Name: マウス胚の脊髄の全載標本での分岐軸索勉強するDRGニューロンのDII -標識 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: 学ぶマウス胚脊髄全載標本におけるDRGニューロンの軸索分岐パターン可視化法。DiI標識を用いて個別軸索のT型・Y型分岐を観察し、神経発生と再生研究の分子メカニズム解明に貢献します。

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著者は、有益なコメントを博士アリステアGarratt（マックスデルブリュックセンター、ベルリンの）感謝します。この作品は、ドイツの研究評議会（DFG）の共同研究センター（SFB665）によってサポートされていました。

1。解剖の手順 注 ：マウスの実験的使用は、実験動物の管理と使用のための公式に承認されたガイドラインに従ってください。 <ol><li>準備する前に、あなたの解剖顕微鏡を設定し、大型と小型のはさみ、大歯鉗子、湾曲鉗子と鉗子（内側研磨のヒントを持っているうちの2つを）解剖デュモン5号の4組を含む解剖に必要な手術器具をレイアウト（詳細については、）特定の試薬や機器の表を参照してください。 100 mmのSylgardコーティングしたシャーレにろ紙のシートを置きます。 、12ウェルプレートの各ウェルに100 mmのペトリ皿および12 ​​mlチューブを冷PBSを注ぎ、氷の上に残す。氷上で2番目の12ウェルプレートと場所の各ウェルに固定バッファのピペット2ミリリットル（PBS、pH7.4中4％パラホルムアルデヒド）。 </li><li>麻酔後、E12.5（膣栓の検出はE0.5として指定された）タイミング妊娠ダムを犠牲に、マウスを置く紙タオル3枚で、最大の腹側で、70％エタノールで腹部を浸す。 </li><li>腹骨盤腔を開き、二国間の子宮角を分離し、氷冷PBSで100 mmディッシュの一つにそれらを転送する。 </li><li>微細な制御下で、小さな、ストレートハサミで子宮壁の縦切開を行い、胎盤から各羊膜嚢を切り取る。 </li><li>離れてピール各胚から羊膜嚢とへその緒を切る。 </li><li>タイピングが要求されるべき場合、小さなはさみを使用して、胚を刎ねるとゲノムDNAの単離のためにヘッドまたはそれらの一部を脇に置く。その後、冷PBSで12ウェルプレートの各ウェルにtorsoの複数形を転送する。 </li><li> PBSを数滴Sylgard皿にろ紙を湿らせ、紙にその背側と胚の胴を置きます。優れた安定性のために、身体から離れて、その尾と四肢をまっすぐ。 </li><li>操作約16倍の倍率で解剖顕微鏡下で、慎重に微細な先端鉗子の2組脊髄上記の胚の皮膚をつまんで、ゆっくりとそれを引き裂く。途中で始まる、尾に向けた最初の進んでして、前方側に向かって途中から再開。 </li><li>乾燥を防ぐためにPBSの二、三滴で時間から時間まで胚を濡らす。 </li><li>それは内部の研磨チップによる微細な鉗子の刃で水平方向のスライド運動によって周囲の軟骨性脊柱からDRGと脊髄を切断胚から削除されたときにそのDRGを防ぐためには、脊髄からオフtearedされています。胚の右側の真ん中に開始、前端にして尾部に向かって、あなたのように働くと。その後、反対側の手順を繰り返します。関連したDRGを裂くように注意してください。 </li><li>胚から完全に緩んで脊髄を切断するために、そのcervicを拾うらは、微細な鉗子を持つ部分とその尾方端に向かって一体に引き出します。 </li><li> 12ウェルプレートのウェルに接続されたDRGと水没孤立脊髄は、固定バッファで満たされ、残りの胚から脊髄の準備を進める。 </li><li>氷上での脊髄少なくとも2時間を修正。 </li></ol> 2。 DRGニューロンのDII標識<ol><li>ラベル付けされる各脊髄の場合は、マイクロピペットプラーで2つのガラス針を準備。 。。。、2 HEAT = 600、VEL = 25、TIME = 175、3 HEAT = 630、VEL = 1 HEAT = 625、VEL = 35、TIME = 175：我々は、サッターモデルP - 97電極プラー（プログラムの設定を使用30、TIME = 150）。 </li><li>微細な制御下でエタノールのDIIの5％（w / v）溶液中の各ガラス針の先端3〜5倍のディップ。エタノールを蒸発させると、針のDII結晶の薄層を作成します。 </li><li>約40倍の倍率で解剖顕微鏡下で働いて、そのvを付けて脊髄を配置スライド上のentralサイドアップ。春のはさみを使用して、後で逆のオープンブックモード（セクションCを参照）で準備のマウントを可能にするfloorplateを切断することによって、全体の長さで腹側にコードを開きます。 </li><li>スライド上で、最大背側に脊髄を置きます。