo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+expansion+of+the+tumorigenic+lung+cancer+stem+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population.</a> Cell Death Differ. 15, 504-514 (2008).</li>
<li>Patrawala, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+purified+CD44%2B+prostate+cancer+cells+from+xenograft+human+tumors+are+enriched+in+tumorigenic+and+metastatic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Highly purified CD44+ prostate cancer cells from xenograft human tumors are enriched in tumorigenic and metastatic progenitor cells.</a> Oncogene. 25, 1696-1708 (2006).</li>
<li>Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+resistance+of+tumorigenic+breast+cancer+cells+to+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl.+Cancer.+Inst%22%5BJournal%5D)">Intrinsic resistance of tumorigenic breast cancer cells to chemotherapy.</a> J Natl. Cancer. Inst. 100, 672-679 (2008).</li>
<li>Galli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+tumorigenic%2C+stem-like+neural+precursors+from+human+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma.</a> Cancer Res. 64, 7011-7021 (2004).</li>
<li>Deleyrolle, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+label-retaining+tumour-initiating+cells+in+human+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Evidence for label-retaining tumour-initiating cells in human glioblastoma.</a> Brain. 134, 1331-1343 (2011).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

神経幹細胞および正常成人と胎児の脳1、2、3、4から前駆細胞を単離するために、幹は、同じようにこのような肺5、前立腺6、乳房7、脳8、9のような癌組織由来の細胞ニューロスフェアのアッセイはまた、腫瘍されている頻繁に選択の方法として使用。 ex vivoでの多能、注入時に新しい腫瘍を作成する機能、および自己再生、このシンプルで再現性のアッセイを使用して、一つは体性幹細胞と同様の特性を示す切除した腫瘍組織からの細胞の無限数を生成することができます。これらの細胞は、細胞間相互作用、および分化、遊走、浸潤および細胞死を含む基本的な癌の細胞生物学を研究するために使用することができる。さらに、孤立した腫瘍幹様細胞はどのように腫瘍の形態、進行、および再発とも勉強し、最終的に治療するために洞察力を提供できる基盤となる派生する細胞メカニズムを解明する貴重なツールを提供オプション。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> タイプ </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> NeuroCult NSC基礎培地（ヒト） </td><td>中</td><td>セル技術を幹</td><td> 05750 </td><td></td></tr><tr><td> NeuroCult NSC増殖サプリメント（人間） </td><td>培地サプリメント</td><td>セル技術を幹</td><td> 05753 </td><td></td></tr><tr><td> ％0.05トリプシン- EDTA </td><td>試薬</td><td> GIBCO </td><td> 25300-062 </td><td></td></tr><tr><td> * MEM </td><td>試薬</td><td> GIBCO </td><td> 41500-018 </td><td> HEMのコンポーネント</td></tr><tr><td> * HEPES </td><td>試薬</td><td>シグマ</td><td> H4034 </td><td> HEMのコンポーネント</td></tr><tr><td> *蒸留水</td><td>試薬</td><td&gt;ギブコ</td><td> 15230-147 </td><td></td></tr><tr><td> ** DNase Iを</td><td>試薬</td><td>ロッシュ</td><td> 104159 </td><td></td></tr><tr><td> **大豆トリプシンインヒビター</td><td>試薬</td><td>シグマ</td><td> T6522 </td><td></td></tr><tr><td>ペン/連鎖球菌</td><td>試薬</td><td> GIBCO </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> 10番メスの刃</td><td>手術道具</td><td> BD </td><td> 371610 </td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>文化ウェア</td><td> BDファルコン</td><td> 353003 </td><td></td></tr><tr><td>小鉗子</td><td>手術器具</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11050〜10 </td><td></td></tr><tr><td>セルストレーナー</td><td>ふるい</td><td> BDファルコン</td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> T25フラスコ</td><td>文化ウェア</td><td> NalgeニュースキンNC国際</td><td> 136196 </td><td></td></tr><tr><td> T80フラスコ</td><td>文化ウェア</td><td> Nalge Nunc社国際</td><td> 178905 </td><td></td></tr><tr><td> 15 mlチューブ</td><td>文化ウェア</td><td> BDファルコン</td><td> 352096 </td><td></td></tr><tr><td> 50mlチューブ</td><td>文化ウェア</td><td> BDファルコン</td><td> 352070 </td><td></td></tr><tr><td> EGF </td><td>成長因子</td><td> R＆D </td><td> 2028 - EG </td><td></td></tr><tr><td> B - FGF </td><td>成長因子</td><td> R＆D </td><td> 3139 - FB </td><td></td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td>成長因子</td><td>シグマ</td><td> H4784 </td><td> PBSで再構成</td></tr></tbody></table> * HEMを行うには、1M HEPESのMEM and160mlの1x10Lパケットを混在させると蒸留水を用いて8.75 Lにボリュームをもたらす。 7.4に最終的なPHを設定するD 4℃で保管してください **トリプシンインヒビター溶液を調製するには、まずDNase I溶液（100mgのDNaseがHEMの100mlに溶解）の10mlを確認してから、DNase溶液にトリプシンインヒビターの0.14 gを追加し、最終的にHEMを使用して1リットルにボリュームを構成する。 -20℃の冷凍庫で最終製品のアリコートをしてください。

