Name: CYP2D6の動物モデル：マウスにおける自己免疫性肝炎を誘導する方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: 学ぶ CYP2D6を発現するアデノウイルス感染によりマウス自己免疫性肝炎モデルを構築する方法。免疫組織化学とサイトカイン染色で肝損傷とT細胞応答を評価し、ヒト疾患メカニズムの解明に貢献します。

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この作品は、ゲーテ大学病院、フランクフルトとUCにドイツ研究財団の助成金によってサポートされています

<ol><li>Manns, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+management+of+autoimmune+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and management of autoimmune hepatitis.</a> Hepatology. 51, 2193-2213 (2010).</li>
<li>Czaja, A. J., Manns, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+Diagnosis%2C+Pathogenesis+and+Management+of+Autoimmune+Hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Advances in the Diagnosis, Pathogenesis and Management of Autoimmune Hepatitis.</a> Gastroenterology. 4, 429-443 (2010).</li>
<li>Christen, U., Hintermann, E., Jaeckel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+animal+models+for+autoimmune+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Liver+Dis%22%5BJournal%5D)">New animal models for autoimmune hepatitis.</a> Semin. Liver Dis. 29, 262-272 (2009).</li>
<li>Christen, U., Holdener, M., Hintermann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+autoimmune+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmun.+Rev%22%5BJournal%5D)">Animal models for autoimmune hepatitis.</a> Autoimmun. Rev. 6, 306-311 (2007).</li>
<li>Czaja, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+autoimmune+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev.+Gastroenterol.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Animal models of autoimmune hepatitis.</a> Expert Rev. Gastroenterol. Hepatol. 4, 429-443 (2010).</li>
<li>Holdener, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+tolerance+to+the+natural+human+liver+autoantigen+cytochrome+P450+2D6+by+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Breaking tolerance to the natural human liver autoantigen cytochrome P450 2D6 by virus infection.</a> J. Exp. Med. 205, 1409-1422 (2008).</li>
<li>Manns, M. P., Griffin, K. J., Sullivan, K. F., Johnson, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LKM-1+autoantibodies+recognize+a+short+linear+sequence+in+P450IID6%2C+a+cytochrome+P-450+monooxygenase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">LKM-1 autoantibodies recognize a short linear sequence in P450IID6, a cytochrome P-450 monooxygenase.</a> J. Clin. Invest. 88, 1370-1378 (1991).</li>
<li>Zanger, U. M., Hauri, H. P., Loeper, J., Homberg, J. C., Meyer, U. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+against+human+cytochrome+P-450db1+in+autoimmune+hepatitis+type+II%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Antibodies against human cytochrome P-450db1 in autoimmune hepatitis type II.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85, 8256-8260 (1988).</li>
<li>von Herrath, M. G., Fujinami, R. S., Whitton, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microorganisms+and+autoimmunity%3A+making+the+barren+field+fertile%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microorganisms and autoimmunity: making the barren field fertile.</a> Nat. Rev. Microbiol. 1, 151-157 (2003).</li>
<li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retro-orbital+injections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Anim.+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab. Anim. (NY). 40, 155-160 (2011).</li>
<li>Forbes, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morbidity+and+mortality+rates+associated+with+serial+bleeding+from+the+superficial+temporal+vein+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Anim.+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Morbidity and mortality rates associated with serial bleeding from the superficial temporal vein in mice.</a> Lab. Anim. (NY). 39, 236-240 (2010).</li>
<li>Ehser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mimicry+rather+than+identity+beaks+T+cell+tolerance+in+the+CYP2D6+mouse+model+for+human+autoimmune+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Molecular mimicry rather than identity beaks T cell tolerance in the CYP2D6 mouse model for human autoimmune hepatitis.</a> , Forthcoming (2011).</li>