その後、手動で顕微鏡可視化の下でガラス針のDIIに覆われた先端と脊髄の片側に慎重に穴を開けるには毎秒DRGと脊髄にアプローチ。 DIIのほとんど痕跡は、神経細胞のごく少数のラベルを確保するためにピアスDRGに表示されないはず。コー​​ドのもう一方の側に第二針を取る。のみ毎秒DRGを目指しては、個々の軸索の分化を複雑にするかもしれない隣接DRGからラベル付き軸索投射の重複を避けることができます。 </li><li> ° Cでディに染料のために時間を与えるために4℃、周囲温度または一晩で少なくとも6時間暗所での固定バッファとインキュベートして脊髄を返す原形質膜内の軸索に沿ってffuse。脊髄への担保の成長の分析が望まれる場合には、より長い潜伏期間（4時までの二日間° C）を可能にする。 </li></ol> 3。取り付けと顕微鏡分析<ol><li>その背側を持つ単一の脊髄では、PBSのドロップにカバースリップを下に染料拡散、位置に続く。添付のDRGが横方向に正しく向いていると混在しないように注意してください。余分な水分を吸引し、鉗子を用いて反転、オープンブックモードでコードを平らにならす。 </li><li> PBSを用いて顕微鏡スライド上に準備をマウントします。 </li><li>標識した軸索突起の蛍光顕微鏡分析を染色不要なバックグラウンドの上昇を防ぐために、取り付けの日を行ってください。それまでは4℃、暗所でスライドを保持℃を</li></ol> 4。代表的な結果： マウスの脊髄では、求心性のPRを受け取る子宮頸部の8組からojections、胸部の13ペア、60脊髄神経節に合計仙骨DRGの腰椎と4組の5組。いくつかのトレーニングの後、まだ接続されているほとんどのDRGと脊髄は、5分以内で胚から単離することができる。この手順は、E11.5からE13.5マウス胚に添付されたDRGと脊髄の分離に適しています。しかし、最良の結果がE12.5から得られます。ここで説明する標識手順の典型的な結果を図3に示されています。脊髄の全長にわたってDRGの標識は、その後、別の脊椎レベル（ 図4）に軸索の分岐動作を定量化するために使用されることがあります。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig1.jpg" /> 図1：Schemeの軸索分岐の二つの主要なモードを描いた。ここに示されるように - - （A）分岐につながる可能性のある成長円錐の活動により分岐するだけでなく、複雑な端末アーバー（B）軸索のシャフト（間質性分岐）における担保の形成。後者のモードでは、6,7皮質と視床皮質軸索を投射するの支配分岐タイプです。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig2.jpg" /> 図2胚の脊髄へのDRGニューロンの求心性投射が軸索分岐の両方のタイプが表示されます：。分岐によってDREZ（1）および間質分岐（2）によって待機期間後に得られる娘の支店の副血行路の形態からの軸索最初のブランチを。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig3.jpg" /> 図3。胚のマウスのDRGニューロンの単一の軸索軌道の可視化。 （A）付属のDRGと脊髄は、E12.5マウス胚から調製。増加倍率での野生型マウスのDII標識DRGの（スケールバーは1mm。）（BD）背側のビューが表示されます。 Bで毎秒DRGはlabeleですDIIによるD。蛍光画像が反転されて、尾は左にあり、横方向のCとD、で一番下にあります。 Cでの軸索の数が少ないが標識され、より高い倍率でT -のような枝の存在は、脊髄のDREZで識別することができます。 （スケールバーは、250μm以下（B）、100μmの（C）および50μm（D）。） <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig4.jpg" /> 野生型およびC型ナトリウム利尿ペプチド（CNP）欠損E13.5のマウスのT字型の枝の図は、4。定量、単一の吻側または尾ターン。カウント単一の軸索の番号は、各遺伝子型ごとに異なる​​トランクレベルのカッコ内に表示されます。 C -またはR -ターン - 尾または吻側方向にのみ成長、それぞれ。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig5.jpg" /> 図5。cGMPのシグナル伝達経路は、脊髄のDREZで感覚軸索分岐をトリガします。の（A）スキームリガンドCNP、受容体グアニル酸シクラーゼNpr2とセリン/胚DRGニューロンにおけるスレオニンキナーゼcGKIαで構成されるcGMPのシグナル伝達経路。 Npr2は、CNPによる刺激によりGTPからcGMPを生成します。 （B）DIIは、野生型およびCNP欠損マウスでは神経細胞をDRGの単一の軸索のトレース。 （スケールバーは25μm。）

