Name: シンプルで堅牢なと in vitroでアプローチ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: 学ぶウイルス組み立て法。Agrobacteriumを用いた植物細胞への遺伝子導入とBMVのin vivo・in vitro組み立て、光学ゴースト形成によるバイオ医薬品応用を解説します。

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著者らは、agroinfiltrationの開発およびin vitroアセンブリアッセイにおけるそれらの貴重な提案のための研究室のいくつかのメンバーに感謝したいと思います。この作品は、カリフォルニア大学からの助成金によって賄われていた。本研究では、国立科学財団（CBET-1144237）からの助成金によって部分でサポートされていました。

1。植物性の素材<ol><li>キャプシドアッセイで使用されるタバコベンサミ植物は、4葉期（約3-4週齢の植物）であるべきである。 </li></ol> 2。 agroinfiltrationによる植物細胞への機能的なウイルスゲノムのコンポーネントの配信と表現<ol><li> 1日目：アグロバクテリウム株（例えば、EH 105またはGV 3101）pCass-BMV RNA 1、BMV RNA 2とBMV RNA 3 1,2を保有する 50のカナマイシンmg / mlのを補ったLB寒天プレート上で増殖されている（ために選択します。 pCASSベクトル）とリファンピシンの100mg/ml（）は、アグロバクテリウムのために選択します。インキュベーションは、二日間28℃で実施されています。 </li><li> 3日目：カナマイシン50 mg / mlおよび28℃で1日リファンピシン100 mg / mlの250℃RPMに設定オービタルシェーカーでCを含有するLB培地2 mlのLB寒天プレートから単一コロニーを接種。 </li><li> 4日目：LBブロスサプリメントの50ミリリットルを接種カナマイシン50 mg / mlおよびリファンピシン、10mMのMES pHは5.6と28で16時間の三角フラスコ250mlの文化の1ミリリットル〜250 RPMでオービタルシェーカー上でCと100mMのアセトシリンゴンの100 mg / mlのとED 。 </li><li> 5日目：4℃で5000rpmで10分間オークリッジ管または滅菌ファルコンチューブと遠心分離機に（OD 600が 1.0に達したとき）文化を転送</li><li>このステップの抗生物質の完全な除去を確実にする1つのより多くの時間を繰り返して、4℃で5000rpmで10分間、10mMのMgCl 2、遠心10mlにペレットを溶解する。 </li><li> 10mMのMgCl 2および10mM MES（pHは5.6）を含む10 mlのバッファーでペレットを一時停止します。 </li><li> BMV RNA 1、2、RNA RNA 3の各カルチャのOD 600を測定し、10mMのMgCl 2と10mMのMESを液（pH 5.6）を使用して、0.1 OD 600に調整します。 </li><li>各3つのすべての0.1 OD 600の培養懸濁液1ミリリットルを混ぜる。 </li><li>アセトシリンゴン、ミックスゲント100mMのを追加します。LY、3時間室温で混合物が邪魔されずに保持します。 </li><li> 1mlに培養懸濁液を描画します。針なしの注射器。 </li><li> N. 2-3よく展開葉の背軸側に上記培養懸濁液を浸透させるそっと葉の背軸面の半分に注射器を押すことによって、 ベンサミ （5葉期、3から4週齢の植物）。 </li><li>他の葉に浸潤この手順を繰り返します。 </li><li> 24℃で緑色の家に浸透植物を保つ</li><li>浸透の収穫は3から4日後の浸潤を（dpi）のままになります。 </li></ol> 3。 BMVビリオンの精製<ol><li> Nを収集するベンサミはすべての 3つの野生型BMVのagrotransformantsを含む混合物でagroinfiltrated残します。 </li><li> 0.08 M MgAc、使用直前に追加されるβ-メルカプトエタノールのpHは4.5と1/100量、BMV抽出バッファー（0.5 M NAAC等量の（w / v）の滅菌乳鉢と乳棒の葉を挽く3）。ウイルス収量を最大にするために、それは研削容易かつ効率的に細胞破壊を促進する酸洗浄した砂（〜0.5〜1グラム）を追加することをお勧めします。 </li><li>モスリン布の2-3層を介して葉エキスをフィルタリングし、突風を収集します。 </li><li>再び葉材の初期重量にBMV抽出緩衝液と等量のモスリン布上に保持された部分を挽く。 </li><li>モスリン布を使用してろ過手順を繰り返します。これらのステップは4℃で行われるべきである</li><li>遠心管にろ液を移し、懸濁液の色はライトグリーンに変わりまで室温で5分間予備冷却し、クロロホルムと渦の等量（またはシェイク）を追加します。 </li><li> 4℃、12,000 rpmで15分間乳化した溶液を遠心分離℃に</li><li>水相を収集し、残留クロロホルムを除去するためにマグネチックスターラーで30分間攪拌する。 </li><li>滅菌遠心チューブに懸濁液を移す。 </li><li&gt;アンダー1ミリリットル。クッションの3として10％ショ糖（ウイルス抽出用緩衝液で調製）。 </li><li> 4でベックマン超遠心機で3時間、30,000 rpmで遠心分離℃、 </li><li>上清を捨て、（滅菌蒸留水で1/10に懸濁バッファー希釈BMV抽出緩衝液を調製するために）BMV懸濁バッファーの目的のボリュームでペレットを中断します。 </li><li>上記の手順から部分的に精製されたビリオンの準備は、4℃で28000 rpmで150分間百分の10から40のショ糖密度勾配遠心分離に供される</li><li>手動で、または分留によるウイルスバンドを収集します。ウイルスバンドは白色光照明の下で青で表示されます。 </li><li>ウイルス懸濁液バッファを持つウイルスのサンプルを少なくとも50％を含むショ糖溶液を希釈します。 </li><li> 4でベックマン超遠心で30,000 rpmで3時間のショ糖溶液を含む希釈ウイルス℃を遠心分離</li><li>最後に、VIRの所望の量で高度に精製されたウイルスペレットを一時停止する私達は、懸濁バッファーを。 </li><li> OD 260で分光光度計を用いてビリオン（mg / ml）の濃度を測定します。 </li></ol><img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/3645/3645eq1.jpg" />注意：RNAの内容に基づいて、BMVの吸光係数は5 4です。 <ol start="19"><li> TEM下に表示することにより、ウイルス粒子の純度を確認します（図A） </li></ol> 4。 in vitroでアセンブリのためのキャプシドタンパク質サブユニットの準備<ol><li> 5 1Xウイルス解離バッファー（; 50mMトリスHCl、pH7.5で; 1.0mMのEDTA 1.0mMのDTTおよび0.5mM PMSF、0.5MのCaCl 2）の1リットルを準備します。 </li><li> Sambrook ら 6に記載の透析膜を準備します。 </li><li>透析バッグにウイルスの精製に必要な濃度を分注する。 </li><li> 1Xウイルス解離緩衝液を含むビーカーにウイルスを含む透析バッグを置きます。 </li><li> 4°C薬用で24時間透析eは、攪拌した。 </li><li> 4℃で15分間12,000 xgで24時間遠心した後、透析バッグから溶液を回収℃にこれは解離ビリオンからBMV RNAを分離します。 </li><li> 4ペレット°Cの任意の非解離ウイルス粒子で3時間ベックマン遠心機で35,000 rpmで遠心上清を収集します。 </li><li>上清を収集します。 </li><li>この段階では、解離したキャプシドタンパク質のサブユニットから任意の汚染ビリオンRNAを除去するために不可欠です。これを行うには、ステップ8から上清を高速遠心（3時間で30,000 rpmで、続いて任意のRNAを（RNA 1Xアセンブリバッファには、以下を参照してください）​​を加えることなく、キャプシドタンパク質サブユニットの再構築上の夜の別のラウンドを行うべきである4℃）、ペレット、任意の組み立てビリオンへ。この再構築ステップの後、上清を含有するコ​​ートタンパク質のサブユニットは、任意の残留汚染RNAの自由でしょう。しかし、これを確実にするためには、vで、追加を実行することをお勧めしますRNA 1Xアセンブリバッファを使用した場合にのみコートタンパク質サブユニットと再構築itro。再構築上の夜の後、準備が（TEMを使用して確認）組み立てられたビリオンの自由でなければなりません。 </li><li> OD 254および280 nmで測定することにより、またはそのようなブラッドフォードアッセイのような他の方法により、キャプシドタンパク質サブユニットの濃度を決定します。 </li><li> 12から15パーセント解離キャプシドタンパク質サブユニットの整合性を決定するためにウェスタンブロット、続いてSDS-PAGEを行います。 </li></ol> （5）RNA の in vitroアセンブリでビリオンを含む<ol><li>ビリオンに再組み立てするRNA転写物を調製し、濃度7を計算します。 </li><li>カプシドタンパク質のサブユニットを混在させると1:5（wt / wt）の5の比率で転写RNAの。 </li><li>透析バッグと、任意のリークを防ぐため、適切にセキュリティで保護された上記混合物を分注する。 </li><li>千ミリリットルを準備します。 5 RNA 1Xアセンブリバッファ（; 50mMトリス-HCl、pH7.2で; 10mMのKClを5mMのMgCl 2、1.0mMのDTT 50mMのNaCl）の。 </li><li>ビーカーに1Xアセンブリ緩衝液に対して反応混合物を含有する透析バッグを置いて、かき混ぜる。 </li><li>穏やかに撹拌により24時間4℃で再アセンブリ反応を透析。 </li><li> 24時間後に透析バッグから物を収集し、RNAアセンブリバッファの1.5ミリリットルを追加します。 </li><li> 30分間低速（2,000×g）で遠心分離することによってセントリコン-100カラムを介して、この混合物を渡します。 </li><li> 30分間、4℃でアセンブリバッファの1.5ミリリットルで一回カラムを洗浄します。 </li><li>二回上記洗浄工程を繰り返します。 </li><li>最後に、4℃で10,000 gで遠心分離して再組み立てビリオンを溶出℃を5分間。 </li><li> OD 260 nmでビリオン濃度を推定する。 </li></ol> 6。光学ウイルスゴーストの作製（OVGs） <ol><li>所望の濃度比で精製されたキャプシドタンパク質（このレポートで使用されているインドシアニングリーンとキャプシドタンパク質の重量比が1:10であった）にグリーン（ICG）8インドシアニン追加<html> dは、ピペッティングにより混和します。 </li><li>キャプシドタンパク質を透析とOVGアセンブリバッファ（1 M NaCl及び1mMのDTT、pH4.8、50 mMのNAAC; 1mMのEDTA）に対してソリューションをICGの4℃で2​​4時間C。 </li><li> 24時間後、4℃で1時間90,000 rpmで透析バッグ（12 kDaの孔の大きさ）と、遠心機から溶液を回収°C（図B） </li><li> 4℃でボルテックスまたはそれが一晩BMVの懸濁緩衝液中でそれ自体で中断することにより、上清を除去し、BMV懸濁バッファーに懸濁し</li><li> TEMによるOVGs（図C）の形態を確認します。 </li><li> 240 nmから分光光度計（ローリー50、バリアン社製）を用いて950 nmの吸光度を測定し、ICGの存在は、700 nmと790 nmの約8署名の吸光度のピークが確認された。 （図D） </li><li> 〜700 nmと〜800 nmでの典型的なICG蛍光ピークは、分光光度計を使用してOVG液の620 nmの励起（図D）（Fluorolog 3、ジョバンイボン - ）に見ることができます。 </li></ol>_title &quot;&gt; 7。代表的な結果<img alt="図" src="/files/ftp_upload/3645/3645figA.jpg" /> N.から精製されたネガティブ染色BMVビリオンの図A. TEM像ベンサミ植物は、すべての3つの野生型BMVのagroconstructs（スケールバー= 100 nm）の混合物でagroinfiltrated。 <img alt="図B" src="/files/ftp_upload/3645/3645figB.jpg" /> in vitroでの図Bペレットは、高速遠心分離後に含むOVGs ICGの組み立て。 <img alt="図C" src="/files/ftp_upload/3645/3645figC.jpg" /> ネガティブ染色ICGの含むOVGsの図CのTEM像（スケールバー= 100 nm）を。 <img alt="図D" src="/files/ftp_upload/3645/3645figD.jpg" /> OVGs 図D.吸光度（上）および蛍光（下）スペクトル。 OVG放出wに対して使用される励起波長620 nmの。