<li>Hintermann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope+spreading+of+the+anti-CYP2D6+antibody+response+in+patients+with+autoimmune+hepatitis+and+in+the+CYP2D6+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">Epitope spreading of the anti-CYP2D6 antibody response in patients with autoimmune hepatitis and in the CYP2D6 mouse model.</a> J. Autoimmun. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Ando, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Class+I-restricted+cytotoxic+T+lymphocytes+are+directly+cytopathic+for+their+target+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Class I-restricted cytotoxic T lymphocytes are directly cytopathic for their target cells in vivo.</a> J. Immunol. 152, 3245-3253 (1994).</li>
<li>Zierden, M., Kuhnen, E., Odenthal, M., Dienes, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+and+regulation+of+autoreactive+CD8%2B+T+cells+in+a+transgenic+mouse+model+of+autoimmune+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Effects and regulation of autoreactive CD8+ T cells in a transgenic mouse model of autoimmune hepatitis.</a> Gastroenterology. 139, 975-986 (2010).</li>
<li>Limmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failure+to+induce+organ-specific+autoimmunity+by+breaking+of+tolerance%3A+importance+of+the+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Failure to induce organ-specific autoimmunity by breaking of tolerance: importance of the microenvironment.</a> Eur. J. Immunol. 28, 2395-2406 (1998).</li>
<li>Voehringer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Break+of+T+cell+ignorance+to+a+viral+antigen+in+the+liver+induces+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Break of T cell ignorance to a viral antigen in the liver induces hepatitis.</a> J. Immunol. 165, 2415-2422 (2000).</li>
<li>Derkow, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+priming+of+CD8+and+CD4+T-cells+in+animal+models+of+autoimmune+hepatitis+and+cholangitis%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Differential priming of CD8 and CD4 T-cells in animal models of autoimmune hepatitis and cholangitis.</a> Hepatology. 46, 1155-1165 (2007).</li>
<li>Lapierre, P., Djilali-Saiah, I., Vitozzi, S., Alvarez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+type+2+autoimmune+hepatitis%3A+Xenoimmunization+with+human+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">A murine model of type 2 autoimmune hepatitis: Xenoimmunization with human antigens.</a> Hepatology. 39, 1066-1074 (2004).</li>
<li>Djilali-Saiah, I., Lapierre, P., Vittozi, S., Alvarez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+vaccination+breaks+tolerance+for+a+neo-self+antigen+in+liver%3A+a+transgenic+murine+model+of+autoimmune+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">DNA vaccination breaks tolerance for a neo-self antigen in liver: a transgenic murine model of autoimmune hepatitis.</a> J. Immunol. 169, 4889-4896 (2002).</li>
<li>Christen, U., Hintermann, E., Holdener, M., von Herrath, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+triggers+for+autoimmunity%3A+is+the+%27glass+of+molecular+mimicry%27+half+full+or+half+empty%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">Viral triggers for autoimmunity: is the 'glass of molecular mimicry' half full or half empty.</a> J. Autoimmun. 34, 38-44 (2010).</li>
<li>Krebs, P., Scandella, E., Odermatt, B., Ludewig, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+functional+exhaustion+and+deletion+of+CTL+following+immunization+with+recombinant+adenovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Rapid functional exhaustion and deletion of CTL following immunization with recombinant adenovirus.</a> J. Immunol. 174, 4559-4566 (2005).</li>
<li>Hintermann, E., Bayer, M., Pfeilschifter, J., Christen, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral+delivery+of+the+liver+autoantigen+cytochrome+P450+2D6+chronically+activates+hepatic+stellate+cells+and+induces+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Manuscript+Submitted%22%5BJournal%5D)">Adenoviral delivery of the liver autoantigen cytochrome P450 2D6 chronically activates hepatic stellate cells and induces fibrosis.</a> Manuscript Submitted. , (2011).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