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<li>Zhao, Z., Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+axonal+development+by+natriuretic+peptide+hormones%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Regulation of axonal development by natriuretic peptide hormones.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (42), 18016-18016 (2009).</li>
<li>Schmidt, H., Rathjen, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling+mechanisms+regulating+axonal+branching+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Signalling mechanisms regulating axonal branching in vivo.</a> Bioessays. , (2010).</li>
<li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-41 (2000).</li>
<li>Livet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450 (7166), 56-56 (2007).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もない。

DIIラベリングのための固定組織の使用と組み合わせての準備の容易さと一緒に軸索枝の形成の両方のタイプで構成されるステレオタイプ化された投影パターンは分岐軸索の勉強に有利なモデルをDRGの添付を持つ胚脊髄になります。コー​​ティングされたガラスの針を使用してDIIの微量のアプリケーションが可能に - DRGニューロンの小集団の可視化と、それによって個々の軸索とその分岐パターンの分析 - DRGのバルクラベリングとは対照的に。記載される方法は、さらに、さらに標識したニューロン8の数を減少させる親油性トレーサーのイオン導入注入によって改善することができる。しかし、これはより多くの時間がかかります。 胚の脊髄の全体のマウント調製物中の単軸索軌道のDIIのラベリングは、cGMPシグナル伝達カスケードを構成する配位子のCNP、その受容体Npr2の同定に貢献した、とcGMP依存性キナーゼcGKIα -軸索分岐の一種規制：DREZ 4,5,9-12でニューロンをDRGの分岐を。 cGMPのシグナル伝達変異体の神経細胞をDRGの野生型、軸索とは対照的に代...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（省略可能） </td></tr><tr><td>実体顕微鏡STEMI DRC </td><td>ツァイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝溶液（PBS） </td><td> Biochrom AG </td><td> L182 - 50 </td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>メルク</td><td> 8.18715.1000 </td><td></td></tr><tr><td>標準的な外科はさみ</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 14001〜13 </td><td></td></tr><tr><td>歯標準鉗子</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11021〜14 </td><td></td></tr><tr><td>極細アイリスのはさみ</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 14088〜10 </td><td></td></tr><tr><td>湾曲鉗子</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11003〜13 </td><td></td></tr><tr><td>デュモン5号ファインチップの鉗子</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11254〜20 </td><td></td></tr><tr><td>デュモン5号鏡面仕上げ鉗子</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11252〜23 </td><td></td></tr><tr><td> Vannas -テュービンゲンバネはさみ</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 15008〜08 </td><td></td></tr><tr><td>ろ紙</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> FB59041 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard 184 </td><td>世界のPrecissionインスツルメンツ</td><td> SYLG184 </td><td></td></tr><tr><td> 100 mmのペトリ皿</td><td> Greinerの</td><td> 663102 </td><td></td></tr><tr><td> 12 mlのポリプロピレンチューブ</td><td>カールロート社</td><td> ECO3.1 &lt;/ TD&gt; <td></td></tr><tr><td> 12ウェル培養プレート</td><td>ベクトンディッキンソン</td><td> 35から3043 </td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>メルク</td><td> 1.00983.2500 </td><td></td></tr><tr><td>ブラウン/燃えるようなマイクロピペットプラーP - 97 </td><td>サターインストゥルメント（株） </td><td></td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラス毛細管</td><td>ハーバード装置</td><td> 30から0066 </td><td></td></tr><tr><td> DII（1,1&#39; -ジオクタデシル- 3、3,3&#39;、3&#39; -テトラメチル-過塩素酸塩をindocarbocyanine） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 468495 </td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡はSuperFrost Plusをスライド</td><td>カールロート社</td><td> H867.1 </td><td></td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ</td><td>カールロート社</td><td> 1870.2 </td><td></td&gt; </tr></tbody></table>