ニューロスフェアのアッセイを用いたヒト多形性膠芽腫の腫瘍細胞の単離と拡大

Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay

幹様細胞は、乳がん、肺がん、大腸、前立腺、脳などの腫瘍に分離されている。すべてのこれらの腫瘍の重要な問題は、特に神経膠芽腫のmutliforme（GBM）で、腫瘍形成、進行、および再発における役割を調べるために腫瘍開始細胞集団を同定し、分離することです。細胞集団を開始する腫瘍を理解することはこれらの腫瘍に対する効果的な治療法を見つけるための手がかりを提供します。そのシンプルさと再現性に起因するロスフェアアッセイ（NSA）は、この腫瘍細胞の多くの単離および増殖のための選択の方法として使用されています。このプロトコルは、外科的に切除したヒトGBMの腫瘍組織に幹細胞様細胞を分離して展開するニューロスフェア培養法を示しています。手順は、初期の化学的消化と腫瘍組織の機械的解離、およびその後NSAの文化の中で、その結果、単一の細胞懸濁液をめっきなどがあります。 7〜10日後に、150から2の一次ニューロスフェア直径00μmのが観察され、さらに継代と拡大のための準備が整いましたことができます。

このビデオプロトコルは、ニューロスフェアアッセイ培養法を用いて外科的に切除したヒト神経膠芽腫mutliforme（GBM）の腫瘍組織からの細胞のような分離と茎の拡大を示しています。

