用絹フィルム培養システム in vitroで分析とマテリアルデザイン

この手順の全体的な目標は、シルクフィルムのin vitro培養システムを設定することです。これは、最初に目的のフィルムを作成するためのシルク溶液を製造することによって達成されます。2番目のステップは、シルク溶液をシリコーンゴム成形面にキャストし、フィルムを乾燥させることです。

その後、シルクフィルムを細胞培養用に加工します。次に、無菌技術を使用して培養システムを組み立てます。最後のステップは、シルクフィルムに目的の細胞タイプを播種することです。

最終的に、シルクフィルムの培養表面は、直接イメージングするか、培養物内で分析することができます。プレートまたはサンプルは、固定および必要に応じてさらなる処理のために取り外すことができます。標準的な組織培養プラスチックでの培養などの既存の方法に対するこの技術の主な利点は、シルクフィルム生体材料が生体適合性が高く、研究者が下流のin vivoおよびin vitroアプリケーションに容易に移行できることです。

この方法は、細胞生物学や生体材料の分野で、表面トポグラフィーを使用して細胞応答に影響を与える方法など、主要な質問に答えるために使用できます。この方法は、角膜上皮応答に関する洞察を得ることができますが、初期のin vitro実験により、より複雑なin vivoシステムに対する予備的な答えが得られる他のシステムにも適用できます。シリコーンゴム金型の製造を開始するには、このデモンストレーションのために鋳造するための所望の地形面を取得します。

標準的な100ミリメートルのエッチングされたシリコンウェーハは、かなり遅れて使用されます。PDMSポッティングと触媒溶液は、購入したキットから提供される9対1の比率で提供されます。溶液を完全に混合して、硬化プロセスを開始します。

シリコンウェーハ表面をキャスティング皿内に配置した後、4.5gのPDMS溶液をシリコンウェーハ上に秤量します。PDMS溶液がウェーハ上に均一に広がった後、ウェーハを直径100ミリメートルのシャーレ蓋で覆い、水銀10ミリメートルに2時間置きます。PDMS溶液から気泡を脱気するには、翌日、キャスティングセットアップを摂氏60度のオーブンで平らな面に一晩置き、硬化したPDMSシリコンウェーハを100%エタノール浴に入れます。

PDMSを取り外す前に、かみそりの刃を使用して鉗子を使用して円周の端を持ち上げ、ウェーハからPDMSを取り外し始めます100%エタノール浴内でPDMSを静かに引き抜きます。シリコーンゴムの鋳型が破れないように注意しながら、14mmの穴あけパンチで個々のPDMS型を抜き取ります。この直径は、24ウェルプレートのウェルに適合するように設計されています。

絹溶液を調製するには、2リットルの蒸留水を沸騰させます。ガラススピーカーで、5グラムのボンベックスマオリのカイコの繭を3分の1に切り、内側の繭の表面を覆う過剰な昆虫の微粒子が示すように、広範囲に汚染された繭を処分します。沸騰を防ぐために、4.24グラムの炭酸ナトリウムを沸騰したお湯の量にゆっくりと加えます。

炭酸ナトリウムが溶解したら、繭片を沸騰したお湯に加え、テフロンコーティングされた攪拌棒で40分間攪拌します。沸騰させた後、蒸留水を慎重に流しに排出し、シルクエキスを手で絞り出して余分な水分を取り除きます。次に、シルクエキスを1リットルの蒸留水を入れたプラスチック製のビーカーに入れ、20分間攪拌して洗います。

この洗浄プロセスを真水で2回繰り返します。洗った絹抽出物を手で輪に出し、絹繊維抽出物を化学フードの中に入れて12時間乾燥させます。翌日、乾燥した絹繊維(通常は約3.5グラム)の重さを量ります。

次に、書面によるプロトコルに従って、シルクの体積に対する20%の重量溶液に対して9.3モルの臭化リチウム溶液を準備します。シルクエキスをビーカーに入れた後。絹繊維の上に臭化リチウム溶液を注ぎます。

絹繊維が溶液に浸されていることを確認してください。ラボ用スパチュラを使用して、溶かしたシルクを摂氏60度のオーブンに4時間入れます。4時間後、適切なサイズの注射器を使用して12ミリリットルの絹溶液を吸い上げます。

