移植片対宿主病の誘導および T細胞のモニタリング
2012年8月29日
マウス骨髄移植は、ヒトにおいて、移植片対宿主病を支配する免疫のメカニズムを研究するために広く使われているテクニックです。 T細胞の人身売買パターンを監視する機能移植片対宿主病の間にT細胞応答の開発や永続化の詳細な分析が可能になります。
この手順の目的は、移植片と宿主病の間のT細胞の輸送と蓄積パターンを研究することです。これは、最初にドナーマウスから骨髄と細胞を単離することによって達成されます。2番目のステップは、目的の細胞集団を精製し、移植の準備
をすることです。次に、精製した細胞集団を結合し、放射線レシピエントマウスに移植します。最後のステップは、レシピエントマウスのT細胞の輸送と蓄積のパターンを視覚化することです。最終的に、生物発光イメージングを使用して、GVHD中のT細胞の輸送と蓄積のパターンを示します。
既存の技術に対する生物発光イメージングの主な利点は、既存の技術のように特定の部位ではなく、マウス全体を通してリンパ球を検出する手段を可能にすることである。マウスは、骨髄および細胞移植の前に致死的な放射線治療を受けなければなりません。使用する照射器に対応したマイクロアイソレーターケージに最大10匹のレシピエントマウスを入れます。
次に、マウスにセシウム1 37源またはRS 2000(初期線量4.5°Cのラジエーター)のいずれかを照射します。3時間後、マウスに再度4.5°Cを照射し、合計9°Cの放射線を照射します。2回目の投与後、移植時まで、レシピエントマウスをpH3の酸性水を入れたマイクロアイソレーターケージに保存します。
酸性水は、レシピエントの日和見的な愛情を制御してPLE細胞を取得するのに役立ちます。安楽死させたドナーマウスの皮膚を切断します 脾臓の位置を特定するために、胸郭の真下にある正中線から約2センチメートルの右側に垂直に2センチメートルの切開を行います。次に、脾臓を取り出し、1640 RPMIと5%FBSを含むシャーレの40マイクロリットルメッシュグリーンに入れます。
単一細胞懸濁液を調製するには、シリンジプランジャーを使用して、脾臓全体がメッシュスクリーンを通過するまで脾臓をバラバラにします。このプロセスを野生型およびluxe陽性ドナーマウスごとに繰り返します。すべての野生型単細胞懸濁液を1本の50ミリリットルコニカルチューブに集め、すべての豪華なポジティブシングルセル懸濁液を別の50ミリリットルのコニカルチューブに集めます。
懸濁液をそれぞれのチューブに集めたら、細胞を遠心分離し、ペレットを5%FBSで1640 RPMIに懸濁します。次に、セルを数えます。
ドナーマウスの片方の後肢から皮膚を切除し、頑丈なはさみを使用して大腿骨と脛骨からできるだけ多くの筋肉組織を慎重に切り取ります。大腿骨を股関節で切り取り、後肢を切除します。次に、脛骨腓骨挿入部のすぐ下のリア毛穴を切り取ります。
残っている筋肉組織を慎重に取り除き、腓骨を切り取ります。腓骨には骨髄がほとんどないので、捨てることができます。次に、後肢を5%FBS溶液を含む冷たい1640RPMIに入れ、2番目の後肢についてもこのプロセスを繰り返します。
すべての後肢が除去されるまで、後肢をメディアに保管します。各マウスは、6つの骨髄細胞に対して、20×10から6倍から40倍の間に収量するべきである。骨髄摘出の準備として、冷たくなったR-P-M-I-F-B-S培地から後肢を1枚取り出し、1ミリリットルの冷培地が入った大きなシャーレに入れます。
各後肢から膝関節を切り取ります。次に、27〜29ゲージの皮下針を10ミリリットルの注射器に取り付け、針を脛骨に挿入します。脛骨の内部から赤い材料がすべて取り除かれるまで、シリンジを押し下げます。
このプロセスを大腿骨で繰り返します。骨髄がない残りの骨は捨てます。このプロセスを2番目の後肢で繰り返します。
骨髄を含む培地を大きなシャーレにピペットで移します。シリンジ、プランジャー、40マイクロリットルのメッシュスクリーンを使用して単一細胞懸濁液を調製するために、骨髄が完全にスクリーンを通過するまで骨髄をバラバラにします。次に、単一細胞懸濁液を50ミリリットルの円錐管にピペットで移し、このチューブを氷上に置くと、メーカーのプロトコルに従って骨髄からCD3つの陽性細胞が枯渇します。
骨髄のCDが枯渇すると、3つの陽性細胞が残りの細胞を洗浄し、SP細胞と骨髄細胞を遠心分離して洗浄し、骨髄細胞は細胞と骨髄細胞を結合しません。ヘモサイトメーターを使用して細胞をカウントします。次に、仰臥位のリースをすべて取り外します。
骨髄細胞を1,000万個の骨髄細胞あたり最大バッファー100マイクロリットルに懸濁します。製造元のプロトコルを使用して、CD 3 の枯渇を続行します。次に、CDの3つの枯渇した骨髄細胞を滅菌PBSで3回洗浄します。
細胞を数え、適切な量として再懸濁して、7つの細胞に10個を注入します。Resusは、野生型ペレットを7つの細胞に10個あたりの最大緩衝液90マイクロリットルで懸濁します。CD 8 T細胞の枯渇に進みます。
