三次元コラーゲンマトリックスアッセイにおけるマウスのドーパミンと線条体片の解剖と文化

本手順の全体的な目的は、中脳辺縁系および黒質線条体路の発達を研究するために、ドーパミン作動性ニューロンおよび線条体の説明切片（explant）を培養することです。まず、E 14.5のマウス胚から線条体とドーパミン作動性中脳を微小解剖します。次に、解剖した組織から適切なサイズの切片を切り出します。

次に、外植片をコラーゲンゲル内に互いに近接するように配置します。最後のステップは、軸索の伸展を促すため、これらの外植片を2〜3日間培養することです。最終的に、特定の神経細胞マーカーを用いて免疫組織化学染色を行い、軸索の誘引的または反発的な反応を可視化および定量化します。

この手法の既存の方法（遊離細胞培養や2つのDX外植片培養など）に対する主な利点は、コラーゲンマトリックスが細胞外環境を模倣したエキソン用の三次元基質を提供することです。さらに、コラーゲンマトリックスにより、X外植片またはその近傍に配置された細胞から放出されるタンパク質の比較的安定した勾配を形成させることができます。この手順の実演は、私の研究室の大学院生であるAva SmithとFrancescaの2名が行います。

この手順を開始するために、母親の子宮からE 14.5のマウス胚を摘出します。使用するまで、胚を氷上のL 15培地で保持してください。次に、胚を顕微鏡下へ移し、胚から脳を分離します。

次に、各頭胞の内側部分に沿って切開し、頭部を除去します。その後、髄膜鞘を除去します。正中頭屈のすぐ吻側で、背腹方向の切開を行います。

続いて、中脳屈曲部のすぐ側方で、背側から腹側に向かってもう一度切開します。次に、マイクロディセクションナイフを用いて背側正中線に沿って後方へ切開し、下層の腹側中脳組織を露出させます。ドパミン作動性ニューロンが含まれているため、腹側中脳組織を傷つけないように注意してください。

その後、背側中脳組織を除去するため、腹側正中線に対して外側かつ平行に2本の吻側切開（coddle cuts）を加えます。次に、マイクロディセクションナイフを用いて、残りの腹側中脳組織をX個の外植片に分割します。これらX個の外植片を、5% FBSを含むL 15培地に入れ、使用時まで氷上で保存します。

次に、中脳の解剖時に採取しておいたタロンの頭部水胞を顕微鏡下へ移します。ピンセットを用いて、視床と線条体の間を切断し、視床を除去します。その後、線条体の吻側で正中線に沿った外側方向への切断を行い、嗅球などの吻側構造を除去します。

次に、線条体の隣に位置する組織についてもこの手順を繰り返します。その後、線条体の冠状断面を得るように、残りのスライスを配置します。線条体は、組織の中でわずかに透明度が高い部分として認識できます。

次に線条体を単離し、マイクロディセクションナイフを用いてインプラント状に切断します。その際、外側および内側神経節丘から遊走してくるニューロンを含む、正中線に近いわずかに色の濃い組織は避けてください。4ウェルディッシュのウェル内にあるカバーガラスの上に、調製したコラーゲンを1滴加えます。

37 °C、5% 二酸化炭素のインキュベーター内で 30 分間保持します。このインキュベーション中にコラーゲンがゼラチン化します。コラーゲンのゼラチン化後、200 µL チップを装着したピペットを使用して、ドーパミン作動性または sal の外植片をコラーゲンに転移させます。

次に、針を用いて外植体を互いに近づけます。外植体1つの直径分ほどの距離を空けて配置してください。その後、余分な培地を取り除きます。

調製したコラーゲンを外植片の上に20 µL添加します。これにより外植片が移動することがよくあります。針を用いて外植片の位置を調整してください。

コラーゲンを室温で15分間放置し、凝固させます。その後、5%二酸化炭素を供給した37°Cのインキュベーターに30分間移します。コラーゲンが固まった後、400 µLの外植体培地を加え、37°Cのインキュベーターで2〜3日間培養します。

標本を緩やかに固定するため、4%パラホルムアルデヒドを加え、室温で1時間保持します。1時間後、室温のPBSで15分間ずつ3回洗浄します。

次にPBSを除去し、ブロッキングバッファーで2時間インキュベートします。その後、一次抗体とブロッキングバッファーとともに4°Cで一晩インキュベートします。翌日、室温でPBSによる洗浄を1回につき1時間、計5回行います。その後、適切な蛍光標識が結合した二次抗体でインキュベートします。

ブロッキング緩衝液中で4°Cにて一晩静置します。このステップ以降は、光への曝露を最小限に抑えるため、外植体をアルミホイルで覆ってください。4°CのPBSで一晩洗浄し、翌日にさらに数回洗浄します。

次に、組織片を下方に向けて、長期保存用アンチフェード封入剤を用いて顕微鏡スライドに封入します。気泡が入らないよう、封入剤の上にカバーガラスを非常にゆっくりと被せます。その後、エピ蛍光顕微鏡を用いてx個の組織片のデジタル画像を撮影します。

これらの画像を使用して、各X外植片を4等分し、近位象限と遠位象限を作成します。その後、近位および遠位の両象限において、X外植片から伸びている上位20本の最も長いニューライトの長さを測定します。これら上位20本のニューライトの平均長を用いて、各外植片の近位・遠位比を算出します。

近位遠位比が1より大きい場合は軸索の誘引を示し、1より小さい場合は軸索の反発を示します。ここでは、抗チロシン水酸化酵素抗体で染色し、軸索の伸展を明らかにした中脳切片を示します。

点線は隣接する外植片を示しています。ここでの矢印は、個々の神経突起と成長円錐を示しています。以下は、近位・遠位比の定量の例です。

これらは等分された4つの象限に分割されます。近位象限は隣接するX外植片に面しており、遠位象限はそこから離れた方向を向いています。このビデオを視聴することで、中脳辺縁系および黒質線条体経路の発達を調査し、これらの経路の形成に関与する分子メカニズムを研究するための、ドーパミン作動性ニューロンおよび線条体外植片の共培養方法について十分に理解できるはずです。