Name: ヒトパピローマウイルスの新規T細胞エピトープを特徴付けるために、インターフェロン-γ酵素結合Immunospotアッセイの使用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 41 s
Description: 学ぶインターフェロン-γ酵素結合Immunospotアッセイを用いて、ヒトパピローマウイルス抗原特異的T細胞クローンを単離・培養・解析する方法。HPVに対するT細胞応答を研究し、新規エピトープを同定する技術です。

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本研究は、American Cancer Society Scholars Award (RSG-06-180-01-MBC) および NIH 助成金 (R01 CA143130 および UL1RR029884) の支援を受けて行われました。

<ol><li>Nakagawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+favorable+clinical+trend+is+associated+with+CD8+T-cell+immune+responses+to+the+human+papillomavirus+type+16+e6+antigens+in+women+being+studied+for+abnormal+pap+smear+results%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Low.+Genit.+Tract+Dis%22%5BJournal%5D)">A favorable clinical trend is associated with CD8 T-cell immune responses to the human papillomavirus type 16 e6 antigens in women being studied for abnormal pap smear results.</a> J. Low. Genit. Tract Dis. 14, 124-129 (2010).</li>
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<li>Larsson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recombinant+vaccinia+virus+based+ELISPOT+assay+detects+high+frequencies+of+Pol-specific+CD8+T+cells+in+HIV-1-positive+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">A recombinant vaccinia virus based ELISPOT assay detects high frequencies of Pol-specific CD8 T cells in HIV-1-positive individuals.</a> AIDS. 13, 767-777 (1999).</li>
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<li>Evans, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+processing+defects+in+cervical+carcinomas+limit+the+presentation+of+a+CTL+epitope+from+human+papillomavirus+16+E6%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antigen processing defects in cervical carcinomas limit the presentation of a CTL epitope from human papillomavirus 16 E6.</a> J. Immunol. 167, 5420-5428 (2001).</li>
<li>Shi, Y., Smith, K. D., Kurilla, M. G., Lutz, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+CD8%2B+T+cells+recognize+EBV+antigen+but+poorly+kill+autologous+EBV-infected+B+lymphoblasts%3A+immunodominance+is+elicited+by+a+peptide+epitope+that+is+presented+at+low+levels+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic CD8+ T cells recognize EBV antigen but poorly kill autologous EBV-infected B lymphoblasts: immunodominance is elicited by a peptide epitope that is presented at low levels in vitro.</a> J. Immunol. 159, 1844-1852 (1997).</li>
<li>Varadarajan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+single-cell+analysis+of+human+CD8%2B+T+cell+functions+reveals+discordance+for+cytokine+secretion+and+cytolysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">A high-throughput single-cell analysis of human CD8+ T cell functions reveals discordance for cytokine secretion and cytolysis.</a> The Journal of Clinical Investigation. , (2011).</li>
<li>Nakagawa, M., Kim, K. H., Moscicki, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+methods+of+identifying+new+antigenic+epitopes+of+human+papillomavirus+type+16+E6+and+E7+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Diagn.+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Different methods of identifying new antigenic epitopes of human papillomavirus type 16 E6 and E7 proteins.</a> Clin. Diagn. Lab Immunol. 11, 889-896 (2004).</li>
<li>Nakagawa, M., Kim, K. H., Gillam, T. M., Moscicki, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA+class+I+binding+promiscuity+of+the+CD8+T-cell+epitopes+of+human+papillomavirus+type+16+E6+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">HLA class I binding promiscuity of the CD8 T-cell epitopes of human papillomavirus type 16 E6 protein.</a> J. Virol. 81, 1412-1423 (2007).</li>
<li>Brown, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+epitope+%22hotspots%22+on+the+HIV+Type+1+gp120+envelope+protein+overlap+with+tryptic+fragments+displayed+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Res.+Hum.+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">T cell epitope "hotspots" on the HIV Type 1 gp120 envelope protein overlap with tryptic fragments displayed by mass spectrometry.</a> AIDS Res. Hum. Retroviruses. 21, 165-170 (2005).</li>
<li>Masemola, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+and+promiscuous+CTL+epitopes+in+conserved+regions+of+Gag+targeted+by+individuals+with+early+subtype+C+HIV+type+1+infection+from+southern+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Novel and promiscuous CTL epitopes in conserved regions of Gag targeted by individuals with early subtype C HIV type 1 infection from southern Africa.</a> J. Immunol. 173, 4607-4617 (2004).</li>
<li>Walker, B. D., Korber, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+control+of+HIV%3A+the+obstacles+of+HLA+and+viral+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune control of HIV: the obstacles of HLA and viral diversity.</a> Nat. Immunol. 2, 473-475 (2001).</li>
</ol>

