Name: 三次元コラーゲンマトリックスアッセイにおけるマウスのドーパミンと線条体片の解剖と文化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: 学ぶマウス胚のドーパミン性・線条体エクスプラントを三次元コラーゲンマトリックスで培養し、軸索伸長と誘引・排斥応答を解析する手法。メソストリアタルおよび線条体黒質経路の発達メカニズム解明に貢献します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

コラーゲンマトリックスのアッセイは、過去二から三十年の間に多くの異なった研究グループの作業によって開発され、改善されました。ドーパミンと線条体の外植片のためにここで説明するアプローチは非常にこれらの研究から恩恵を受ける。さらに、著者らは、線条体の外植片培養を設定する際に彼女の助けをAsheetaプラサドに感謝します。ラボでの作業は、ヒューマン·フロンティア·サイエンス·プログラム推進機構（キャリア開発賞）によって資金を供給され、健康の研究開発のオランダ機構（ZonMW-ビディとZonMW-TOP）、Europanian連合（mdDA-NeuroDev、FP7/2007-2011 、グラント222999）（RJPに）、および科学研究費オランダ機構（TopTalent、ERESに）。

1。ラット尾コラーゲンの調製<ol><li> 6月10日成体ラットの尾（それは使用するまで-20℃で尻尾を格納することが可能です）を収集。 </li><li>室温（RT）で一晩、95％エタノール中で尾を浸します。 </li></ol> ラットの尾の解剖（組織培養フード内）： （それらを使用していない場合、70％エタノールでツールを保持し、この手順全体を通して使用されるすべてのソリューション、ツール、ガラス製品は、無菌であることを確認してください） <ol start="3"><li>尾から腱を収集するには、尾の先端を切り落とした。鉗子のペアで尾の大きい方の端を保持します。ホールド、曲げや他の鉗子に近い尾を破るために鉗子の別のペアを使用しています。引き離すと腱が取り残される（ 図1A、B）。 </li><li>滅菌H 2 Oの腱を収集し、すべての腱を採取した後、滅菌H 2 Oを使用して新しいペトリ皿に移動します</li><li> 2から3腱を取るために2組を使用してそれらを細断処理滅菌H 2 Oを使用して新しいペトリ皿でCEPSこのような静脈（; 図1C腱組織は光沢のある反射である）などの非腱組織を除去する。すべての非腱組織を除去した後、それぞれの尾は腱の約100から150 mgを得られます。 </li><li>滅菌3％酢酸300mlに腱を転送し、4℃で一晩ゆっくりかき混ぜる℃、 </li><li>滅菌3％酢酸の追加200ミリリットルを追加し、4℃で一晩ゆっくりかき混ぜる℃、 </li><li> 4で120分間〜2700×gで腱を含む酢酸溶液を遠心°Cペレットの非溶解腱および非腱組織へ。 </li><li>遠心分離中に透析チューブを準備します。 <ul><li> 40cmの部分をカット</li><li> 5分間500μMEDTAで沸騰</li><li>滅菌H 2 Oでクール</li></ul></li><li>透析チューブの一方の端に結び目を作ると自動pipettを使用して組織培養フード内で氷上で遠心腱液の上清をチューブを埋めるeと25mlのピペット。気泡を生成することは避けてください。結び目は、チューブのすべての部分が（ 図1D）氷の上で無菌アルミ箔上にチューブや店舗チューブのもう一方の端を、いっぱいになるまで。 </li><li>組織培養フード内で無菌0.1X MEMは、pH 4.0の10リットルを準備します。チューブの部分にフローターを追加し、10リットルのビーカーにあらかじめ冷却0.1X MEM液にこれらを追加します。 4℃で一晩透析°Cをゆっくり撹拌しながら。 pHが低く維持しながら、この透析は、過剰な酸を削除します。 </li><li>新しい事前水冷10リットル0.1X MEMと交換して、4℃で一晩攪拌℃、 </li><li>新しい事前水冷10リットル0.1X MEMで置き換えて、前述の手順を繰り返して、4℃で一晩攪拌℃、 </li><li>滅菌した50mlチューブにアリコートコラーゲン溶液。 4℃で保存のアリコート6-12ヶ月保つ、唯一の組織培養フード内でコラーゲンの在庫を処理します。 </li><li>それは精製されたコラーゲンはコラーゲンMATRで最適な結果を得るために（0.1×MEM）で希釈する必要があるかどうかをテストすることが重要です。IXアッセイ。