マウス胚の脊髄の全載標本での分岐軸索勉強するdrgニューロンのdii -標識

DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord

ここでは、親油性トレーサー1,1&#39; -ジオクタデシル- 3、3,3&#39;、過塩素酸塩（DII）1 3&#39; - tetramethylindocarbocyanineを使用して拡散染色により胚脊髄にDRGニューロンの小グループの軌跡をラベル付けする手法を提案。遺伝子が変異されたマウス系統のものと野生型の軸索経路の比較では、神経系の配線に不可欠な機構である軸索分岐の制御の候補タンパク質の機能的役割をテストできます。軸索分岐は、それによって情報の並列処理のための物理的な基礎を提供する、複数のターゲットに接続する個々のニューロンが可能になります。軸索成長の中間ターゲット領域での影響は、終末分枝と区別されることがあります。また、軸索枝形成の異なるモードが成長円錐の活動（分割または遅延ブラジャーからかどうかの分岐の結果に応じて分類することができるnching）またはプロセスにおける軸索のシャフトから担保の出芽からは、間質分岐2（ 図1）と呼ばれる。 DRGからのニューロンの中央の突起軸索分岐の両方のタイプを研究するために有用な実験系を提供する：それらの求心性軸索は10〜13胚日の間に脊髄の後根のエントリーゾーン（DREZ）に到達（E10 - E13）、それらT -またはY字型の分岐部の紋切り型のパターンが表示されます。得られた2つの娘の軸索は、脊髄の背側縁に、それぞれ、吻側または尾側方向に進むと待機期間の担保は、特定の中継ニューロンに灰白質（間質分岐）とプロジェクトを貫通して、これらの幹の軸索から発芽した後にのみ彼らはさらに樹枝状になる脊髄のラミナ（端子分岐）3。 DIIの追跡機能は、PRにあるように見えた脊髄の後根のエントリーゾーンで成長円錐を明らかにしたその分岐を示唆分割のocessが成長円錐自体4（ 図2）の分割によって引き起こされる、しかし、他のオプションはよく5として議論されている。 このビデオでは、接続されているDRGを残しE12.5マウスの脊髄を分析する方法を第一を示しています。 DIIの試料微量の以下の固定は、キャピラリーチューブから引っ張ってガラスの針を使用して、DRGに適用されます。インキュベーションステップの後、標識された脊髄は、蛍光顕微鏡を使用して、個々の軸索を分析するために反転のオープンブックの準備としてマウントされます。

齧歯類の脊髄への感覚求心性のステレオタイプの予測は、単一の軸索のトレースを通して軸索分岐を研究するために簡単にアクセス可能な実験系を提供する。

マウス胚の脊髄の全載標本での分岐軸索勉強するDRGニューロンのDII -標識

ここでは、...を用いた拡散染色により、背根神経節（DRG）ニューロンの小集団が胚性脊髄へと向かう軌跡を標識する手法を提示します。

本手順の総合的な目的は、マウス胚脊髄のホールマウント標本において、DRGニューロンの個々の軸索の分岐パターンを可視化することです。軸索分岐に関与する分子を特定するために、マウス脊髄へのDRGニューロンの投射は、軸索分岐を研究するための単純で容易かつアクセスしやすい実験系を提供します。DRGニューロンのENT軸索が脊髄の後根進入帯に到達すると、T字型またはY字型の分岐という定型的なパターンを示します。その後、生じた2本の娘軸索は、それぞれ脊髄の背外側縁で吻側または脊髄方向へと走行します。一定の待機期間を経てから、これらの幹軸索から側枝が芽生え、灰白質に侵入して脊髄の特定の層にあるリレーニューロンへと投射し、そこで終末分枝が起こります。このビデオでは、まず脊髄の解剖方法について実演します。標本を固定した後、胚齢12.5日のマウスから採取した後根神経節（DRG）に、キャピラリーチューブから引き出したガラス針を用いてdiiの微量マウントを適用します。インキュベーション工程の後、標識された脊髄を逆さまのオープンブック状に展開して固定し、蛍光顕微鏡を用いて個々の軸索を解析します。軸索の分枝は、神経接続の発達における重要な側面です。本手法を用いることで、野生型の分枝パターンと変異マウスの分枝パターンを比較することができ、それによって軸索分枝を制御する分子の特定が可能になります。まず、解剖顕微鏡をセットアップし、解剖に必要な手術器具を準備します。100 mmのシルガードコート済みペトリ皿にフィルターペーパーを1枚敷きます。次に、12ウェルプレートの各ウェル、100 mmペトリ皿、および12 mLチューブに冷PBSを注ぎ、氷上に置いておきます。2枚目の12ウェルプレートの各ウェルに、4%パラアルデヒド固定緩衝液を2 mLずつピペットで分注し、氷上に置きます。マウスから両側の子宮角を単離した後、氷冷したPBSを入れた100 mmディッシュに転移させます。胚を斬首し、胚のtociを12ウェルプレートに転移させます。Sガードディッシュ内のフィルターペーパーを数滴のPBSで湿らせ、安定性を高めるため、胚の胴体を背面が上になるようにペーパー上に配置します。約16倍の解剖顕微鏡下で、尾と四肢を体から離れるように伸ばします。中ほどから始めて、2本の精密ピンセットで脊髄上の胚の皮膚を慎重に挟みます。まず、皮膚を尾側に向かって慎重に切り裂き、次に中央から前方に向かって切り裂きます。胚が乾燥するのを防ぎ、後根神経節（DRG）が脊髄から引きちぎられないように、適宜PBSを2〜3滴滴下して胚を湿らせてください。摘出の際は、胚の右側中央から始めて尾側へ、次に前方へと進み、周囲の軟骨性の脊柱からDRGと脊髄を切り離し、緩んだ脊髄を胚から完全に分離させます。微小ピンセットで頸部を掴み、脊髄側に向かって一気