著者は開示すべき事項がないことを表明します。

従来、免疫学者は、目的のT細胞をin vitroで刺激し、限界希釈実験を行ってエピトープ特異的なT細胞クローンを単離させることで、新規T細胞エピトープの特性解析を試みてきました。その後、クロム放出アッセイを用いてT細胞クローンの特性を評価していました8,9。しかし、T細胞の頻度が低すぎて単離できなかったり、特性解析を完結させるのに十分な数のT細胞クローン細胞が得られなかったりしたため、多くの試みが不成功に終わりました。本手法では、(1) 目的のT細胞が十分な数存在するかを評価し、(2) IFN-γ分泌に基づいて選択することで目的のT細胞の頻度を高め、(3) 自家LCLをT細胞クローン細胞と共に播種するELISPOTアッセイを行うことで、少数のT細胞クローン細胞で解析を可能にし、これらの制限を克服しています。Fig. 2には、潜在的なT細胞エピトープが存在する領域の特定だけでなく、エピトープ特異的T細胞の頻度を評価するために行われたELISPOTアッセイの例を示しています。エピトープ特異的T細胞の推定数は、目的領域のスポット形成ユニットから、ペプチドなしの陰性対照の...

<table><tbody><tr><td>CD8 T細胞分離キット</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-156</td><td></td></tr><tr><td>フィトヘマグルチニン</td><td>Remel, Thermo Fisher Scientific</td><td>R-30852801</td><td>2mg/vial</td></tr><tr><td>Yssel&amp;rsquo;s medium</td><td>Gemini Bio Products</td><td>400-102</td><td>1% プールヒト血清</td></tr><tr><td>96ウェル丸底プレート</td><td>BD Biosciences</td><td>08-772-17</td><td></td></tr><tr><td>リコンビナントヒトIL-2</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>202-IL-050</td><td>50&amp;#x03BC;g</td></tr><tr><td>24ウェルプレート</td><td>Corning</td><td>07-200-84</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>Cellgro</td><td>MT-21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>一次抗IFN-&amp;#947;モノクローナル抗体 (D1K)</td><td>Mabtech</td><td>3420-3-1000</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン標識抗IFN-&amp;#947;モノクローナル抗体 (7B-6)</td><td>Mabtech</td><td>3420-6-1000</td><td></td></tr><tr><td>Multiscreen HA ELISPOTプレート</td><td>EMD Millipore</td><td>MAHA S45 10</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>100 ml ボトル</td></tr><tr><td>プールヒト血清</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S40510H</td><td>熱不活化</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Cellgro</td><td>MT-10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Vectastain Elite ABCキット</td><td>Vector Laboratories</td><td>NC9313719</td><td></td></tr><tr><td>安定化ジアミノベンジジン</td><td>Open Biosystems</td><td>MBI 1241</td><td></td></tr><tr><td>AID EliSpot Reader Classic</td><td>Autoimmun Diagnostika GmbH</td><td>ELR06</td><td></td></tr></tbody></table>

