HeLa細胞のトランスフェクションに続いてGaussiaルシフェラーゼmRNA のインビトロ転写とキャッピングの
2012年3月26日
この方法は、Gaussiaルシフェラーゼ(GLuc)遺伝子を含む直鎖状プラスミドから、キャップ付きおよびキャップなしのmRNAをin vitroで高収率で合成する方法を示しています。RNAを精製し、キャップされていないRNAの一部をVacciniaウイルスキャッピング酵素を使用して酵素的にキャップします。最終ステップでは、mRNAをHeLa細胞にトランスフェクションし、細胞培養上清のルシフェラーゼ活性をアッセイします。
この手順の全体的な目標は、ヘラ細胞にキャップ付きおよびキャップなしのmRNA、ガルルシフェラーゼの転写産物をトランスフェクションし、細胞培養のルシフェラーゼ活性をアッセイすることです。これは、まずT 7高収量RNA合成キットを使用して、Gaiaルシフェラーゼの転写産物であるアンキャップmRNAとキャップmRNAの両方をin vitro転写で合成することで達成されます。mRNAをキャッピングする2つの方法が示されています。
1つは転写中にキャップアナログを使用し、もう1つは転写後キャッピングにワクシニアキャッピング酵素を使用します。次のステップは、キャップ付きおよびキャップなしのmRNA転写産物をヘリ細胞にトランスフェクションすることです。最終的に、キャップなしまたはキャップされたmRNAに起因するルシフェラーゼ活性を、スーパーネームされたヘリ細胞培養で比較します。
この方法が独自の転写反応を設定する場合の主な利点は、T seven High yield RNA Synthesis Kitが試験され、最適化されているため、高収量でさらに重要なことに、高品質の完全長RNA転写産物を作製できることです。これは、RNAの翻訳を成功させ、機能活性タンパク質を発現するために非常に重要です。したがって、この方法は、in vitroで転写されたRNAのRNAトランスフェクションに関する洞察を提供し、マイクロインジェクションマイクロアレイ解析、ハイブリダイゼーションベースのブロット、RNAの構造および機能研究などの他のアプリケーションにも使用できます。
この例の反応のDNAテンプレートは、ガウスルシフェラーゼまたはグルック遺伝子を含む直鎖状プラスミドです。T seven promoterを使用すると、キャップ付き製品とキャップなし製品の両方が合成されます。まず、T seven High yield RNA Synthesis Kitの成分を解凍し、氷上に保ちます。
RNAの汚染を避けるために、手袋を着用し、ベンチ表面のピペットやその他の材料を徹底的に清掃してください ヌクレアーゼフリーのピペットチップ、チューブ、ガラス器具を使用して、キャップされていないRNAを合成することを強くお勧めします。室温で反応を、10 x バッファーと水から始めて、次にヌクレオチドであるDNAテンプレートでセットアップします。そして最後に、ポリメラーゼミックスです。
キャップ付きRNAを合成するためには、試薬の添加順序が重要です。キャップアナログを使用して、同様の反応混合物を作成しますが、キャップアナログヌクレオチドを追加します。標準的なヌクレオチドを添加した後、反応成分を穏やかにボルテックスして混合し、次にパルス、スピン、および乾燥空気インキュベーターで37°Cで反応を2時間インキュベートします。内部制御装置として、線形化されたプラスミドからc Lukeのキャップ転写産物を合成するための第2の反応を設定します。C Lukeの発現は、グルク発現を正常化するために使用されます。
インキュベーション後、各反応混合物からDNAテンプレートを取り出します。70マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水、続いて10個のDNA、1つの反応バッファー、次に2マイクロリットルのDNAを追加します。1つは、乾燥空気インキュベーター内でDNAを摂氏37度で15分間反応させます。
次に、スピンカラムベースのRNA精製キットを使用して反応を精製し、NanoDrop TM分光光度計を使用してRNAを定量します。最後に、Agilent RNA 6, 000 nano KittおよびAgilent 2100バイオアナライザーを使用してRNAの品質を評価します。標準的なキャッピング反応では、精製したキャップなしのグルックmRNA10マイクログラムを15マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水に引き上げます。
これは、それに応じてスケールアップできます。RNAを摂氏65度で10分間加熱して二次構造を破壊し、次に5分間氷の上に置きます。キャッピング反応を設定するには、変性RNAにキャッピングバッファーGTPを新たに希釈したカタツムリのメチオニンとワクシニアキャッピング酵素を加えます 反応成分を穏やかにボルテックスし、パルススピンし、乾燥空気インキュベーターで摂氏37度で反応を30分間インキュベー
トします。インキュベーション後、前のセクションの最後に行ったようにRNAをクリーンアップして分析します。まず、ヘラセルのめっきから始めます。48ウェルプレートの28ウェルには、各ウェルには70〜230,000個の細胞と150マイクロリットルの高グルコースDMEMが含まれ、10%の血清が補充されている必要があります。
プレートを摂氏37度でインキュベートし、細胞が60〜90%コンフルエントになるまで、これには16〜24時間かかります。細胞の準備ができたら、トランスフェクション混合物を調製します。RNAを1マイクロリットルあたり100ナノグラムの濃度に希釈します。
次に、3つの異なる反応用に24本のマイクロ遠心分離チューブをセットアップします。8本のチューブに8回複製。グルックRNAでキャップされていない1マイクロリットル、正規化のために1マイクロリットルのキャップ付きcルークRNAと25マイクロリットルの無血清を追加します。
DMEMは、次の8本のチューブにピペッターを使用して常によく混合します。同じ反応を設定しますが、キャップされていないグルックRNAの代わりに、キャップアナログを使用して調製したキャップグルクRNAを最後の8本のチューブに追加します。キャップアナログを使用して調製したグルクRNAの代わりに、ワクシニア反応からのキャップ付きグルクRNAを、0.2マイクロリットルのmRNAブースト試薬にキャップされていないグルクRNAを混合した8本のチューブの最初のセットに加え、続いて0.2マイクロリットルで混合します。
トランジットmRNA試薬は、室温で反応を5分以内に進行させます。反応の2分後、各混合物を培養細胞の入ったウェルに滴下し始めます。vaccinia反応からのキャップ、アナログcap gluc、RNA、およびキャップされたgluc RNAを含む次の2セットのチューブでこのステップを繰り返します。
ネガティブコントロールとして4つのウェルを残し、細胞を摂氏37度で5%二酸化炭素アッセイで一晩インキュベートします。スープラは、グルックアッセイにBiox GIAルシフェラーゼアッセイキットを使用して命名されました。1.5ミリリットルのbiox glucアッセイバッファーに15マイクロリットルのbiox gluc基質を添加して、新しいアッセイ溶液を調製します。