<ol><li>Annamalai, P., Rao, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-independent+expression+of+genome+components+and+capsid+protein+of+brome+mosaic+virus+in+planta%3A+a+functional+role+for+viral+replicase+in+RNA+packaging%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Replication-independent expression of genome components and capsid protein of brome mosaic virus in planta: a functional role for viral replicase in RNA packaging.</a> Virology. 338, 96-111 (2005).</li>
<li>Annamalai, P., Rofail, F., Demason, D. A., Rao, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-coupled+packaging+mechanism+in+positive-strand+RNA+viruses%3A+synchronized+coexpression+of+functional+multigenome+RNA+components+of+an+animal+and+a+plant+virus+in+Nicotiana+benthamiana+cells+by+agroinfiltration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Replication-coupled packaging mechanism in positive-strand RNA viruses: synchronized coexpression of functional multigenome RNA components of an animal and a plant virus in Nicotiana benthamiana cells by agroinfiltration.</a> J. Virol. 82, 1484-1495 (2008).</li>
<li>Annamalai, P., Rao, A. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAnnamalai%2C+P+%22Plant+Virology+Protocols%22">Plant Virology Protocols</a>. Foster, N., Johansen, H. 451, Humana Press. 251-264 (2008).</li>
<li>Lane, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bromoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Virus+Res%22%5BJournal%5D)">The bromoviruses.</a> Adv. Virus Res. 19, 151-220 (1974).</li>
<li>Choi, Y. G., Rao, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+studies+on+bromovirus+capsid+protein.+VII.+Selective+packaging+on+BMV+RNA4+by+specific+N-terminal+arginine+residuals%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Molecular studies on bromovirus capsid protein. VII. Selective packaging on BMV RNA4 by specific N-terminal arginine residuals.</a> Virology. 275, 207-217 (2000).</li>
<li>Sambrrok, J., Russel, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrrok%2C+J+%22Molecular+Cloning.+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning. A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).</li>
<li>Dreher, T. W., Rao, A. L., Hall, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+in+vivo+of+mutant+brome+mosaic+virus+RNAs+defective+in+aminoacylation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Replication in vivo of mutant brome mosaic virus RNAs defective in aminoacylation.</a> J. Mol. Biol. 206, 425-438 (1989).</li>
<li>Jung, B., Rao, A. L., Anvari, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+nano-constructs+composed+of+genome-depleted+brome+mosaic+virus+doped+with+a+near+infrared+chromophore+for+potential+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22A.C.S.+Nano%22%5BJournal%5D)">Optical nano-constructs composed of genome-depleted brome mosaic virus doped with a near infrared chromophore for potential biomedical applications.</a> A.C.S. Nano. 5, 1243-1252 (2011).</li>
<li>Voinnet, O., Lederer, C., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+viral+movement+protein+prevents+spread+of+the+gene+silencing+signal+in+Nicotiana+benthamiana%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana.</a> Cell. 103, 157-167 (2000).</li>
<li>Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+Agrobacterium-mediated+transient+assays+of+gene+expression+in+lettuce%2C+tomato+and+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis.</a> Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).</li>
</ol>