ヒトパピローマウイルスの新規t細胞エピトープを特徴付けるために、インターフェロン-γ酵素結合immunospotアッセイの使用

Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

ヒトパピローマウイルス（HPV）などの局所感染を引き起こす病原体に特異的な、希少なT細胞の単離および特性解析における困難を克服するためのプロトコルが開発されました。その手順は、被験者からのT細胞エピトープを含むHPVタンパク質の領域の特定、インターフェロン-γ（IFN-γ）分泌に基づくペプチド特異的T細胞の選別、そしてT細胞クローンの増殖および特性解析です（Fig. 1）。被験者1は、生検により高グレード扁平上皮内病変と診断され、T細胞を採取した当日に治療のためLEEP（ループ電気切除術）を受けた患者でした1。重複する合成ペプチドを用いて実施したIFN-γ酵素結合免疫スポット（ELISPOT）アッセイにより、ヒトパピローマウイルス16型（HPV 16）のE6およびE7タンパク質内でT細胞エピトープを含む領域を特定しました（Fig. 2）。このアッセイから得られたデータは、T細胞エピトープを含む領域の特定だけでなく、エピトープ特異的T細胞の数の推定、および市販の磁気ビーズ（CD8 T-cell isolation kit, Miltenyi Biotec, Auburn CA）を用いたIFN-γ分泌に基づく単離に使用されました。選別されたIFN-γ分泌T細胞は、1ウェルあたり1つのT細胞の増殖をサポートするため、照射したフィーダー細胞混合物の存在下で希釈し、単独で培養しました。これらのT細胞クローンは、必要となるT細胞クローン細胞数を最小限に抑えるため、特定された領域をカバーするペプチドおよび自己由来のEpstein-Barrウイルス形質転換Bリンパ芽球様細胞（LCLs、WallsおよびCrawfordの記述に従い取得）2の存在下で、IFN-γ ELISPOTアッセイを用いてスクリーニングされました。ELISPOTアッセイで通常用いられる1ウェルあたり1 x 105個の細胞1,3の代わりに、1 x 105個の自己LCLs存在下で1,000個のT細胞クローン細胞を使用し、これにより必要なT細胞クローン細胞数を劇的に減少させました。自己LCLsは、T細胞クローン細胞にペプチドアンテゲンを提示するだけでなく、ウェル内の高細胞密度を維持することで、エピトープ特異的T細胞クローン細胞によるIFN-γ分泌を可能にする役割を果たしました。これにより、IFN-γ ELISPOTアッセイの確実な遂行が保証されます。同様に、IFN-γ ELISPOTアッセイを用いて、CD8 T細胞エピトープ（HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY）の最小および最適アミノ酸配列と、そのHLAクラスI制限要素（B58）を特性解析しました。また、HPV 16 E6またはE7タンパク質を発現するワクシニアウイルスに感染させた自己LCLsを用いてIFN-γ ELISPOTアッセイを実施しました。その結果、E6 T細胞エピトープが内因的に処理されることが示されました。さらに、他の高リスクHPV型の相同なT細胞エピトープに対する交差認識が示されました。この手法は、CD4 T細胞エピトープの記述にも利用可能です4。

ヒトパピローマウイルスなどの局所感染を引き起こす病原体のT細胞エピトープを特性解析することは、血中に存在するT細胞数が限られているため困難です。本手法では、ごく少数の細胞から希少なT細胞を単離し、その特性を解析する方法について説明します。