以前の研究では、実験的肝炎はしばしば自己免疫性肝疾患のための唯一の過渡的な現在の多くのモデルがかなり複雑な疾患の誘導プロトコル（レビューのための3,5を参照）に依存すると報告されている。たとえば、いくつかのモデルは、特定の標的抗原を発現するトランスジェニックマウスを使用して、養子標的抗原特異的な、主にTCR-トランスジェニックT細胞14,15を移した。しばしばlivertropicウイルス、細菌や寄生虫を持つ追加の感染は病気16-18誘導する必要があります。また、CYP2D6 19を含む標的抗原、をコードするプラスミドを用いたDNAワクチン接種は、肝炎を誘導するために使用されています。しかし、このようなIL-12などの炎症性サイトカイン、をコードするプラスミドを持つ追加のワクチン接種は20が必要です。残念なことに、少数の例外を除いて15,20 A型肝炎は一過性である。 CYP2D6モデル6,21は、簡単な方法tを使用する単にhCYP2D6、AIH-2 7,8の主要な自己抗原を発現するアデノウイルスをマウスに感染させることによって自己免疫性肝炎を誘発O。アデノウイルスの構築により、CYP2D6の配信は、肝臓の直接の標的としてだけでなく、寛容の破壊を促進する局所の炎症の両方を保証します。ウイルス力価と同様に、投与経路の両方がこのモデルに不可欠であることにも注意することが重要です。一方では、Ad-2D6は、複製欠損ウイルスであり、したがって、ウイルスの十分な高力価は、肝臓内の抗原の重要な量を生成する必要があります。一方、高すぎると力価は、致命的な急性肝不全になる可能性があります。加えて、アデノウイルスの高力価によるマウスの感染は、免疫応答22の機能的な枯渇につながることを以前に実証されている。我々のモデルでは、両方の慢性的な細胞浸潤と同様に内線を得るために静脈内および腹腔内感染症の組み合わせを使用ensive線維症。我々は、単独で静脈内感染症は依然として大​​規模な細胞浸潤を引き起こすが、腹腔内注射によるその腹膜の炎症を示す被膜下領域のない線維は、コラーゲンの連続被膜蓄積（Hintermann＆クリステン、投稿準備中）に関与していない可能性があることを観察した。しかし、我々は、AD-GFPまたはAd-コントロール23の等しいウイルス力価と感染後の肝星細胞とコラーゲン沈着の活性化を検出しませんでしたので、観測された肝線維症は、抗原特異的であることに注意することが重要です。 CYP2D6モデルは、永続的な細胞浸潤と肝線維症6によって特徴付けられる慢性肝炎などの人間AIH 1,2の多くの側面を反映しています。さらに、AIH-2患者に見られる類似のエピトープ特異性を有する高力価の抗CYP2D6抗体の存在と拡散13〜LKM-1抗体は、事前に示します。一般的な慢性の自己免疫反応性上述の意味。 CYP2D6はAIH-2の主要抗原であるが、それはより頻繁に、1型AIHと診断された患者では認識されません。さらに、そのような原発性胆汁性肝硬変（PBC）や原発性硬化性胆管炎（PSC）などの自己免疫病因を持つ他の肝疾患、患っている患者では、特徴的な抗体を生成異なる肝抗原とその肝臓に特異的に小を中心とした別の病理学的特徴（PBCを表示場合）または大（PSC）胆管。それにもかかわらず、CYP2D6のモデルは、肝細胞の自己免疫破壊を促進し、病気を治すために可能な治療介入を評価するためのキープレーヤーを識別するために、自己免疫性肝疾患時に発生するとして慢性肝炎症プロセスに関与immunopathogenicメカニズムを分析する機会を提供しています。