我々は、開示することは何もありません。

ここに提示Agroinfiltrationのアプローチは、広く植物ウイルスの広い範囲に適用することができます。このアプローチの特徴機能は同じ細胞一般に植物ウイルスの日常的に使用される機械的な接種に関連付けられている主な欠点に複数のagroconstructの配信を同期化されています。in vivoおよび in vitroのアセンブリの研究ではモデルとしてブロムモザイクウイルスを用いて効率的に行うことができるいくつかのヒント（I）Nの成功した浸潤については、次のベンサミ葉は、浸潤前に水を24時間工場をしません。浸潤が4月5日PMの間で行われた場合（ⅱ）アグロバクテリウム懸濁培養では、容易に細胞内の空間に広がるであろうこと、（iii）文化の光学密度を超えてはなりませんOD 600で1.0。高い細胞密度agroculturesの浸潤が著しく、ウイルスの複製とその後のビリオンに影響を与える可能性が細胞毒性と葉の老化9,10を誘導することが知られて形成すること、（iv）浸...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> MESのナトリウム塩</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> M2993 </td></tr><tr><td>インドシアニングリーン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> I2633 </td></tr><tr><td>ベックマン超遠心</td><td>ベックマン·コールター</td><td>モデル：L8-70M </td></tr><tr><td>セントリコン-100カラム</td><td>ミリポア</td><td> YM-100 </td></tr><tr><td>分光光度計</td><td>キャリー50、バリアン社</td><td>部品番号 10068900 </td></tr><tr><td>蛍光光度計</td><td> Fluorolog 3、ジョバンイボン - 。 </td><td>部品番号FL3-21 </td></tr></tbody></table>