dii-labeling-drg-neurons-to-study-axonal-branching-whole-mount

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神経科学

我々は、齧歯類と異なる年齢のヒト以外の霊長類の脳スライスの神経細胞に、そのようなDIIなどの蛍光色素を、導入する遺伝子銃の使用を示します。この特定のケースでは、我々は、成体マウス（3-6ヶ月齢）と成人cynomologusサル（9-15歳）を使用します。もともと博士リヒトマン（ガンの研究室で記述されたこの技術、...

げっ歯類からの神経細胞とヒト以外の霊長類の脳スライスのDiOLISTIC標識

成人の全体のマウントの準備ショウジョウバエ</emジャイアント繊維染料注入のための>腹神経索

の形態素解析ショウジョウバエ</em遺伝モザイクを使用>幼虫末梢感覚ニューロンの樹状突起と軸索

我々は、中枢神経系における単一ニューロンを標識するための技術（CNS）の提示...

の中枢神経系における単一細胞のラベリング<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

ここでは、遺伝子操作マウスの開発における感覚軸索成長表現型を評価する効果的な方法として、全動物の末梢侵害受容器軸索突起のイメージングのために胎児マウスを遺伝子型決定し、染色し、準備するための最適化されたプロトコルを提示します。...

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げっ歯類での後根神経節の脊髄および単離の油圧押出

この研究は、後期第16段階ショウジョウバエメラノガスター胚の運動ニューロン投影を視覚化するための標準的な免疫組織化学法を詳述している。 FasII抗体で染色された固定胚のフィレット調製物は、神経発達中にモーター軸索経路探索および標的認識に必要とされる遺伝子を特徴付ける強力なツールを提供する。...

胎児運動ニューロンの軸索突起パターンの視覚化<em&gt;ショウジョウバエ</em

ニューロン-グリア相互作用、神経可塑性、関連付けのメカニズムの広い範囲を調査するこのレポートで切片培養、マウス由来後根神経節細胞の初代培養の解離の利点が強調表示されます。neuroinflammation、およびウイルス感染への応答。...

アダルト マウス後根神経節外植体し、解離細胞モデル神経可塑性とウイルス感染を含む環境の侮辱への応答を調査するため

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親油性蛍光色素を用いたショウジョウバエ胚性運動ニューロンの逆行トレーシング

ここでは、高品質な後根神経節クライオスタット切片を安定的に取得するための開発を紹介します。...

マウス背根神経節凍結切片の手順

背根神経節(DRG)は一次感覚神経細胞体を含み、末梢感覚信号を脊髄に中継します。このプロトコルは、構造的に完全な神経節の標準化された分離、解剖学的節節識別、初心者ユーザー向けの直感的な指導、そして手技的組織損傷の軽減を支援するマウスDRG解離の方法を説明しています。...

マウス背根神経節の解離と分離

学ぶマウス胚脊髄全載標本におけるDRGニューロンの軸索分岐パターン可視化法。DiI標識を用いて個別軸索のT型・Y型分岐を観察し、神経発生と再生研究の分子メカニズム解明に貢献します。

マウス胚の脊髄の全載標本での分岐軸索勉強するDRGニューロンのDII -標識

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