したがって、コラーゲン希釈系列を生成します（原液コラーゲン、1:1、1:2と1:5希釈）を、最適なコラーゲン希釈を決定するために下記のようにコラーゲンマトリックスアッセイを実行します。 </li></ol> 2。ドーパミン作動性中脳7,8の解剖<ol><li>母親の子宮からE14.5マウス胚を分析し、必要になるまで氷の上でL15培地中に保持します。 </li></ol> 後続のすべての解剖の手順は、氷の上でL15培地中で行われています。 <ol start="2"><li>脳を解剖する。 </li><li>それぞれの終脳胞の内側の部分（線条体の外植片のための終脳胞を使用）に沿っ​​て切断することによって終脳を削除します。 </li><li>髄鞘を削除します。 </li><li>脳たわみのちょうど吻側腹カットを行います。 </li><li>脳たわみのちょうど尾別の腹のカットを行います。 </li><li> microdissectioを使用して、背側正中線に沿ってrostrocaudalカットを行う基礎となる腹側中脳組織を露出するn個のナイフ。それはドーパミン作動性ニューロン（ 図2）が含まれていると腹側中脳組織をヒットしないように注意してください。 </li><li> 2 rostrocaudalカットは横方向と背側中脳組織を削除する腹側正中線と平行にしてください。 </li><li>顕微解剖ナイフを使用して、外植片に、残りの腹側中脳組織を分割します。 </li><li>使用時まで氷中に5％FBSを含むL15培地に外植片を格納します。 </li></ol> 3。線条体の解剖 すべての解剖の手順は、氷の上でL15培地中で行われています。 <ol><li>脳の解剖時に解剖し終脳胞を使用しています。 </li><li>視床と鉗子を用いて線条体の間に切断することにより視床を削除します。 </li><li>そのような嗅球など吻側構造を削除する線条体への吻側中外カットを行います。線条体に尾側に位置し、組織に対して、この手順を繰り返します。 </li><li>位置線条体のコロナのビューを取得するために、残りのスライス（ 図2）。 </li><li>線条体は、組織のやや密（より透明）の一部として認識することができます。顕微解剖ナイフを使用して、外植片に線条体およびカットを分析する。外側と内側神経節隆起の移行ニューロンを含む正中線に近く、やや暗い組織を避けることができます。 </li><li>使用時まで氷中に5％FBSを含むL15培地に外植片を格納します。 </li></ol> 4。アセンブリコラーゲンマトリックスアッセイ コラーゲンの調製（氷上ですべてのステップを冷却し、ピペットチップを使用します） <ol><li> 10倍MEMを100μlと1M重炭酸ナトリウム40μlの（NaHCO 3水溶液 ）で希釈し、コラーゲンの860μlを混合し、氷上に置きます。この時点で、コラーゲンが温まるなら、それは強固なものになります。 </li><li> 4よくヌンク皿のウェルにカバースリップに準備されたコラーゲンの20μlのドロップ（直径約5 mm）を追加するそれは30分（周囲のO 2濃度が十分である）のため°C、5％CO 2、37 CO 2インキュベーターに放置。このインキュベーションの間にコラーゲンがゼラチン化します。 </li></ol> コラーゲンゲルのセットアップ共培養 <ol start="3"><li>コラーゲンはゼラチン化した後、コラーゲンにドーパミンや線条体の外植片を転送するために200μlの先端にピペットを使用しています。 </li><li>針を使用して相互に近接して外植片を移動します。 1片（〜200から300μm）を（ 図2）の約直径の距離で、それらを離れてください。 </li><li>余分な培地を除去し、外植片の上に準備されたコラーゲンの20μlを加える。これは多くの場合、外植片が移動するようになります。 4.4で説明されるように針を用いて外植片の位置を変更します。 </li><li>コラーゲンは37℃、5％CO 2で30分間、続いて室温で15分間固化しましょう。 </li><li>コラーゲンが設定した後、電子の400μlを加えるxplant媒体と37℃CO 2インキュベーター内で2〜3日間成長℃、5％CO 2。 </li></ol> 5。免疫組織化学と定量化による解析 免疫組織化学 <ol><li>外植片を修正するには、静かに培地400μlの（これにより、4％PFAを希釈）をPBSで8％のパラホルムアルデヒド（PFA）400μlを加え、室温で1時間放置してみましょう。 </li><li>室温でPBSで3倍の15分間洗浄します。 </li><li>ブロッキングバッファー中でインキュベートする（BB、PBS + 1％FBS + 0.1％トリトンX-100）で2時間。 </li><li> 4℃でBBで一次抗体で一晩インキュベートドーパミン作動性の軸索は、線条体軸索抗DARPP32抗体（1:500）9およびすべての軸索抗βIIIチューブリン（1:3000）7を可視化するための抗チロシン水酸化酵素抗体（1:1000）7を使用してください。 </li><li>室温でPBSで5倍の1時間洗浄します。 </li><li>一晩4 BBの適切なフルオロフォア（1:500）にコンジュゲート二次抗体でインキュベート℃のこのステップからの光（例えば、アルミ箔でそれらをカバーする）への外植片の曝露を最小限に抑えます。 </li><li> 4℃でPBSで一晩洗浄°C次の日の間に数回の洗浄が続く。 </li><li>退色防止剤封入剤を長く使用してスライドを顕微鏡で外植片をマウントします。ガラス顕微鏡スライド上で〜10μlのドロップを追加します。カバースリップを取るとそっと下向きに植側に取り付け培地のドロップの上に置きます。非常に穏やかに取り付け培地のドロップでそれを下げることによって、デ·カバースリップの下に空気が入らないようにします。 </li></ol> P / D比を計算することによって定量化 <ol start="9"><li>落射蛍光顕微鏡（ 図3）を使用して、外植片のデジタル画像を取得します。 </li><li>これらの画像を使用して、近象限（隣接する植に最も近い植すなわち一部）と遠位象限（隣接explaから最も遠い片の一部を生成するために象限にそれぞれ植を分割NTの場合）（ 図2、4）。 </li><li>外植片からの両方の近位および遠位の象限における新興20長い神経突起の長さを測定します。 </li><li>個々の外植のためにP / D比を計算するために20の最長神経突起の平均長を使用しています。比&lt;1は、軸索反発を示しながら、AP / D比&gt; 1は、軸索の魅力を示しています。 </li><li>いくつかのケースでは、神経突起の密な成長は、個々の神経突起の長さの評価を防ぐことができます。このような状況では、定量化は、植の端と近位および遠位象限の軸索の成長をリードするフロント間の距離を測定することによって行うことができます。 </li></ol> 6。代表的な画像ドーパミンと線条体の外植片の成功培養した後の軸​​索の多数（図示せず）は明視野顕微鏡を用いて、可視または抗βIIIチューブリンの免疫細胞化学などによって可視化しています。これらの軸索のサブセットは、ドーパミン作動性またはsになります<html>可視化を使用して免疫細胞としてtriatal軸索（ 図3）。説明したように象限に外植片を分割し、P / D比を決定することにより、推定される軸索の魅力や反発効果が（ 図3E）を定量することができる。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3691/3691fig1.jpg" /> 図1：ラット尾の腱からコラーゲンの調製を示す写真。ラットの尾を離れて引っ張る）は腱を公開しています。 B）腱は、ロープ状のバンドルとして表示されます。 C）腱は、光沢のある白い外観によって静脈から区別することは簡単です。 D）酢酸に腱を溶解後、溶液を透析チューブに転送されます。溶存コラーゲンの寒さを保つために、チューブを氷上に滅菌したアルミ箔上に配置されます。 E 2 &quot;SRC =&quot; / files/ftp_upload/3691/3691fig2.jpg &quot;/&gt; 図2。手続きの異なる段階を示す模式図。適切な脳の領域は、解剖し、外植片を生成するためにカットされています。単一の脳と線条体の外植片は、コラーゲンマトリックスに近接して配置され、37℃で48〜72時間のために成長して残っている軸索は、蛍光免疫組織化学によって可視化しており、P / D比はchemotropic応答を定量化するために計算されます。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3691/3691fig3.jpg" /> 図3。コラーゲンマトリックス培養で軸索成長を示す代表的な結果。軸索伸長を明らかにし、抗チロシンヒドロキシラーゼ抗体で染色したA）中脳片。点線は、隣接した外植片を示します。表示個々の神経突起と成長円錐のB）倍率（矢印）。 C）線条体片は抗DARPP32で染色した。 D）Cの倍率は、個々の神経突起を示す。 E）の例P / D比の定量。外植片は、同じ象限に分かれています。遠象限は、それから離れに直面している間に近象限は、隣接する外植片に直面している。スケールバーは100μmを示す。