シンプルで堅牢な<emin vivoでの>と in vitroで</emウイルスの組み立てを学ぶための>アプローチ

Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly

ヒト、動物や植物、子孫カプシド成熟し安定したウイルス粒子へのプラスセンスRNAゲノム病原性のウイルスで、特定のホストの感染の確立時に基本的な位相である。したがって、キャプシドの研究では、ノウハウ感染性ウイルス粒子を形成するためにウイルスのアセンブリを制御するメカニズムのに関する情報を解読する。このような情報はウイルスの拡散や病気のコントロールを抑制する新規の方法を定式化する際に不可欠である。ウイルスのキャプシドは 、in vivo および in vitro で研究することができる。 in vivoでのゲノムのカプシドは、巨大分子の相互作用と細胞内局在を含む高度に調節の選択のプロセスです。したがって、in vivoでのウイルスのキャプシドを包含するイベントを分析するために主要な研究は、ウイルスが増殖し、組み立てる方法を理解する基本的な知識を提供するであろう。最近のin vitroカプシドに医学IMAの分野で研究のために利用されていますパトンと治療への応用。非エンベロープ植物ウイルスは、負に帯電した異物の in vitro でのキャプシドでの合弁会社ではるかに先に立っている。ブロムモザイクウイルス（BMV）、植物への非エンベロープ多RNAウイルスの病原性は、in vivoおよび in vitro におけるゲノムパッケージングを研究するためのモデル系として使用されています。 ニコチアナベンサミプラントのカプシド形成アッセイのために、 アグロバクテリウム媒介一過性の発現は、agroinfiltrationなどを参照して同じセルに複数のコンポーネントの同期配信および発現のための効率的で堅牢な技術です。このアプローチでは、desiredviral mRNAのcDNAを運ぶバイナリープラスミドベクターを有するアグロバクテリウムツメファシエンスの細胞の懸濁液を1 mlの使い捨て注射器（針なし）よりも洗練されたものを使用していない間隙withina葉に浸透されています。植物細胞へのDNA挿入物の転送では、このプロセスの結果、T-DNAインサートは、核内に一時的に留まり、その後ホストポリメラーゼIIによって転写される、一過性の発現につながる。得られたmRNA転写物は（キャップ​​とポリアデニル化）し、翻訳の質に輸出されています。インキュベーションは、約24から48時間後、浸潤葉のセクションはmicroscopyor生化学分析のためにサンプリングすることができます。 Agroinfiltration同時にトランスフェクトされる細胞の大量（数百から数千個）を許可します。 in vitroでのキャプシドのために、BMVの精製ウイルス粒子を遠心分離によりRNAを除去すると非解離のビリオンに続く解離緩衝液を含む塩化カルシウムに対して透析によってキャプシドタンパク質に解離しています。ゲノム枯渇キャプシドタンパク質のサブユニットは、希望するウイルスゲノムのコンポーネントまたはそのような色素インドシアニンなどの非ウイルス性のコンポーネントで組み立てられます。

を経由して植物細胞に複数のウイルス成分の配信を同期化する、シンプルで効率的かつ強力な方法<em&gt;アグロバクテリウム</em&gt;媒介一過性の発現が記載されている。このアプローチは、レプリケーションを研究するための従順で、カプシドは続く<em&gt; in vitroで</em&gt;再構築の非ウイルス性成分のゲノムには、生物医学アプリケーションに適した光学ウイルスの幽霊を枯渇。

ヒト、動物、および植物に病原性を持つプラス鎖RNAゲノムウイルスにおいて、子ウイルス粒子が成熟し安定したビリオンへと封入される過程は、極めて重要な...