<table border="1"><tbody><tr><td> 機器の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> 23G針</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 300800 </td><td></td></tr><tr><td> 27½G針</td><td> VWR </td><td> 612-0151 </td><td></td></tr><tr><td> 30½G針</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 304000 </td><td></td></tr><tr><td>アラニンアミノトランスフェラーゼテストストリップ（GPT / ALT） </td><td>ロシュ·ダイアグノスティックス</td><td> 10 745 138 202 </td><td></td></tr><tr><td>アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼテストストリップ（GOT / AST） </td><td>ロシュ·ダイアグノスティックス</td><td> 10 745 120 202 </td><td></td></tr><tr><td>麻酔ユニットUniventor 400 </td><td> <a href="http://www.agnthos.se" target="_blank" >AgnThoの</a> </td><td></td><td></td></tr><tr><td>ベース型、使い捨て37x24x10さmm </td><td> VWR </td><td> 720-0208 </td><td></td></tr><tr><td>セルストレーナー70ミリメートル</td><td> VWR </td><td> 734-0003 </td><td></td></tr><tr><td>クライオスタット</td><td>ライカ</td><td> CM1850 UV </td><td></td></tr><tr><td>ヘパリン毛細管</td><td>フィッシャー</td><td> 3123987 </td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡はSuperfrost Plusをスライド</td><td>メンツェルグレイザー</td><td> J1800AMN​​Z </td><td></td></tr><tr><td> Microtainer SSTチューブ</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 365951 </td><td></td></tr><tr><td>マイクロタイタープレート、V底</td><td> VWR </td><td> 391-1924 </td><td></td></tr><tr><td> Reflotronプラス</td><td>ロシュ·ダイアグノスティックス</td><td></td><td>血清AST / ALTのDeterminiation </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td> 名前OF試薬</td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>ウサギ抗マウス抗コラーゲンI型IgG抗体、 </td><td>ケミコン</td><td> AB765P </td><td></td></tr><tr><td>ビオチン化ヤギ抗ウサギIgG </td><td>ベクトル（AXXORA） </td><td> VC-BA-1000-MC15 </td><td></td></tr><tr><td> FITC結合抗マウスCD8a抗体</td><td>サザンバイオテクノロジー</td><td> 1550年から1502年</td><td></td></tr><tr><td> PE標識抗マウスIFNγ抗体</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 554412 </td><td></td></tr><tr><td> PE標識抗マウスCD16/CD32抗体（FCRブロック） </td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 553141 </td><td></td></tr><tr><td> Aquatex </td><td> VWR </td><td> 1.08562.0050 </td><td></td></tr><tr><td>アビジン/ビオチンブロッキングキット</td><td&gt;ベクトル（AXXORA） </td><td> VC-SP-2001-KI01 </td><td></td></tr><tr><td>ブレフェルジン</td><td>シグマ</td><td> B6542 </td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼIV </td><td>シグマ</td><td> C5138-100MG </td><td></td></tr><tr><td> DAB基質キット3&#39;3&#39;diaminobenzidine </td><td>ベクトル（AXXORA） </td><td> VC-SK-4100-KI01 </td><td></td></tr><tr><td>デオキシリボヌクレアーゼ</td><td>シグマ</td><td> DN-25 </td><td></td></tr><tr><td>エリートABC試薬</td><td>ベクトル（AXXORA） </td><td> VC-PK-7100-L050 </td><td></td></tr><tr><td>エオシンG / Yソリューション</td><td>ロート</td><td> X883.1 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清（FCS） </td><td> Biochrom AG </td><td> S 0115 </td><td></td></tr><tr><td> Isofluran </td><td> Forene </td><td> B506 </td><td></td></tr><tr><td>マイヤーのヘマトキシリン​​液</td><td> AppliChem </td><td> A4840、1000 </td><td></td></tr><tr><td> OCTコンパウンド</td><td>サクラファインテックヨーロッパ</td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> PBS - 緩衝ホルムアルデヒド10パーセント</td><td>ロート</td><td> A146.3 </td><td></td></tr><tr><td>パーコール</td><td>アマシャム</td><td> 17-0891-01 </td><td></td></tr><tr><td>ロティ·Histokit </td><td>ロート</td><td> 6638.1 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td>インビトロジェン</td><td> 61870 </td><td></td></tr><tr><td>キラヤの樹皮からサポニン</td><td>シグマ</td><td> S7900 </td><td></td></tr></tbody></table>