<ol><li>van den Heuvel, D. M., Pasterkamp, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+connected+in+the+dopamine+system%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Getting connected in the dopamine system.</a> Prog. Neurobiol. 85, 75-93 (2008).</li>
<li>Lobo, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+profiling+of+striatonigral+and+striatopallidal+medium+spiny+neurons+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Rev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Molecular profiling of striatonigral and striatopallidal medium spiny neurons past, present, and future.</a> Int. Rev. Neurobiol. 89, 1-35 (2009).</li>
<li>Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of axon guidance.</a> Science. 298, 1959-1964 (2002).</li>
<li>Chilton, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecules+mechanisms+of+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecules mechanisms of axon guidance.</a> Dev. Biol. 292, 13-24 (2006).</li>
<li>Lumsden, A. G., Davies, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotropic+effect+of+specific+target+epithelium+in+the+developing+mammalian+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system.</a> Nature. 323, 538-539 (1986).</li>
<li>Tessier-Lavigne, M., Placzek, M., Lumsden, A. G., Dodd, J., Jessel, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotropic+guidance+of+developing+axons+in+the+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemotropic guidance of developing axons in the mammalian central nervous system.</a> Nature. 336, 775-778 (1988).</li>
<li>Kolk, S. M., Gunput, R. A., Tran, T. S., van den Heuvel, D. M., Prasad, A. A., Hellemons, A. J., Adolfs, Y., Ginty, D. D., Kolodkin, A. L., Burbach, J. P., Smidt, M. P., Pasterkamp, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semaphorin+3F+is+a+bifunctional+guidance+cue+for+dopaminergic+axons+and+controls+their+fasciculation%2C+channeling%2C+rostral+growth%2C+and+intracortical+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Semaphorin 3F is a bifunctional guidance cue for dopaminergic axons and controls their fasciculation, channeling, rostral growth, and intracortical targeting.</a> J. Neurosci. 29, 12542-12557 (2009).</li>
<li>Fenstermaker, A. G., Prasad, A. A., Bechara, A., Adolfs, Y., Tissir, F., Goffinet, A., Zou, Y., Pasterkamp, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2Fplanar+cell+polarity+signaling+controls+the+anterior-posterior+organization+of+monoaminergic+axons+in+the+brainstem%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Wnt/planar cell polarity signaling controls the anterior-posterior organization of monoaminergic axons in the brainstem.</a> J. Neurosci. 30, 16053-16064 (2010).</li>
<li>Arlotta, P., Molyneaux, B. J., Jabaudon, D., Yoshida, Y., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ctip2+controls+the+differentiation+of+medium+spiny+neurons+and+the+establishment+of+the+cellular+architecture+of+the+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ctip2 controls the differentiation of medium spiny neurons and the establishment of the cellular architecture of the striatum.</a> J. Neurosci. 28, 622-632 (2008).</li>
<li>De Wit, J., Toonen, R. F., Verhage, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-dependent+local+retention+of+secretory+vesicle+cargo+in+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Matrix-dependent local retention of secretory vesicle cargo in cortical neurons.</a> J. Neurosci. 29, 23-37 (2009).</li>
<li>Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+cultures%3A+a+technique+has+come+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice cultures: a technique has come of age.</a> Trends Neurosci. 20, 471-477 (1997).</li>
</ol>