本手順の全般的目的は、in vivoおよびin vitroにおけるウイルスの構築を研究することです。まず、brome mosaic virus（BMV）のRNAを細菌内で発現させ、アグロインフィルトレーションを通じて植物細胞に導入します。次に、インフィルトレーションした葉からBMVウイルス粒子を精製します。次に、in vitroアセンブリ用のカプシドタンパク質サブユニットを調製します。最後に、カプシドタンパク質とインドシアニングリーン色素を用いて、BMV Variansをin vitroでアセンブリします。最終的に、吸光度および蛍光放出によって判定される光学ゴーストの形成を通じて、in vitroでアセンブリされたbro mosaic variansの結果が示されます。本日は、ろ過（filtration）と呼ばれる手法について解説します。この手法は、ウイルスの構成要素を植物に導入する際に有用です。この手法の主な利点は、インビトロ転写（in vitro transcripts）の作成を不要にすることであり、同時に複数の構成要素を同一の細胞に導入できるため、同期させた感染（synchronized infection）が可能になります。現在我々が進めている研究では、brome mosaic virusとFDA承認済みの発色団であるcyanine greenを組み合わせ、生物医学的応用のための新しいタイプのナノ粒子を作製しています。具体的には、これらの構築物を「オプティカル・ワイヤ・ゴースト（Optical Wire Ghosts）」または「OWGs」と呼び、蛍光イメージングや光音響イメージングを含む光学イメージング手法、およびレーザー治療の送達手段として利用することを目的としています。現在追求している具体的な臨床応用としては、これらの構築物を術中操作と併用して卵巣がんのイメージングに活用することです。また、これらの構築物を機能化できると考えています。卵巣がんにおいて特に腹腔内に存在する可能性のある、残存腫瘍細胞を認識できる特異的な標的モチーフを持つOBGについて。Bmv RNA 1、2、または3を保持するようにあらかじめ調製したアグロバクテリウムのプレートから、単一コロニーを選択し、50 µg/mLのカナマイシンと100 µg/mLのリファンピシンを含む2 mLのLB培地に接種する。28 °C、250 RPMのオービタルシェーカーで1日間培養し、翌日、500 mLエルレンマイヤーフラスコに入れた50 mLのLB培地に1 mLの培養液を接種し、28 °C、250 RPMのオービタルシェーカーで16時間培養する。培養液がOD 600で1.0に達したとき、滅菌済みの30 mLチューブに移し、10分間遠心分離する。5,000 RPM、4°Cにて、ペレットを10 mM 塩化マグネシウム 10 mLに溶解させ、5,000 RPM、4°Cで10分間遠心分離します。抗生物質を完全に除去するため、この手順をもう一度繰り返します。次に、10 mM MESおよび10 mM 塩化マグネシウムを含むバッファー 10 mLにペレットを懸濁させます。各培養物のOD 600を測定し、10 millimolar 塩化マグネシウムおよび10 millimolar MESを用いてOD 600を0.1に調整します。次に、OD 600が0.1に調整された3種類の培養懸濁液を、それぞれ10 millilitersずつ混合します。最終濃度が100 millimolarとなるようにアセトフェノンを加えます。静かに混ぜ合わせ、室温で3時間静置します。インキュベーション後、培養液を針のない1 mLシリンジで吸い上げます。N hamanaの十分に展開した2〜3枚の葉の背面（abaxial side）に、各葉の背面の一半分にシリンジを静かに押し当て、培養懸濁液を浸潤させます。浸潤させた植物を温室にて24 °Cで3〜4日間保持した後、葉を回収します。BMVビリオンを精製した後、1 x ウイルス解離バッファーを1 L調製します。次に、透析膜を準備します。Sambrookらによる方法に従い、精製ウイルスを5〜10 mg/mLの濃度で透析袋に入れ、この袋を1×ウイルス解離バッファーが入ったフラスコに浸します。4 °Cで撹拌しながら24時間透析を行います。透析バッグから溶液を回収し、4 °Cで30,000 RPMにて30分間遠心分離して、結合していないウイルス粒子をペレット化します。上清を4 °Cで30,000 RPMにて3時間遠心分離します。ビリオンに再構成するためのRNA転写物を調製した後、カプシドタンパク質サブユニットとRNA転写物を1対5の比率で混合します。混合液を透析バッグに入れ、漏れないように適切に固定します。1X RNA assembly bufferを1リットル調製した後、再構成反応混合液をこのバッファー中で4°Cで24時間透析させます。翌日、混合液を透析バッグから取り出し、1.5 mLのRNA assembly bufferを加えます。続いて、4°Cで30,000 RPMにて3時間、再度遠心分離を行います。その後、上清を除去し、ペレットを再懸濁します。次に、OD 260 nmでビリオン濃度を推定します。続いて、OD 280 nmまたはブラッドフォード法などの他の手法を用いてカプシドタンパク質サブユニットの濃度を測定し、解離したカプシドタンパク質サブユニットの完全性を確認します。12〜15% SDS-PAGEを行い、ウェスタンブロッティングを 실시します。最後に、記載されたプロトコルの手順に従って、光学的ウイルスゴースト（OV ghosts）を作製します。ここに、3種類の野生型BMVアグリ構築物の混合物をアグロインフィルトレーションしたエンドハマナ植物から精製した、ネガティブ染色BMVバリオンの透過電子顕微鏡像を示します。このTEM像は、インドシアニングリーンを含むネガティブ染色された光学ウイルスゴーストを示しています。ここでは、精製後の光学ウイルスゴーストの吸光スペクトルおよび蛍光スペクトルを示します。この手法は、1サンプルあたり5分で実施可能です。このビデオを視聴することで、ウイルス成分または非ウイルス成分をカプシドタンパク質サブユニットに封入する方法について、十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

