シンプルで堅牢なと in vitroでアプローチ

本手順の全般的目的は、in vivoおよびin vitroにおけるウイルスの構築を研究することです。まず、brome mosaic virus（BMV）のRNAを細菌内で発現させ、アグロインフィルトレーションを通じて植物細胞に導入します。次に、インフィルトレーションした葉からBMVウイルス粒子を精製します。

次に、in vitroアセンブリ用のカプシドタンパク質サブユニットを調製します。最後に、カプシドタンパク質とインドシアニングリーン色素を用いて、BMV Variansをin vitroでアセンブリします。最終的に、吸光度および蛍光放出によって判定される光学ゴーストの形成を通じて、in vitroでアセンブリされたbro mosaic variansの結果が示されます。

本日は、ろ過（filtration）と呼ばれる手法について解説します。この手法は、ウイルスの構成要素を植物に導入する際に有用です。この手法の主な利点は、インビトロ転写（in vitro transcripts）の作成を不要にすることであり、同時に複数の構成要素を同一の細胞に導入できるため、同期させた感染（synchronized infection）が可能になります。現在我々が進めている研究では、brome mosaic virusとFDA承認済みの発色団であるcyanine greenを組み合わせ、生物医学的応用のための新しいタイプのナノ粒子を作製しています。

具体的には、これらの構築物を「オプティカル・ワイヤ・ゴースト（Optical Wire Ghosts）」または「OWGs」と呼び、蛍光イメージングや光音響イメージングを含む光学イメージング手法、およびレーザー治療の送達手段として利用することを目的としています。現在追求している具体的な臨床応用としては、これらの構築物を術中操作と併用して卵巣がんのイメージングに活用することです。また、これらの構築物を機能化できると考えています。

卵巣がんにおいて特に腹腔内に存在する可能性のある、残存腫瘍細胞を認識できる特異的な標的モチーフを持つOBGについて。Bmv RNA 1、2、または3を保持するようにあらかじめ調製したアグロバクテリウムのプレートから、単一コロニーを選択し、50 µg/mLのカナマイシンと100 µg/mLのリファンピシンを含む2 mLのLB培地に接種する。28 °C、250 RPMのオービタルシェーカーで1日間培養し、翌日、500 mLエルレンマイヤーフラスコに入れた50 mLのLB培地に1 mLの培養液を接種し、28 °C、250 RPMのオービタルシェーカーで16時間培養する。培養液がOD 600で1.0に達したとき、滅菌済みの30 mLチューブに移し、10分間遠心分離する。

5,000 RPM、4°Cにて、ペレットを10 mM 塩化マグネシウム 10 mLに溶解させ、5,000 RPM、4°Cで10分間遠心分離します。抗生物質を完全に除去するため、この手順をもう一度繰り返します。次に、10 mM MESおよび10 mM 塩化マグネシウムを含むバッファー 10 mLにペレットを懸濁させます。

各培養物のOD 600を測定し、10 millimolar 塩化マグネシウムおよび10 millimolar MESを用いてOD 600を0.1に調整します。次に、OD 600が0.1に調整された3種類の培養懸濁液を、それぞれ10 millilitersずつ混合します。最終濃度が100 millimolarとなるようにアセトフェノンを加えます。

静かに混ぜ合わせ、室温で3時間静置します。インキュベーション後、培養液を針のない1 mLシリンジで吸い上げます。N hamanaの十分に展開した2〜3枚の葉の背面（abaxial side）に、各葉の背面の一半分にシリンジを静かに押し当て、培養懸濁液を浸潤させます。

浸潤させた植物を温室にて24 °Cで3〜4日間保持した後、葉を回収します。BMVビリオンを精製した後、1 x ウイルス解離バッファーを1 L調製します。次に、透析膜を準備します。

Sambrookらによる方法に従い、精製ウイルスを5〜10 mg/mLの濃度で透析袋に入れ、この袋を1×ウイルス解離バッファーが入ったフラスコに浸します。4 °Cで撹拌しながら24時間透析を行います。

透析バッグから溶液を回収し、4 °Cで30,000 RPMにて30分間遠心分離して、結合していないウイルス粒子をペレット化します。上清を4 °Cで30,000 RPMにて3時間遠心分離します。ビリオンに再構成するためのRNA転写物を調製した後、カプシドタンパク質サブユニットとRNA転写物を1対5の比率で混合します。

混合液を透析バッグに入れ、漏れないように適切に固定します。1X RNA assembly bufferを1リットル調製した後、再構成反応混合液をこのバッファー中で4°Cで24時間透析させます。翌日、混合液を透析バッグから取り出し、1.5 mLのRNA assembly bufferを加えます。続いて、4°Cで30,000 RPMにて3時間、再度遠心分離を行います。その後、上清を除去し、ペレットを再懸濁します。

次に、OD 260 nmでビリオン濃度を推定します。続いて、OD 280 nmまたはブラッドフォード法などの他の手法を用いてカプシドタンパク質サブユニットの濃度を測定し、解離したカプシドタンパク質サブユニットの完全性を確認します。12〜15% SDS-PAGEを行い、ウェスタンブロッティングを 실시します。最後に、記載されたプロトコルの手順に従って、光学的ウイルスゴースト（OV ghosts）を作製します。

ここに、3種類の野生型BMVアグリ構築物の混合物をアグロインフィルトレーションしたエンドハマナ植物から精製した、ネガティブ染色BMVバリオンの透過電子顕微鏡像を示します。このTEM像は、インドシアニングリーンを含むネガティブ染色された光学ウイルスゴーストを示しています。ここでは、精製後の光学ウイルスゴーストの吸光スペクトルおよび蛍光スペクトルを示します。

この手法は、1サンプルあたり5分で実施可能です。このビデオを視聴することで、ウイルス成分または非ウイルス成分をカプシドタンパク質サブユニットに封入する方法について、十分に理解できるはずです。