我々は、開示することは何もありません。

コラーゲンマトリックスアッセイは、ここで説明する（例えば、参照する5-8を参照）軸索ガイダンス分子と神経系の様々を調査するために過去数十年の多くの異なるラボで使用され、改善されました。これらの研究は、このアッセイは、効果と異なる（中間）の標的組織から分泌される軸索ガイダンス分子の調節を研究するための強力なツールであることが示されている。 しかし、コラーゲンマトリックスは、細胞外環境（ECM）の代替であることに留意する必要がありますが、明らかにECMに通常存在する多くのタンパク質が不足しています。 ECMの成分は、軸索ガイダンス分子10の効果に影響を及ぼすことが知られています。それにもかかわらず、コラーゲンマトリックスアッセイは、in vitroおよび他の組織培養の手法（例えば、器官スライス培養11）や遺伝子組み換え動物モデルの解析との組み合わせで基本的な分子機構を調べるために特に有用である。 </p&gt; いくつかの要因がコラーゲンマトリックスアッセイの成功を決定します。...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>ウシ胎仔血清</td><td> BioWhittaker </td><td> 14-801f未</td><td></td></tr><tr><td>グルタミン（200mMの） </td><td> PAA </td><td> M11-004 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> VWRインターナショナル</td><td> 441476L </td><td></td></tr><tr><td> β-メルカプトエタノール</td><td>メルク</td><td> 444203 </td><td></td></tr><tr><td>最小必須培地（MEM） </td><td>ギブコ</td><td> 61100-087 </td><td></td></tr><tr><td> Neurobasal </td><td>ギブコ</td><td> 21103-049 </td><td></td></tr><tr><td> B27 </td><td>ギブコ</td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td>リーボビッツのL-15培地</td><td>ギブコ</td><td&gt; 11415-049 </td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン - ストレプトマイシン</td><td>ギブコ</td><td> 15070-063 </td><td></td></tr><tr><td> Gold褪色防止試薬を延長</td><td>インビトロジェン</td><td> P36930 </td><td></td></tr><tr><td>透析チューブ</td><td>スペクトラムラボ</td><td> 132660 </td><td></td></tr><tr><td>ウサギ抗チロシンヒドロキシラーゼ</td><td> PEL-FREEZ </td><td> P40101-0 </td><td></td></tr><tr><td>ウサギ抗DARPP32（H-62） </td><td>サンタクルス</td><td> SC-11365 </td><td></td></tr><tr><td>マウス抗βIIIチューブリン</td><td>シグマ</td><td> T8660 </td><td></td></tr><tr><td>のAlexa Fluor®は、二次抗体を標識した</td><td>インビトロジェン</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