乳がん、肺がん、結腸がん、前立腺がん、および脳腫瘍などの腫瘍において、幹細胞様細胞が単離されている。これらすべての腫瘍、特に……における極めて重要な課題は、

このプロトコルの目的は、ニューロスフィア法を用いてヒト膠芽腫（glioblastoma multiform）腫瘍細胞を単離および拡大培養することです。まず、採取した腫瘍組織を細切し、続いて機械的に解離させ、最終的に得られた細胞をニューロスフィア培養で増殖させるために播種することでこれを達成します。このビデオでは、ニューロスフィア培養法を用いて、ヒト膠芽腫腫瘍組織から幹細胞様細胞を単離および拡大培養する方法を解説します。この手法は、他の脳腫瘍に加え、乳癌、前立腺癌、肝癌、肺癌などの固形腫瘍からの細胞培養にも利用可能です。それでは、手順を開始します。手術により切除されたGBM腫瘍組織を受領した後、培地を除去します。血液や破片などの不純物を除去するため、腫瘍を滅菌PBSで2〜3回洗浄します。洗浄後、切除した腫瘍を滅菌シャーレに移します。まず腫瘍を小さく切り分け、次に腫瘍組織の一部を別のシャーレに移し、10番メスを用いて組織を微細に刻みます。これにより、酵素による解離に利用可能な表面積が増加します。微細化（ミンシング）にかかる時間は、腫瘍の大きさによって1～3分です。次に、微細化した組織に予熱したtrypsinを3～5 ml加え、15 mlの滅菌ファルコンチューブに移します。15 mlチューブを37 °Cのウォーターバスに10〜15分間置きます。5分ごとにチューブを振ってください。組織の消化状態を良好に保つため、等量のトリプシンインヒビターを加えて反応を停止させます。ピペッティングを数回繰り返すことで、トリプシンの活性化を確実に行います。懸濁液を800 RRP Mまたは110 Gで5分間遠心分離します。上清を除去し、チップをチューブの底に当てながら、ペレットを1 mlの神経幹細胞基礎培地で再懸濁します。凝集塊を分散させ、乳状の懸濁液にするまでピペッティングを3～7回行います。過度なピペッティングは細胞死を招く可能性があるため注意してください。50 mlチューブに40 micronフィルターを設置します。次に、細胞懸濁液に10～15 mlの基礎培地を加え、穏やかに混合します。その後、細胞懸濁液を40 micronフィルターに通し、デブリや未分散の凝集塊を除去します。細胞を遠心分離し、上清を吸引除去します。細胞を1～2 mLの完全培地で再懸濁します。その後、ピぺッティングを静かに行い、懸濁液を均質化します。10 µLの細胞懸濁液を90 µLのトリパンブルーと混合します。懸濁液を十分に混ぜ合わせ、10 µLをヘモサイトメーターに分注します。ここで示す手順に従って細胞計数を行います。正確な細胞数を算出するためには、凝集のない単一細胞懸濁液が必要です。トリパンブルー陽性細胞は含めないでください。T 80フラスコに細胞を播種するためのカウントを行う際の手順です。50 mlチューブに完全神経幹細胞培地を20 ml加えます。細胞懸濁液を適量加え、密度が200, 000 cells/mlになるように調整します。次に、最終濃度が20 ng/mlとなるようにEGFを加えます。0.2%ヘパリンを1 µL/mLの濃度で添加します。最後に、BFGFを最終濃度が10 ng/mLになるように添加します。成長因子を添加した完全培地中で細胞を混合します。次に、懸濁液をT80フラスコに移します。その後、フラスコを37°C、5%CO2のインキュベーターに入れ、7〜10日間培養します。培養8日後には、スフィアが十分に成長し、継代可能な状態になります。フラスコの内容物を回収し、50 ml遠心チューブに移します。細胞を800 RPMで5分間遠心分離します。上清を吸引して除去し、ペレットを1 mlの予熱済みトリプシンで再懸濁します。細胞を37 °Cのウォーターバスで2分間インキュベートします。同量のトリプシンインヒビターを加え、十分に混合して不活化させます。その後、細胞をペレット化します。上清を除去し、細胞を1 mlの完全培地で再懸濁させ、ピペッティングで穏やかに混ぜて細胞懸濁液を均一にする。前述の手順に従って細胞数を計測し、50 mlチューブ内で20 mlの完全培地を用い、T 80フラスコに播種する。細胞密度が50,000 cells/mlになるように、適切な量の細胞懸濁液を加える。次に、EGF、bFGFを含む成長因子と、前述の濃度のヘパリンを加えます。得られた細胞懸濁液を静かに混合し、T80フラスコに移してインキュベーター内で7〜10日間培養します。以下は、原代GBM培養の例です。この段階で4日間経過すると、細胞が増殖し、スフィアを形成し始めていることが確認できます。この段階で細胞の大きな球状クラスターが観察されるべきではありません。もし観察される場合は、組織調製が不適切であったことが原因と考えられます。7〜10日間培養すると、さまざまなサイズのスフィアが形成されます。スフィアの平均直径が150〜200 µmに達すると、継代が可能です。これは、8日後に継代したGBM培養の例です。ここでも、さまざまなサイズのスフィアが確認でき、健康なスフィアの周囲には微小な突起（マイクロスパイク）が見られます。単一細胞懸濁液の調製は、あらゆるスフィア培養において非常に重要な工程です。適切に行われない場合、細胞播種後の翌日であっても細胞凝集塊が観察されることがあります。これらの凝集塊をスフィアと見なしてしまう可能性がありますが、播種した細胞が真のスフィアを形成するには、少なくとも1週間かかることに留意する必要があります。原発腫瘍のスフィア培養におけるデブリの量は、組織の採取源、組織の切り出し精度、および組織処理の手法など、多くの要因によって異なります。本ビデオが皆様のお役に立ち、実験が成功することを願っております。

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JoVE Journal

Neuroscience

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