製造業者のプロトコルに従って、7つの細胞に10個あたりの最大緩衝液40マイクロリットルでリュクスポジティブペレットを再懸濁します。続いて、CD 8 T細胞の精製を行います。製造業者のプロトコルによれば、各細胞集団をカウントし、無菌PBSの1ミリリットルで各集団を3回洗浄し、各集団を適切な量に再懸濁して18回10個を6個のCDに注入し、8個の枯渇した野生型PLE細胞と2倍10個から6個のLに2個G85B6個の精製CD8個のT細胞を注入する準備をします。
まず、7個のCDのうち10個のうち10個を18回から6個に10回に10個、CD型が8個に枯渇した細胞を、2倍10個から6個のLに2個、G85Bの6ルクス陽性精製CD8個のT細胞をマイクロ遠心チューブに混ぜ合わせる。次に、結合した細胞を滅菌PBSとResusで洗浄します。それらを300マイクロリットルの滅菌PBSに懸濁します。
次に、28ゲージの針を使用して、細胞調製物をレシピエントマウスの尾静脈に注入します。注入したレシピエントマウスを酸性水を入れたマイクロアイソレーターケージに保管してください。表1に示すGVHDスコアリングシステムを使用して、マウスを毎日採点します。
マウスにルシフェリアンを注入し、麻酔をかけたマウスをローベニングで5分間イメージングした後、生体画像ソフトウェアを用いてデータを解析します。関心領域は、生きた画像ソフトウェアを使用して作成でき、各関心領域から放出される磁束を計算することで光放射率を定量化できます。こちらは、1996年にCook Etol社が開発したGVHDスコアリングシステムです。
マウスは、左側の各基準で毎日採点する必要があります。各マウスには、各基準に対して 0 から 2 のスコアが与えられ、合計スコアは、表示されているすべての個々のスコアの合計です。ここでは、7つの骨髄細胞のみに10を移植したレシピエントマウス、または枯渇した野生型細胞に10×10を6個、精製したルース陽性のCD8T細胞に10×2を移植したレシピエントマウスの臨床スコアと生存データを示します。
ここでは、骨髄単独またはCD8T枯渇野生型細胞および精製された緩性陽性CD8T細胞のレシピエントの臨床スコアデータが示され、骨髄単独またはCD8T細胞枯渇野生型BLE細胞および緩性陽性CD8T細胞のレシピエントの生存データがここに示されています。これらは、4ミリグラムのD Luciferを注入し、Enogen IVISで5分間の小回転でイメージングした後のレシピエントマウスの生物発光画像です。疑似カラー画像が表示され、紫は低強度を表し、赤は高強度を表します。
関心領域をマウス全体の周囲に描画し、全フラックスまたは定量化しました。ここに示されているのは、4ミリグラムのdルシファーを注入した後のレシピエントマウスの生物発光画像であり、エノゲンIVISを使用して5分間の小さな回転でイメージングしたものです。前の画像と同様に、疑似カラー画像が表示されており、紫は低強度、赤は高強度のパネルを表しています。
A、B、Cは、それぞれ移植後4日目、6日目、8日目の画像診断を表しています。この手順に続いて、フローサイトメトリーなどの他の方法を使用して、腸に浸潤するT細胞をさらに特徴付けることができます。
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概要
本記事では、移植片対宿主病（GVHD）におけるT細胞のトラフィッキングパターンの研究を目的とした、マウス骨髄移植の手法について解説します。この手法により、T細胞応答のin vivoモニタリングが可能となり、免疫学的メカニズムに関する知見を得ることができます。
研究の主要構成要素
科学分野
- 免疫学
- 移植生物学
- 細胞ダイナミクス
背景
- 移植片対宿主病は、骨髄移植における重大な合併症である。
- 移植成績を向上させるには、T細胞の挙動を理解することが極めて重要である。
- 生体イメージング技術は、免疫応答の研究を促進する。
- 免疫学の前臨床研究では、マウスモデルが一般的に用いられている。
研究目的
- GVHDにおけるT細胞のトラフィッキングおよび蓄積を調査する。
- 移植片対宿主相互作用に関与する免疫学的機序を解明する。
- 生物発光イメージングを利用して、T細胞のダイナミクスをリアルタイムで観察する。
使用した手法
- ドナーマウスからの骨髄および免疫細胞の単離。
- 移植に用いる特定の細胞集団の精製。
- 精製した細胞の放射線照射済みレシピエントマウスへの移植。
- 生物発光イメージング技術を用いたT細胞のトラフィッキングの可視化。
主要な結果
- レシピエントマウスにおけるT細胞蓄積パターンのモニタリングに成功。
- GVHDにおけるT細胞応答のダイナミクスに関する知見の獲得。
- 免疫細胞の追跡におけるバイオルミネッセンスイメージングの有効性の実証。
- 移植片対宿主病のメカニズムの理解への寄与。
結論
- 本研究は、GVHDにおけるT細胞の挙動に関する貴重なデータを提供します。
- 得られた知見は、臨床現場におけるGVHDを軽減するための戦略に寄与する可能性があります。
- 今後の研究では、これらの手法を応用して他の免疫学的課題を探索できると考えられます。
よくある質問
産業界における重要性