ヒトパピローマウイルスの新規T細胞エピトープを特徴付けるために、インターフェロン-γ酵素結合Immunospotアッセイの使用

ヒトなどの病原体に特異的な希少なT細胞の単離および特性解析における困難を克服するため、あるプロトコルが開発されました。

本手順の全体的な目的は、患者からHPV抗原特異的T細胞クローンを分離、培養し、解析することです。まず、CD8 T細胞ラインを構築し、SBOTアッセイを実施して抗原特異的T細胞の頻度を推定します。インターフェロンγ分泌に基づいて抗原特異的T細胞クローンを分離した後、ハイスループットスクリーニングインターフェロンγ SBOTアッセイを行い、エピトープ特異的T細胞クローンを同定します。最小最適ペプチドに対するT細胞クローンの特性解析を継続します。エピトープ配列は、そのエピトープが内因性にプロセシングされるかどうかも決定します。HLA制限因子を特定し、他の高リスク型HPVに対する交差反応性を評価します。最終的な目的は、患者から得られた抗原特異的T細胞のスクリーニングと特性解析を通じて、新規かつ臨床的に有用なHPV T細胞エピトープを明らかにすることです。抗原特異的T細胞を同定するためのELISPOTアッセイなどの既存の手法と比較した本手法の主な利点は、成功の可能性が大幅に高いことです。この手法は、T細胞がHPVのどの部位を認識するかという免疫学分野における重要な疑問への回答に寄与します。T細胞の特異性に関する知見に基づいたワクチンや免疫療法の開発が可能となるため、本技術の影響は子宮頸がんの治療や診断にまで及びます。この手法はCD8+ T細胞エピトープに関する知見を提供でき、CD4+ T細胞エピトープなどの他の系にも適用可能です。被験者1から樹立したCD8+ T細胞株を用いたインターフェロンガンマ（IFN-γ）スポット形成アッセイ（SPOアッセイ）により、HPV16 E6の46〜70領域にT細胞エピトープが含まれていることが判明しました。これらのエピトープ特異的T細胞は、インターフェロンガンマの分泌に基づいて選別されました。照射した同種末梢血単核細胞、Bリンパ芽球、およびフィトヘマグルチニンを含むフィーダー細胞混合物を、完全E細胞培地で調製します。次に、フィーダー細胞混合液を用いて単離したエピトープ特異的T細胞を段階希釈し、マルチチャンネルピペットプレートを用いて1 mLあたり5個の細胞濃度を調製します。希釈したエピトープ特異的T細胞を、96ウェル丸底プレートの各ウェルに100 µLずつ分注します。37 °C、5% CO2条件下で5日間培養し、11日から14日目にリコンビナントヒトインターロイキン2で細胞を刺激します。プレートのウェル底にある大きなペレットとして、増殖しているT細胞クローンを視覚的に確認します。時折、培地が黄色くなることがあります。新しいフィーダー細胞混合液を調製し、24ウェルプレートの各ウェルに1 mLずつ完全Ecel培地を分注します。実験を成功させるには、200 µL マイクロピペッターを用いてT細胞クローンを単離し、培養できることが重要です。T細胞クローンを、プリーツ状のフィーダー細胞が入った個別のウェルに1つずつ移します。すべてのT細胞クローンの移送が完了するまで、この操作を繰り返します。滅菌済みsbotプレートのウェルに、5 $\mu\text{g/mL}$ の抗インターフェロン$\gamma$一次モノクローナル抗体を 50 $\mu\text{L}$ ずつ分注してコーティングし、4 °C で1時間インキュベートします。その後、200 $\mu\text{L}$ のPBSで3回洗浄します。次に、RPMI 1640で希釈した5%プールヒト血清を50 µL加え、非特異的結合をブロックします。大きな気泡がある場合は、必ず滅菌針で潰して除去してください。37 °C、5% CO2条件下で1時間インキュベートします。次に、5%ヒト血清を含む50 µLのRPMI 1640に、1×10⁵個の自家 LCLs を加えます。1 mLピペットを用いて各T細胞クローンの細胞を混合し、100 µLを滅菌エッペンドルフチューブに移します。5%プールヒト血清を含む500 µLのRPMI 1640で希釈します。その後、遠心分離により細胞をペレット化し、上清を除去して、5%ヒト血清を含む110 µLのRPMI 1640で細胞を再懸濁します。次に、迅速スクリーニングのため、各クローン細胞懸濁液50 µLを、PHA陽性対照ウェルと同じ位置にある2枚のEllisスポットプレートのウェルに播種します。複数のエッペンドルフチューブに残っている培地を合わせ、次の同じ位置にあるウェルにそれぞれ50 µLずつ播種します。また、50 µLの培地を用いて陰性対照ウェルを準備します。次にテストプレートにおいて、陽性領域に含まれるペプチド50 µLを陽性対照ウェルに加えます。PHAストック溶液10 µLとRPMI 1640 40 µLを、培地のみのプレートに加えます。5%混合ヒト血清を含むRPMI 1640を50 µL添加し、Ellisスポットプレートを37 °C、5% CO2条件下で一晩インキュベートする。インキュベーション期間中はプレートを動かさないこと。培地を除去し、0.05% tween 20を含むPBS 200 µLでウェルを3回洗浄する。次に、ビオチン標識抗インターフェロンガンマモノクローナル抗体を50 µL添加し、2時間インキュベートします。0.1% Tween 20を含むPBS 200 µLで3回洗浄します。その後、調製したばかりのアビジンおよびビオチン標識西洋ワサビペルオキシダーゼをそれぞれ50 µL添加し、37 °C、5% CO2条件下で1時間インキュベートします。