最終混合物をボルテックスしないでください。CLUアッセイのためにチューブインバージョンで混合します。再構成したばかりの基質100個を調製します。
次に、再構成した基質15マイクロリットルを1.5ミリリットルのBlu Cienaルシフェラーゼアッセイバッファーに添加してアッセイ溶液を調製します。C Lukeアッセイ溶液をボルテックスせずに混合し、室温で30分間光から離してインキュベートします。アッセイ溶液を調製した状態。
マイクロプレートルミノメーターを使用して細胞の発光を測定します。ルミノメーターを50マイクロリットルのアッセイ溶液を2〜10秒間注入するように設定します。次に、各細胞培養スーパーネームの10マイクロリットルを96のウェルに移し、黒板にする。
インジェクターをアッセイ溶液でプライミングし、発光の測定に進みます。T seven 高収量 RNA 合成キットは、Agilent 2100 バイオアナライザーで分析すると、キャップなしの RNA と 20 マイクロリットルの反応あたり最大 40 〜 50 マイクログラムのキャップ付き RNA を生成できます。良い品質はそのままです。
RNAは、RNA転写産物を表す単一の鋭いピークを示す必要があります。幅の広いピークまたは複数のピークは、RNAの分解を示します。また、R-N-A-R-N-A のサイズを確認することも重要です。
予想よりも長い転写産物は、テンプレートの消化が不完全であることが原因である可能性があります プラスミド、D-N-A-R-N-A 分解、および収率の低下は、通常、テンプレートからの反応に導入された汚染物質の結果です。DNAトランスフェクションに続いて、インキュベーションおよびアッセイルシフェラーゼ活性を行いました。ファイブプライムキャップ構造は、RNAをエキソヌクレアーゼ分解から保護し、翻訳開始を促進するために重要です。
したがって、RNAキャッピングはトランスフェクション実験に不可欠なステップです。キャップ付き転写産物とキャップなし転写産物をトランスフェクトした細胞培養物間の測定された発光の差は、これを明確に支持しており、キャップアナログを用いたキャッピング技術とワクシニアキャッピング酵素を用いたキャッピング技術の両方が、機能的なキャップ付きRNA転写産物を成功裏に産生することも示しています。このビデオを見れば、トランスフェクションやその他のさまざまなアプリケーションで使用するための高品質なキャップ付きRNA転写産物の合成方法について十分に理解できるはずです。
概要
この方法は、ガウシアルシフェラーゼ（GLuc）遺伝子を含む線形化プラスミドからのキャップ付きおよびキャップなしmRNAの高い収率のin vitro合成を説明しています。合成されたRNAは精製され、キャップなしRNAの一部はエンジマティックにVacciniaウイルスのキャッピング酵素を使用してキャッピングされ、その後HeLa細胞へのトランスフェクションのためにルシフェラーゼ活性アッセイに使用されます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 分子生物学
背景
- in vitro転写はDNAテンプレートからRNAを生成する方法です。
- キャップ付きmRNAは安定性と翻訳効率に不可欠です。
- ガウシアルシフェラーゼはmRNA機能性を評価するためのレポーターとして機能します。
- HeLa細胞はトランスフェクション研究に広く使用されています。
研究の目的
- GLuc遺伝子のキャップ付きおよびキャップなしmRNA転写物を合成すること。
- HeLa細胞におけるキャップ付きとキャップなしmRNAのルシフェラーゼ活性を比較すること。
- T7高収率RNA合成キットの効率を実証すること。
使用した方法
- T7 RNAポリメラーゼキットを使用したin vitro転写。
- Vacciniaウイルスのキャッピング酵素を使用したキャップなしRNAの酵素的キャッピング。
- 合成されたmRNAのHeLa細胞へのトランスフェクション。
- GLucの発現を測定するためのルシフェラーゼ活性アッセイ。
主要な結果
- 高品質なキャップ付きおよびキャップなしmRNAの成功した合成。
- キャップ付きとキャップなしmRNA間のルシフェラーゼ活性の違いを実証。
- 全長RNA転写物の生産にT7高収率RNA合成キットを使用することの検証。
- RNAトランスフェクション方法論に関する洞察の提供。
結論
- この方法は効果的にmRNAを合成し、HeLa細胞にトランスフェクトします。
- キャッピングはmRNAの安定性と翻訳を改善します。
- このアプローチはルシフェラーゼアッセイを超えて様々なRNA応用に適用できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This method enables biopharma R&D teams to generate high-quality capped and uncapped mRNA transcripts for functional validation in mammalian cells, supporting target de-risking and assay development workflows. By comparing luciferase activity from capped versus uncapped RNA, teams gain quantitative insights into mRNA stability and translational efficiency—key factors in predictive confidence for RNA-based therapeutics. The approach provides a scalable, reproducible platform for early-stage mechanistic screening and lead identification in RNA drug discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of mRNA functionality through luciferase reporter assays, supporting target hypothesis testing and pathway clarification.
- Operational Value: Provides standardized, high-yield RNA production using optimized kits, reducing variability in transfection experiments.
- Predictive Value: Differentiates capped and uncapped mRNA performance to inform RNA design decisions and improve translational success rates.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative luciferase readouts that enable dose-response and structure-activity relationship analysis for mRNA variants.