三次元コラーゲンマトリックスアッセイにおけるマウスのドーパミンと線条体片の解剖と文化

Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

線条体1を含む終脳のいくつかの分野に向かって内側前脳束を経由して中脳ドーパミン（mdDA）ニューロンのプロジェクト。相互に、線条体黒質（直接）経路を生み出す線条体の中型有棘ニューロンは黒質2を支配する。これらの軸索路の開発は、神経突起によって、または（中間）のターゲット領域3,4から放出される分子を含む軸索成長とガイダンスの手がかりの茄多の組合せの行動に依存しています。これらの可溶性因子は、細胞外環境を模倣した軸索の三次元基板を提供するコラーゲンマトリックスで培養mdDA、そして/または、線条体の外植片によって in vitro で検討することができます。さらに、コラーゲンマトリックス（例えば、参考文献5および6を参照）近傍に配置された他の外植片または細胞から放出されるタンパク質の比較的安定した勾配の形成が可能になります。ここでは、PUR用のメソッドを記述するコラーゲンゲルとその後の免疫組織化学的および定量分析でラット尾コラーゲン、ドーパミンと線条体の外植片の顕微解剖、自分たちの文化のification。最初に、E14.5マウス胚の脳は、絶縁されており、ドーパミンと線条体の外植片は、マイクロダイセクションされています。これらの外植片は、その後の（共）、in vitroで 48から72時間のカバースリップ上にコラーゲンゲル内で培養されています。その後、軸索突起が定量化されるニューロンマーカー（例えば、チロシンヒドロキシラーゼ、DARPP32、またはβIIIチューブリン）と、軸索の成長と魅力的または反発軸索応答を用いて可視化されています。この神経細胞の調製は、開発時にmesostriatalと線条体黒質軸索成長とガイダンスの細胞および分子メカニズムのin vitro試験のための便利なツールです。このアッセイを使用して、それがドーパミンと線条体軸索のために他の（中間）の目標を評価するために、または特定の分子の手がかりをテストすることも可能です。

中脳ドーパミン系と線条体からの外植片は、のためにコラーゲンマトリックスアッセイで使用されている<em&gt; in vitroで</emmesostriatalと線条体黒質経路の開発&gt;分析。このアッセイでは軸索伸長やガイダンスを操作して定量することができる。また、他の地域や分子手がかりを評価するために変更することができます。

中脳ドパミン（mdDA）ニューロンは、内側前脳束を介して線条体を含む終脳のいくつかの領域に投射している1。...