18ゲージの針の配置に続いて。シリンジの端で、溶液を透析カセットに注入します。カセット充填後、空になったシリンジでカセットから残りの空気を引き出します。

充填された透析カセットを1リットルの蒸留水に入れます。1時間後、4時間後、8時間後、さらに12時間ごとに3回、合計6回の水換えを行います。透析後。

シリンジでカセットから絹溶液をゆっくりと集め、遠心チューブに移します。遠心分離後20分間、10, 000gおよび摂氏4度で溶液を遠心分離します。スーパーナチンを新しいチューブに入れます。

このプロセスを2回繰り返した後、2つの0.5ミリリットルのシルク溶液サンプルを別々の小さなホエー皿にピペットで移します。ホエーディッシュを摂氏60度の乾燥オーブンに12時間、またはシルク溶液が駆動するまで置きます。バルクシルク溶液は摂氏4度で保存することができます。

両方のサンプルから残りの固体シルクフィルムを秤量して、溶液のシルクタンパク質濃度密度を測定します。透明なテープを使用してPDMSの鋳造面を準備し、ほこりを取り除きます。次に、PDMS基板を100%エタノールに1分間浸して洗浄します。

次に、それらを取り外して乾かします。厚さ50マイクロメートルのフィルムを製造するには、70マイクロリットルの8%シルク溶液をPDMS金型に広げます。1ミリリットルのシリンジチップなどの液体拡散ツールを使用して、150パスカルの気流圧力を90分間またはフィルムが乾くまで、層流クリーンベンチでシルクフィルム

フィルムが乾いたら、PDMSモールドを含むフィルムの全セットを水とひざまずくチャンバーに4時間以上入れて、水に溶けないフィルムを作ります。これは通常、洗面器の底に水が入った空の乾燥チャンバーであり、水とひざまずくチャンバーからシルクフィルムを取り除いた後、25キロパスカルの真空で引っ張られます。層流クリーンベンチで作業し、35mmのペトリ皿に70%エタノール浴を準備します。

次に、コントロール基板とステンレス鋼リングを少なくとも10分間皿に入れて滅菌します。次に、鉗子を使用してPDMS型からシルクフィルムを取り外します。それらを70%エタノールに浸し、各フィルムを1ミリリットルの70%エタノールで予め充填した24ウェルプレートの1つのウェルに入れます。

パターン側が上を向いていることを確認して、細胞接着を可能にする このステップでの成功を確実にするためには、シルクフィルムがウェル内に正しく無菌に配置されていることが重要です SILTフィルムの上にステンレス鋼のリングを置き、10分間インキュベートします サンプルフィルムの洗浄に続いて、テキストの指示に従って、 その指示に従って、細胞株を着座用に準備します。このデモンストレーションでは、ヒト角膜辺縁系上皮細胞株を最終ステップとして、ウェルあたり500マイクロリットルのHCLE懸濁液をサンプル化し、通常は1平方センチメートルあたり10,000細胞の密度を使用し、所望の実験プロトコルを実行します。ここに示されているのは、2日目にパターン化された平坦なシルクフィルムに付着したHCLE細胞株の走査型電子顕微鏡写真です。

カルチャーHCLEでは、カルチャーは増殖を続け、8日目までにパターン化された平らな表面で合流します。ここでの培養では、パターン化されたフラットなシルクフィルムの培養では、HCLE細胞を1日目、4日目、および8日目にガラス制御基板と比較します。SQUの核酸含量とMTT代謝活性アッセイを用いた培養定量では、ガラスコントロール表面と比較した場合、パターン化されたシルクフィルム基板とフラットなシルクフィルム基板の両方でHCLEの生存率が経時的に示されています。

ここに示されているのは、パターン化されたシルクフィルム表面上を移動するHCLE細胞のタイムラプス位相コントラストイメージングです。18時間の期間中、細胞を1平方センチメートルあたり10,000細胞の密度で座らせ、2時間培養した後、比較のためのイメージングを行い、平坦なコントロール表面上を移動するHCLE細胞の位相コントラストイメージングを同じ培養条件下で18時間の時間中に示しました。シルク溶液とシリコーン成形が準備されたら、この手順に従って適切に実行すれば、この技術は8時間で行うことができます。

免疫蛍光スキャン、電子顕微鏡法、ウェスタンブロットやイムノアッセイなどの分子生物学的手法、細胞生存率、細胞増殖、代謝率などの化学アッセイなどの他の方法を評価することで、これらのさまざまなカスタムデザインサービスに対する細胞応答をよりよく理解することができます。このビデオを見た後、あなたはシルクソリューションの作り方、カスタマイズされたパターン、シルクフィルムと文化の作り方をよく理解しているはずです。これらの基質上の任意の細胞タイプ。