- Operational Value: Produces consistent, full-length RNA transcripts suitable for high-throughput transfection and screening platforms.
- Assay Readiness: Supports normalization strategies using internal control RNAs (e.g., CLuc) to improve data reliability across experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges in vitro RNA synthesis with cellular functional readouts, enabling risk-adjusted advancement decisions.
- Mechanistic De-risking: Validates RNA capping strategies that enhance stability and translation—critical for mRNA therapeutic development.
- Predictive Confidence: Supports go/no-go decisions by linking molecular modifications to measurable cellular outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery to lead identification continuum, providing a reliable source of functional mRNA for downstream screening and validation efforts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via luciferase reporter assays to assess mRNA design impacts on protein expression.
- Screening: Enables preparation of standardized RNA libraries for transfection-based screening in mammalian cells.
- Analytics: Delivers quantitative luminescence measurements that allow comparison of capped versus uncapped mRNA performance.
- Translational Research: Connects RNA synthesis to cellular functionality, supporting biomarker-aligned evaluation of mRNA modifications.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable RNA production and transfection workflow applicable across multiple targets and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in mRNA design by demonstrating the functional impact of 5' capping on translation and stability.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized kits and purification steps, reducing batch-to-batch variability.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of RNA candidates before significant investment.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of mRNA constructs based on empirical translational efficiency data.
Implementation Considerations
- Requires molecular biology expertise in RNA handling, in vitro transcription, and enzymatic capping procedures.
- Depends on access to T7 RNA polymerase kits, capping enzymes, and RNA purification systems (e.g., spin columns).
- Necessitates standardized transfection protocols and luciferase assay instrumentation for consistent results.
- Involves quality control steps (e.g., NanoDrop, Bioanalyzer) to confirm RNA integrity and size before cellular application.
- Adaptation to alternative cell lines or reporter systems may require optimization of transfection reagents and assay conditions.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:33
In vitro Transcription using the T7 High-yield RNA Synthesis Kit
3:29
RNA Capping using the Vaccinia Capping System
4:17
HeLa Cell Transfection using the TransIT mRNA Transfection Kit
6:08
Gaussia Luciferase (GLuc) and Cypridina Luciferase (CLuc) Assays
7:20
Representative Results
8:36
Conclusion