本手順の全体的な目的は、中脳辺縁系および黒質線条体路の発達を研究するために、ドーパミン作動性ニューロンおよび線条体の説明切片（explant）を培養することです。まず、E 14.5のマウス胚から線条体とドーパミン作動性中脳を微小解剖します。次に、解剖した組織から適切なサイズの切片を切り出します。次に、外植片をコラーゲンゲル内に互いに近接するように配置します。最後のステップは、軸索の伸展を促すため、これらの外植片を2〜3日間培養することです。最終的に、特定の神経細胞マーカーを用いて免疫組織化学染色を行い、軸索の誘引的または反発的な反応を可視化および定量化します。この手法の既存の方法（遊離細胞培養や2つのDX外植片培養など）に対する主な利点は、コラーゲンマトリックスが細胞外環境を模倣したエキソン用の三次元基質を提供することです。さらに、コラーゲンマトリックスにより、X外植片またはその近傍に配置された細胞から放出されるタンパク質の比較的安定した勾配を形成させることができます。この手順の実演は、私の研究室の大学院生であるAva SmithとFrancescaの2名が行います。この手順を開始するために、母親の子宮からE 14.5のマウス胚を摘出します。使用するまで、胚を氷上のL 15培地で保持してください。次に、胚を顕微鏡下へ移し、胚から脳を分離します。次に、各頭胞の内側部分に沿って切開し、頭部を除去します。その後、髄膜鞘を除去します。正中頭屈のすぐ吻側で、背腹方向の切開を行います。続いて、中脳屈曲部のすぐ側方で、背側から腹側に向かってもう一度切開します。次に、マイクロディセクションナイフを用いて背側正中線に沿って後方へ切開し、下層の腹側中脳組織を露出させます。ドパミン作動性ニューロンが含まれているため、腹側中脳組織を傷つけないように注意してください。その後、背側中脳組織を除去するため、腹側正中線に対して外側かつ平行に2本の吻側切開（coddle cuts）を加えます。次に、マイクロディセクションナイフを用いて、残りの腹側中脳組織をX個の外植片に分割します。これらX個の外植片を、5% FBSを含むL 15培地に入れ、使用時まで氷上で保存します。次に、中脳の解剖時に採取しておいたタロンの頭部水胞を顕微鏡下へ移します。ピンセットを用いて、視床と線条体の間を切断し、視床を除去します。その後、線条体の吻側で正中線に沿った外側方向への切断を行い、嗅球などの吻側構造を除去します。次に、線条体の隣に位置する組織についてもこの手順を繰り返します。その後、線条体の冠状断面を得るように、残りのスライスを配置します。線条体は、組織の中でわずかに透明度が高い部分として認識できます。次に線条体を単離し、マイクロディセクションナイフを用いてインプラント状に切断します。その際、外側および内側神経節丘から遊走してくるニューロンを含む、正中線に近いわずかに色の濃い組織は避けてください。4ウェルディッシュのウェル内にあるカバーガラスの上に、調製したコラーゲンを1滴加えます。37 °C、5% 二酸化炭素のインキュベーター内で 30 分間保持します。このインキュベーション中にコラーゲンがゼラチン化します。コラーゲンのゼラチン化後、200 µL チップを装着したピペットを使用して、ドーパミン作動性または sal の外植片をコラーゲンに転移させます。次に、針を用いて外植体を互いに近づけます。外植体1つの直径分ほどの距離を空けて配置してください。その後、余分な培地を取り除きます。調製したコラーゲンを外植片の上に20 µL添加します。これにより外植片が移動することがよくあります。針を用いて外植片の位置を調整してください。コラーゲンを室温で15分間放置し、凝固させます。その後、5%二酸化炭素を供給した37°Cのインキュベーターに30分間移します。コラーゲンが固まった後、400 µLの外植体培地を加え、37°Cのインキュベーターで2〜3日間培養します。標本を緩やかに固定するため、4%パラホルムアルデヒドを加え、室温で1時間保持します。1時間後、室温のPBSで15分間ずつ3回洗浄します。次にPBSを除去し、ブロッキングバッファーで2時間インキュベートします。その後、一次抗体とブロッキングバッファーとともに4°Cで一晩インキュベートします。翌日、室温でPBSによる洗浄を1回につき1時間、計5回行います。その後、適切な蛍光標識が結合した二次抗体でインキュベートします。ブロッキング緩衝液中で4°Cにて一晩静置します。このステップ以降は、光への曝露を最小限に抑えるため、外植体をアルミホイルで覆ってください。4°CのPBSで一晩洗浄し、翌日にさらに数回洗浄します。次に、組織片を下方に向けて、長期保存用アンチフェード封入剤を用いて顕微鏡スライドに封入します。気泡が入らないよう、封入剤の上にカバーガラスを非常にゆっくりと被せます。その後、エピ蛍光顕微鏡を用いてx個の組織片のデジタル画像を撮影します。これらの画像を使用して、各X外植片を4等分し、近位象限と遠位象限を作成します。その後、近位および遠位の両象限において、X外植片から伸びている上位20本の最も長いニューライトの長さを測定します。これら上位20本のニューライトの平均長を用いて、各外植片の近位・遠位比を算出します。近位遠位比が1より大きい場合は軸索の誘引を示し、1より小さい場合は軸索の反発を示します。ここでは、抗チロシン水酸化酵素抗体で染色し、軸索の伸展を明らかにした中脳切片を示します。点線は隣接する外植片を示しています。ここでの矢印は、個々の神経突起と成長円錐を示しています。以下は、近位・遠位比の定量の例です。これらは等分された4つの象限に分割されます。近位象限は隣接するX外植片に面しており、遠位象限はそこから離れた方向を向いています。このビデオを視聴することで、中脳辺縁系および黒質線条体経路の発達を調査し、これらの経路の形成に関与する分子メカニズムを研究するための、ドーパミン作動性ニューロンおよび線条体外植片の共培養方法について十分に理解できるはずです。

dissection-culture-mouse-dopaminergic-striatal-explants-three

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このアッセイは、交連軸索の向きを変更、シグナル伝達分子、ここに骨形成タンパク質7（BMP7）の能力を評価する。胚の背側脊髄の外植片は、COS細胞の分泌候補増殖因子の集合体に隣接して培養する。外植片の中で成長しているReoriented交連軸索は、免疫組織化学により可視化。...