cyp2d6の動物モデル：マウスにおける自己免疫性肝炎を誘導する方法

The CYP2D6 Animal Model: How to Induce Autoimmune Hepatitis in Mice

自己免疫性肝炎はまれですが、生活は未知の病因1,2の肝臓の自己免疫疾患を脅かしている。過去の多くの試みで、ヒトの疾患3-5の特性を反映した動物モデルを生成するためになされてきた。しかし、様々なモデルでは、疾患の誘導はかなり複雑であり、多くの場合肝炎は3-5のみ一過性であった。したがって、我々は、トリガー6として、すなわち、2型自己免疫性肝炎（AIH-2）、hCYP2D6の主要な人間の自己抗原を使用して簡単なマウスモデルを開発しました。 hCYP2D6を認識し1型肝腎ミクロソーム抗体（LKM-1）抗体はAIH-2の7,8の特徴である。野生型FVBまたはC57BL / 6マウスにhCYP2D6の配信は、肝臓へのトリガ抗原の直接配信を保証するアデノウイルスコンストラクト（AD-2D6）であった。したがって、その後の地元の炎症は自己免疫のその後の開発のための肥沃なフィールド9を生成します 。 ℃広告-2D6の静脈内および腹腔内注射のombinationは、肝臓（セクション1）長期的な自己免疫損傷を誘発するための最も効果的なルートです。ここでは、CYP2D6モデルに誘導される方法と、肝臓の損傷の様々な側面を評価することができているか自己免疫性肝疾患に関する詳細なプロトコルを提供しています。最初に、このようなアミノトランスフェラーゼと同様に、hCYP2D6抗体価として肝細胞の破壊を示すマーカーの血清レベルは、サンプリング血液retroorbitaly（セクション2）で決定されます。第二に、hCYP2D6特異的T細胞応答は、脾臓と肝臓からリンパ球を集めることを特徴としている。純粋な肝リンパ球を得るために、肝臓をコラーゲンで消化し、Percoll勾配（セクション4）で精製し、門脈（セクション3）を介して、PBSで灌流されています。 hCYP2D6特異的T細胞の頻度はhCYP2D6ペプチドおよびフローサイトメトリーによるIFNγ産生細胞（セクション5）の識別による刺激によって分析されます。第三に、細胞浸潤と線維症は、肝臓切片の免疫組織化学（セクション6）によって決定されます。このような分析療法は、モデルの慢性的な性質を証明するために、疾患の開始後数回で実施する必要があります。周波数とアクティビティhCYP2D6特異的Tおよび/またはB細胞の肝障害と線維化の程度によって特徴付け免疫応答の大きさは、防止または遅延a​​utodestructiveを廃止するために可能な治療のその後の評価のために評価する必要があります肝臓のプロセス。

主要な人間の自己抗原を発現するアデノウイルスによるマウスの感染は、CYP2D6の広範な肝炎、線維化と世代を特徴とする自己免疫介在性肝疾患の永続的な形式で、2型自己免疫性肝炎の結果を患っている患者の血清によって認識されるP450 2D6（hCYP2D6）のシトクロム特異的免疫応答。

CYP2D6の動物モデル：マウスにおける自己免疫性肝炎を誘導する方法

自己免疫性肝炎は、病因不明の稀ながら生命を脅かす肝臓の自己免疫疾患である1,2。これまで、多くの試みがなされてきた...

