ニューロスフェアのアッセイを用いたヒト多形性膠芽腫の腫瘍細胞の単離と拡大

このプロトコルの目的は、ニューロスフィア法を用いてヒト膠芽腫（glioblastoma multiform）腫瘍細胞を単離および拡大培養することです。まず、採取した腫瘍組織を細切し、続いて機械的に解離させ、最終的に得られた細胞をニューロスフィア培養で増殖させるために播種することでこれを達成します。このビデオでは、ニューロスフィア培養法を用いて、ヒト膠芽腫腫瘍組織から幹細胞様細胞を単離および拡大培養する方法を解説します。

この手法は、他の脳腫瘍に加え、乳癌、前立腺癌、肝癌、肺癌などの固形腫瘍からの細胞培養にも利用可能です。それでは、手順を開始します。手術により切除されたGBM腫瘍組織を受領した後、培地を除去します。

血液や破片などの不純物を除去するため、腫瘍を滅菌PBSで2〜3回洗浄します。洗浄後、切除した腫瘍を滅菌シャーレに移します。まず腫瘍を小さく切り分け、次に腫瘍組織の一部を別のシャーレに移し、10番メスを用いて組織を微細に刻みます。

これにより、酵素による解離に利用可能な表面積が増加します。微細化（ミンシング）にかかる時間は、腫瘍の大きさによって1～3分です。次に、微細化した組織に予熱したtrypsinを3～5 ml加え、15 mlの滅菌ファルコンチューブに移します。

15 mlチューブを37 °Cのウォーターバスに10〜15分間置きます。5分ごとにチューブを振ってください。組織の消化状態を良好に保つため、等量のトリプシンインヒビターを加えて反応を停止させます。

ピペッティングを数回繰り返すことで、トリプシンの活性化を確実に行います。懸濁液を800 RRP Mまたは110 Gで5分間遠心分離します。上清を除去し、チップをチューブの底に当てながら、ペレットを1 mlの神経幹細胞基礎培地で再懸濁します。

凝集塊を分散させ、乳状の懸濁液にするまでピペッティングを3～7回行います。過度なピペッティングは細胞死を招く可能性があるため注意してください。50 mlチューブに40 micronフィルターを設置します。次に、細胞懸濁液に10～15 mlの基礎培地を加え、穏やかに混合します。その後、細胞懸濁液を40 micronフィルターに通し、デブリや未分散の凝集塊を除去します。

細胞を遠心分離し、上清を吸引除去します。細胞を1～2 mLの完全培地で再懸濁します。その後、ピぺッティングを静かに行い、懸濁液を均質化します。

10 µLの細胞懸濁液を90 µLのトリパンブルーと混合します。懸濁液を十分に混ぜ合わせ、10 µLをヘモサイトメーターに分注します。ここで示す手順に従って細胞計数を行います。

正確な細胞数を算出するためには、凝集のない単一細胞懸濁液が必要です。トリパンブルー陽性細胞は含めないでください。T 80フラスコに細胞を播種するためのカウントを行う際の手順です。

50 mlチューブに完全神経幹細胞培地を20 ml加えます。細胞懸濁液を適量加え、密度が200, 000 cells/mlになるように調整します。次に、最終濃度が20 ng/mlとなるようにEGFを加えます。

0.2%ヘパリンを1 µL/mLの濃度で添加します。最後に、BFGFを最終濃度が10 ng/mLになるように添加します。成長因子を添加した完全培地中で細胞を混合します。

次に、懸濁液をT80フラスコに移します。その後、フラスコを37°C、5%CO2のインキュベーターに入れ、7〜10日間培養します。培養8日後には、スフィアが十分に成長し、継代可能な状態になります。

フラスコの内容物を回収し、50 ml遠心チューブに移します。細胞を800 RPMで5分間遠心分離します。上清を吸引して除去し、ペレットを1 mlの予熱済みトリプシンで再懸濁します。

細胞を37 °Cのウォーターバスで2分間インキュベートします。同量のトリプシンインヒビターを加え、十分に混合して不活化させます。その後、細胞をペレット化します。

上清を除去し、細胞を1 mlの完全培地で再懸濁させ、ピペッティングで穏やかに混ぜて細胞懸濁液を均一にする。前述の手順に従って細胞数を計測し、50 mlチューブ内で20 mlの完全培地を用い、T 80フラスコに播種する。細胞密度が50,000 cells/mlになるように、適切な量の細胞懸濁液を加える。

次に、EGF、bFGFを含む成長因子と、前述の濃度のヘパリンを加えます。得られた細胞懸濁液を静かに混合し、T80フラスコに移してインキュベーター内で7〜10日間培養します。以下は、原代GBM培養の例です。

この段階で4日間経過すると、細胞が増殖し、スフィアを形成し始めていることが確認できます。この段階で細胞の大きな球状クラスターが観察されるべきではありません。もし観察される場合は、組織調製が不適切であったことが原因と考えられます。

7〜10日間培養すると、さまざまなサイズのスフィアが形成されます。スフィアの平均直径が150〜200 µmに達すると、継代が可能です。これは、8日後に継代したGBM培養の例です。ここでも、さまざまなサイズのスフィアが確認でき、健康なスフィアの周囲には微小な突起（マイクロスパイク）が見られます。

単一細胞懸濁液の調製は、あらゆるスフィア培養において非常に重要な工程です。適切に行われない場合、細胞播種後の翌日であっても細胞凝集塊が観察されることがあります。これらの凝集塊をスフィアと見なしてしまう可能性がありますが、播種した細胞が真のスフィアを形成するには、少なくとも1週間かかることに留意する必要があります。

原発腫瘍のスフィア培養におけるデブリの量は、組織の採取源、組織の切り出し精度、および組織処理の手法など、多くの要因によって異なります。本ビデオが皆様のお役に立ち、実験が成功することを願っております。