本手法により、生体内におけるT細胞トラフィッキングの非侵襲的かつ縦断的なモニタリングが可能となり、移植片対宿主病（GVHD）の病態生理に関する機序的な知見が得られます。生物発光イメージングを用いて特定のT細胞サブセットを追跡することで、研究者はターゲットバリデーションのリスクを軽減し、免疫調節候補薬の評価における予測信頼性を向上させることができます。このアプローチは、細胞動態と臨床的なGVHD発症を結びつけることで初期の探索ワークフローを支援し、免疫療法の開発におけるgo/no-go判断に有用な情報を提供します。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 生体内で定義されたT細胞サブセットを追跡することで、GVHDにおける病原性役割を明らかにし、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用上の価値： 非侵襲的な縦断的イメージングにより、終点解析への依存を低減し、生物学的なリスク低減を支援する。
- 予測的価値： T細胞の集積パターンを臨床的なGVHDスコアおよび生存転帰と相関させることで、ターゲットに対する信頼性を高める。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値：再現性のあるT細胞トラフィッキングのリードアウトを確立することで、下流の免疫調節剤スクリーニングに向けた検証済みの生物学的システムを調製します。
- 運用の価値：定義された関心領域からの定量可能な生物発光フラックス測定により、アッセイの標準化を可能にします。
- 拡張性の価値：複数のT細胞サブセットおよびタイムポイントにわたるプラットフォームの再利用を容易にし、化合物の比較評価をサポートします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値： MHCマッチしたマウス移植およびサブセット特異的な追跡を通じてヒトGVHDの病態生理をモデル化し、疾患への関連性を維持する。
- トランスレーショナルな連続性： 臨床スコアリングおよび生存エンドポイントとの相関により、探索段階のイメージングデータを前臨床検証へと結びつける。
- リスク調整済みの前進： GVHDの発症を遅延または予防させるT細胞サブセットを特定することで、前臨床段階におけるgo/no-go判断の根拠を提供する。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、ターゲットのバリデーションからリード化合物の特定、そして前臨床評価に至る創薬の連続的なプロセスに統合されており、T細胞の動的な挙動に基づいた免疫調節候補物質の反復的な評価を可能にします。
- 探索生物学：GVHDの病態形成における特定のT細胞サブセットの寄与を分離することで、仮説検証とパスウェイの解明を支援します。
- スクリーニング：定量的な再現性のあるフラックス読み取り値を算出する標準化された生物発光イメージングプロトコルにより、アッセイの即応性を実現します。
- 分析：関心領域（ROI）のフラックス定量化や時間的な蓄積パターンなどの統計的なアウトプットを提供し、条件間の比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：イメージングから得られたT細胞のダイナミクスを、臨床的なGVHDスコアリングおよび生存転帰に結びつけることで、前臨床段階からの連続性を確保します。
- エンタープライズ再利用：複数の免疫療法の標的やモデルシステムにわたる免疫細胞のトラフィッキングを追跡するための、再利用可能なイメージングプラットフォームを構築します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：T細胞介在性病理における機序的な曖昧さを低減し、ターゲットバリデーションにおける予測の信頼性を向上させます。
- 運用上の価値：定義されたイメージング間隔、ルシフェリンの投与量、およびフラックス定量プロトコルを通じて、再現性と標準化を強化します。
- 戦略的価値：コストのかかる後期研究の前に免疫調節候補物質の早期リスク低減を可能にし、資本効率を改善します。
- ポートフォリオへの影響：GVHDに関連する病原性T細胞のトラフィッキングパターンを変化させる候補物質を特定することにより、リスク調整後の優先順位付けを支援します。
実施上の留意点
- マウス骨髄移植、細胞サブセットの精製、および生物発光イメージング装置に関する専門知識が必要です。
- Xenogen IVISまたは同等のCCDイメージングシステム、およびフラックス定量化のためのLiving Imageソフトウェアへのアクセスが必要です。
- データの比較可能性を確保するため、照射プロトコル、ルシフェリンの投与量、およびイメージングスケジュールのチーム間での標準化が不可欠です。
- 異なるT細胞サブセット、疾患モデル、または治療的介入のタイムポイントに適用する場合、条件の適応を検討する必要があります。
- ルシフェラーゼ発現ドナー細胞が必要であり、これには遺伝子工学的な操作や特殊なマウス系統が必要となるため、制約があります。