胚脊髄交連軸索アンテナの向きに拡散性のシグナル伝達分子の能力を検定する

神経突起伸長アッセイのためのコラーゲンゲルのチックStatoacousticガングリオンと脊髄の外植片の解剖と文化

このビデオでは、マウスの胚性脳組織からドーパミン作動性ニューロンを培養する方法の概要を示しています。このプロセスには、中脳をタンパク質分解酵素で処理し、細胞を剥離し、抗生物質を含む栄養豊富な培地でポリマーコーティングされたカバーガラスで細胞を培養し、成長と長期的な生存率を高めることが含まれます。...

マウス胚性脳組織からのドーパミン作動性ニューロンの培養と維持

このビデオは、マウス胚の中脳からドーパミンニューロンを分離し、培養するプロセスを示しています。孤立した腹側中脳床は、酵素を使用して解離されます。得られたドーパミンニューロンは回収され、マルチウェルプレート内のマイクロアイランドに移されます。細胞をドーパミンニューロン培地とインキュベートして、細胞をマイクロアイランド内で高密度に維持します。...

初代胚性マウス中脳ドーパミンニューロンの単離と培養

ここでは、脳室下帯と個々の成体マウスの歯状回から、付着性単層またはニューロスフェアのいずれかとして、神経前駆細胞培養を同時に生成するための詳細なプロトコルを記述します。...

マウスを一回、二つの文化：個々のマウスの二つの神経原性のゾーンから成体神経幹細胞の単離および培養

ドーパミン作動性ニューロンは、脳内で重要な調節役割を果たしています。それらの喪失はパーキンソン病に関連しています。このビデオでは、胚性マウス中脳から中枢ドーパミン作動性ニューロンの初代培養物を生成する方法を示します。このような培養物は、これらのニューロンがさまざまなストレスに対して非常に脆弱であることを研究するのに役立ちます。...

マウスドーパミン作動性ニューロンの初代培養

脳の複雑な行動についての洞察には、高度な研究ツールが必要です。ここでは、脳のような構造に似た神経組織の新しいシルクコラーゲンベースの3Dエンジニアリングモデルを示します。このモデルは、ニューロンネットワークの組み立て、軸索誘導、細胞間相互作用、および電気的活動の研究に使用できます。...

偏神経組織のエンジニア3Dシルクコラーゲンベースモデル

パーキンソン病（PD）では、黒質（SNC）ドーパミン作動性ニューロンは、運動機能障害につながる、退化します。ここでは、チロシンヒドロキシラーゼ（TH）プロモーター配列によって駆動されるeGFPを発現するマウスから腹側中脳の神経細胞を培養する培養物から個々の蛍光ニューロンを収穫し、RNA-seqのを使用して、それらのトランスクリプトームを測定するためのプロトコルを報告しています。...

RNA配列決定およびTH-プロモーター駆動EGFP発現を使用して中脳培養における生活ドーパミン作動性ニューロンの信頼性の高い同定

ニューロン-グリア相互作用、神経可塑性、関連付けのメカニズムの広い範囲を調査するこのレポートで切片培養、マウス由来後根神経節細胞の初代培養の解離の利点が強調表示されます。neuroinflammation、およびウイルス感染への応答。...

アダルト マウス後根神経節外植体し、解離細胞モデル神経可塑性とウイルス感染を含む環境の侮辱への応答を調査するため

ここでは、自己組織化ペプチドのひと関節軟骨細胞の脱分化型軟骨への分化を促進する足場の 3 D 培養システムを取得するためのプロトコルを提案する.

三次元ペプチド足場で哺乳動物の細胞を培養

ここでは、3Dマトリックスで軸を成長させる行動を分析し、その自然な発達を模倣する方法を提供する。...

神経系発達中の軸の成長と挙動を解析する3Dコラーゲンベースのヒドロゲルの生成

学ぶマウス胚のドーパミン性・線条体エクスプラントを三次元コラーゲンマトリックスで培養し、軸索伸長と誘引・排斥応答を解析する手法。メソストリアタルおよび線条体黒質経路の発達メカニズム解明に貢献します。

三次元コラーゲンマトリックスアッセイにおけるマウスのドーパミンと線条体片の解剖と文化

さらに動画を探す