以下の一連の実験の目的は、自己免疫性肝炎のマウスモデルを作製し、検証することである。自己免疫性肝炎は、肝界面の慢性炎症、肝炎、ハイパーガンマグロブリン血症、および特徴的な自己抗体の産生を特徴とするヒトの自己免疫性肝疾患である。まず、肝臓内に局所的な炎症を誘導するため、疾患の原因となる自己抗原CYP 2D6を発現するアデノウイルス構築物を動物に感染させる。次に、肝灌流と密度勾配遠心法を用いて肝リンパ球を分離する。最終的に、免疫組織化学染色および細胞内サイトカイン染色により、それぞれ肝損傷と自己抗原特異的T細胞の同定を評価することができる。既存の手法に対する本手法の主な利点は、我々の自己免疫性肝炎モデルが、2型自己免疫性肝炎を患うヒトで観察されるものとほぼ同一の、慢性的な肝炎症および自己抗原特異的な免疫応答によって特徴付けられている点にあります。我々のモデルは、自己免疫性肝炎患者において肝臓の進行性破壊がどのように進行するかなど、自己免疫性肝疾患分野における重要な疑問への回答に寄与することが可能です。一般的に、従来の手法では、静脈内感染や眼静脈洞を介した採血、および肝灌流の実施に苦労しますが、本手法では習熟すれば十分に遂行可能です。麻酔後、マウスの項部を保持し、親指と中指で頭部の緩んだ皮膚を締め付けます。この状態で、目の adjacent な皮膚の牽引により、眼球がわずかに突出することに注意してください。次に、動物の鼻に最も近い眼瞼の接合部である内眼角に針を刺し、80 2D six ウイルス溶液 100 µL をゆっくりと注入します。その後、針をわずかに引き抜き、眼瞼を閉じます。まず、5 mLのシリンジに冷PBSを満たし、27Gの針をシリンジに取り付けます。マウスを安楽死させた後、ハサミを用いて、動物の後肢から約1 cm離れた部位の皮膚および筋肉層を切開し、動物の両側から横隔膜に向かって切開します。横隔膜に達したら、皮膚を後方に牽引し、鋏で横隔膜を肋骨から切り離し、大静脈を解剖します。この解剖段階で、胃と腸を脇によけて門脈を露出させます。肝臓の灌流は、特に肝臓が慢性炎症を起こしていたり、線維化していたりする場合、本手順の中で最も困難な工程です。マウスは非常に小さいため、門脈を正確に穿刺するには安定した手技が必要です。さらに、PBSはゆっくりと注入することが重要です。そうしないと、組織が損傷する可能性があります。あらかじめ準備した針を門脈に挿入し、シリンジのプランジャーをゆっくりと押し、PBSで肝臓内の血液を徐々に洗い流します。灌流が完了したら、ピンセットで横隔膜を掴み、ハサミで横隔膜を体から切り離して肝臓を取り出します。最後に、臓器をペトリ皿に移し、横隔膜、胆嚢、および肝臓にまだ接続しているその他の組織を除去します。自己免疫性肝炎の動物の肝臓は線維化しており、個々の葉が癒合していることに注意してください。まず、ペトリ皿に10 millilitersの新鮮なPPSを満たし、氷上に置くことから始めてください。灌流後の肝臓をディッシュに移し、ハサミを用いて組織を小さく切り刻みます。次に、組織とPBSを70 µmのセルストレーナーに注ぎ、ガラス製ペストルを使用して肝組織をストレーナーに通します。その後、組織片の上に冷えたコラゲナーゼ緩衝液10 mLを慎重に注ぎ、必要に応じて引き続きペストルで押し潰します。細胞を4°Cで30×gで3分間遠心分離します。ペレットの上に5mmの液量を取り残し、上澄みを新しいチューブに移します。さらに4°Cで650×gで10分間遠心分離します。上澄みの最後の3mmを除いて、すべて廃棄します。ペレットを20 millilitersのper call bufferに再懸濁し、4 °Cで600 ×g、20分間遠心分離した後、上清を捨て、チューブを弾くようにしてペレットを再懸濁します。野生型マウスのCYP 2D6モデルにおいて、adenovirus 2D6感染後に持続性自己免疫性肝炎が発症しています。右図に見られるように、肝臓は明らかに形態が変化しています。特に、黒い矢じりで示されるように肝葉が融合しており、黒い矢印で示される過剰食細胞結節が肝全体に散在し、対照群の感染と比較して大規模な被膜線維化が認められます。ヒトCYP 2D6を発現しないアデノウイルスは、左側の図に示されているように、肝臓の形態に影響を与えません。アデノウイルス2D6を感染させたマウスの肝臓では、アデノウイルスコントロールを感染させたマウスとは異なり、門脈周囲および実質領域に広範かつ持続的な細胞浸潤が認められます。単一の黒い矢印で示されているように、アデノウイルス2D6感染マウスにのみ見られる単核細胞の有意な浸潤に注目してください。3本の矢印は、隣接する門脈域を橋渡しするように肝実質に浸潤したより大規模な細胞浸潤を示しています。この図では、線維化が主に被膜下領域で進行し、一部のコラーゲン束が実質へと突出している様子が観察できます。3本の黒い矢印で示される肝被膜下の多層的なコラーゲンの配置と、単一の矢印で示される実質へ突出するいくつかの束、および黒い矢印頭で示される浸潤細胞の大きなクラスターの存在に注目してください。アデノウイルス2D6感染マウスにおける持続性自己免疫性肝炎の3つ目の特徴は、肝臓にホーミングするヒトCYP2D6特異的なCD4およびCD8 T細胞が優先的に生成されることです。これらの代表的な細胞内サイトカイン染色のドットプロットに示されるように、肝リンパ球を免疫優位なCD4またはCD8ヒトCYP2D6ペプチドで一晩刺激すると、それぞれCD4陽性またはCD8陽性のT細胞特異的なインターフェロンγ発現が誘導されます。この手順を行う際は、末梢血単核球による肝リンパ球の混入を避けるため、肝臓の最適な灌流が極めて重要なステップであることを忘れないでください。本手順に続き、一次肝星細胞の単離などの他の手法を行うことで、T細胞分化後の活性化状態や遊走能を解析することが可能です。この動物モデルは、自己免疫性肝疾患分野の研究者が、肝臓の慢性炎症を促進する主要因を探索し、患者に対する潜在的な治療法を評価するための道を開くものと期待されます。

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