0.1% Tween 20を含むPBSで3回洗浄した後、50 µLの安定化剤を添加します。室温で5分間、Dino benzineで呈色させます。次に、200 µLの脱イオン水で3回洗浄します。プレートを完全に乾燥させてください。自動ELISpotリーダーを用いてスポット数をカウントします。エピトープ特異性の確認のためにT細胞クローンを選択します。その後、エピトープ領域に含まれる3種類のペプチドそれぞれに対する反応性を確認するため、10³個のクローンT細胞を用いてELISpotアッセイを実施します。野生型組換えワクシニアウイルスに感染させた自家LCL、およびHPV 16 E6またはE7タンパク質を発現する組換えワクシニアウイルスに感染させた自家LCLを調製します。次に、選択したT細胞クローンを用いてELISPOTアッセイを行い、野生型組換えワクシニアウイルス感染自家LCLに対する反応性と、HPV 16 E6またはE7タンパク質を発現する組換えワクシニアウイルス感染自家LCLに対する反応性を比較します。まず、エピトープ領域をカバーする一連のオーバーラップ9-merペプチドを用いてELISPOTアッセイを実施します。次に、長さの異なる一連のペプチドに対する反応性を調べるため、LYスポットアッセイを行います。続いて、少数のペプチドを用いて濃度範囲を変えたスポットアッセイを実施します。これにより、最小かつ最適なアミノ酸配列を含む可能性が高いものを特定します。1つまたは2つのHLAクラスI分子を共有する、目的のヒト被験者から分離した同種LCLを調製します。十分に増殖しているT細胞クローンを選択します。10⁵個の同種LCL、10³個のT細胞クローン細胞を用い、10 µMの最小および最適ペプチドを使用してELISPOTアッセイを実施します。エピトープ特異的T細胞クローンの特性解析が完了した後、他の高リスク型HPVに対する交差反応性を試験することができます。関心のある選択的なクローナルT細胞を用い、他の高リスク型HPVの相同アミノ酸配列を含むペプチドに対する反応性をELISpotアッセイでスクリーニングします。被験者は、生検により高グレード扁平上皮内病変（HSIL）と診断された最近の既往歴を持つ22歳のアフリカ系アメリカ人女性です。LU電気切除術による治療日に、患者からT細胞を採取した。彼女のCD8 T細胞株のELISpotアッセイの結果、インターフェロンγの分泌レベルが1.2 × 10⁵であったことから、HPV 16 E6 46-70領域にT細胞エピトープが含まれていることが示された。選択された細胞の5分の1を用いて限界希釈法を行い、エピトープ特異的T細胞を選別した。262個のT細胞クローンを回収した。最初のT細胞クローニングの試行で成功したため、残りの選択された細胞は使用しなかった。これらのクローンのうち94個に対して実施したELISpotアッセイによるスクリーニングにより、62個のスクリーンポジティブクローンを同定した。最初のEllis Spottアッセイでペプチド特異的なT細胞クローンが同定されたため、残りのT細胞クローンはテストしませんでした。良好に増殖しスクリーン陽性であった8つのクローンのエピトープ特異性は、該当領域をカバーする3つの15 MERペプチドを用いて個別に確認しました。指標に示されたすべてのT細胞クローンが、HPV 16 E6 51-65ペプチドに対して陽性を示しました。8つのクローンのうち6つがE6 46-60ペプチドに対して陽性であり、E6 56-70ペプチドに対して陽性を示したクローンはありませんでした。ここに、HPV 16 E6タンパク質またはE7タンパク質を発現する組換えワクシニアウイルスに感染させた自己LCLを用いたELISpotアッセイの結果を示します。これらの結果は、T細胞クローンが内因的に処理されたE6エピトープを認識することを実証しています。HPV 16の46番から65番の領域をカバーする一連のオーバーラップ9-merペプチドを用いることで、T細胞エピトープの最小かつ最適な配列の特性評価が容易になりました。最高の応答はE6 53-61ペプチドで得られました。オーバーラップペプチドエピトープの解析により、E6 52-61の10-merペプチドが、最も一貫して最小かつ最適な配列であることが特定されました。興味深いことに、E6 53-61ペプチドもT細胞クローンに対して同等に強い応答を示しました。図79の用量反応曲線は、E6 52-61ペプチドが、低濃度のペプチドにおいてE6 53-61ペプチドよりもはるかに効果的に陽性を維持したことを示しています。この例では、E6 75-83の最小および最適配列を検出することが判明した被験者Aについて、CD8 T細胞エピトープの制限的HLAクラスI分子を解析しました。B62およびCW3分子を発現するLCLにおいて高い陽性が認められます。CW3を発現するLCLでは背景陽性が見られますが、HPVゲノムのいくつかの領域はよく保存されています。例えば、被験者1で同定されたHPV 16のE6 52〜61領域に対する相同配列が、他の13種類の高リスクHPV型に存在していました。これと一致して、13種類の高リスクHPV型のうち8種類において強い交差認識が示されました。この技術を習得すれば、適切に実施した場合、採血日から7週間で完了させることができます。手順全体を通して、無菌操作を徹底してください。いかなるウイルスの取り扱いも危険を伴う可能性があるため、本手順の実施中は常に保護衣の着用などの予防措置を講じてください。このビデオを視聴することで、新規T細胞エフェクターの特性評価方法について十分に理解できるはずです。