Source: Olety, B., et. al., Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes. J. Vis. Exp. (2016)This study demonstrates a fluorescence-based assay to observe the membrane-binding behavior of human immunodeficiency virus type-1 structural protein. Using synthetic giant unilamellar vesicles as model membranes, the assay visualizes protein recruitment and assembly, mimicking early steps of viral particle formation.

Visualizing Viral Structural Protein Assembly on Giant Unilamellar Vesicle Membranes

ここでは、透過型電子顕微鏡を用いて、ナノメートル分解能でウイルス複合体を画像化する手順について説明する。...

その時 液体中の生物学的集合体のTEM

表面へのビリオンの付着は、超解像蛍光イメージングまたは原子間力顕微鏡(AFM)による単一のビリオンイメージングの要件です。ここでは、AFMおよび超解像蛍光イメージングでの使用に適したガラス表面へのビリオンの制御接着のためのサンプル調製方法を示す。...

単一のビリオン原子間力顕微鏡と超解像蛍光イメージングのサンプル調製

この論文は、高分子のほぼネイティブな状態の高品質な顕微鏡画像を取得するために使用されるクライオ電子顕微鏡法について説明しています。この方法は、高分子の3D再構成を生成するために考案された単一粒子アプローチを使用したさらなるコンピュータ化された処理に適した画像を生成します。...

高分子の3次元再構成のための試料調製のプライマーおよび高品質データ収集：クライオ電子顕微鏡ののいいことといけないことをやる

ウイルス遺伝子増幅を利用したルーチンの検出方法は、非感染性粒子から感染を区別する無力によって制限されます。この資料の目的は、アプタマー...

代替体外ウイルスのカプシド構造健全性の定量方法

相関光電子顕微鏡 (クレム) メソッドは、以前、光顕 (LM) で選択されているセルの電子顕微鏡検査 (EM) による画像ウイルスによる細胞内構造に適用されます。LM および EM は、ウイルス-宿主間相互作用の統合ビューを達成するためにハイブリッド...

相関光電子顕微鏡 (クレム) 追跡のウイルス蛋白質のイメージング関連するクライオ固定化細胞の構造

呼吸合体ウイルス(RSV)RNA合成の詳細な機械分析のために、RNA非含核タンパク質(N0)をウイルス特異的ヌクレオキャプシド(NC)のその後のインビトロ集合体に対するRNAフリー核タンパク質(N0)の共発現にシャペロンホスホタンパク質(P)を利用するプロトコルを報告する。...

呼吸器間性ウイルスのウイルス特異的ヌクレオカプシドの生成と組み立て

ここでは、透過型電子顕微鏡を使用してナノスケールでの液体EMおよびクライオEM分析に適したウイルスアセンブリを調製するためのプロトコルについて説明します。...

液体および氷中のウイルス集合体の高解像度イメージングの進歩

mScarletと呼ばれる蛍光タンパク質を使用したEponの埋め込み後相関光および電子顕微鏡の詳細なプロトコルを紹介します。この方法では、蛍光と超微細構造を同時に維持できます。この技術は、さまざまな生物学的用途に適しています。...

Epon Post Embedding 相関光電子顕微鏡

このビデオプロトコルは、ウイルス学的標本の走査型透過型電子顕微鏡断層撮影法を実行する方法を示しています。最適な結果を得るために、サンプルは高圧凍結とその後の凍結置換によって調製されます。...

ウイルス学における走査型透過型電子顕微鏡断層撮影:高圧凍結凍結置換サンプルの3Dイメージング

学ぶウイルス組み立て法。Agrobacteriumを用いた植物細胞への遺伝子導入とBMVのin vivo・in vitro組み立て、光学ゴースト形成によるバイオ医薬品応用を解説します。

シンプルで堅牢なと in vitroでアプローチ

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