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長期培養インターフェロンγ酵素結合免疫アッセイは、中央メモリー応答の尺度として用い、保護抗マイコバクテリアワクチン応答と相関されます。このアッセイでは、末梢血単核細胞を、分化、中央メモリーT細胞の拡大を可能にする、14日間マイコバクテリア抗原およびインターロイキン2で刺激します。...

牛にエフェクターおよびメモリーT細胞応答を評価するための長期培養インターフェロンγ酵素結合免疫アッセイの応用

ここでは、上皮内γデルタT細胞の分析のためのヒト子宮頸管内上皮内リンパ球を得るための単離方法について説明します。このプロトコルは、磁気ビーズまたは細胞選別による子宮頸管内γデルタT細胞の精製に拡張できます。...

ヒト子宮頸管ガンマ・デルタT細胞の単離およびフローサイトメトリー分析

ここで開発および単一分子配列デジタル ELISA 法、人間のサンプルですべての IFN-α サブタイプの超高感度検出を可能にする検証を記述するプロトコルを提案する.

超高感度単一分子の開発と検証配列人間のインターフェロン-α のデジタルの酵素免疫測定法

モルモット PBMCs のインターフェロン-γ しなさい測定法の開発では、感染症を研究するためこの関連性の高いモデルで T 細胞の反応特性をことができます。我々 は、関連付けられている DNA ワクチンの皮内送達 T...

ワクチン接種後のモルモット モデル メジャー T 細胞反応に最適化されたインターフェロン-γ しなさいアッセイ

B型肝炎ウイルス(HBV)由来のペプチドマトリックスに基づいて、HBV特異的CD4 T細胞応答をHBV特異的CD4...

ペプチドマトリックスに基づくHBV特異的CD4 T細胞応答の解析とHLA-DR制限CD4 T細胞エピトープの同定

この原稿では、フローサイトメトリーを用いて腫瘍細胞由来細胞外小胞(EV)の in vivo...

インビボ 脾臓T細胞のフローサイトメトリーによる腫瘍由来細胞外小胞の免疫原性スクリーニング

ここでは、抗原表示ウイルス様粒子(VLPs)上の中和エピトープを検出するプロトコルを提示する。ヒト免疫不全ウイルス(HIV)由来VLPの免疫沈降は、G結合型磁気ビーズのタンパク質に結合したエンベロープ糖タンパク質特異的モノクローナル抗体を用いて行う。捕獲されたVLPは、その後、SDS-PAGEおよびウイルスコアタンパク質Gag特異的抗体を採用したウェスタンブロット分析を行う。...

捕捉アッセイを用いたウイルス様粒子(VLP)ベースワクチンに対する抗原中中和感受性エピトープの検出

学ぶインターフェロン-γ酵素結合Immunospotアッセイを用いて、ヒトパピローマウイルス抗原特異的T細胞クローンを単離・培養・解析する方法。HPVに対するT細胞応答を研究し、新規エピトープを同定する技術です。

ヒトパピローマウイルスの新規T細胞エピトープを特徴付けるために、インターフェロン-γ酵素結合Immunospotアッセイの使用

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