Name: HeLa細胞のトランスフェクションに続いてGaussiaルシフェラーゼmRNA のインビトロ転写とキャッピングの (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: 学ぶ HeLa細胞へのキャップ付き・無しGaussiaルシフェラーゼmRNAトランスフェクション法。T7高収率RNA合成キットとVacciniaウイルスキャッピング酵素を用いて、in vitro転写と酵素学的キャッピングを実施し、ルシフェラーゼ活性を測定する。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dongxian Yue, Brett Robb, George Tzertzinis, Tanya Bhatia, Breton Hornblower

RNaseは一般的に皮膚、毛髪、塵埃、実験室の表面、溶液などに存在します。RNaseによるコンタミネーションを防ぐため、手袋を着用し、使用前にベンチ表面やピペットなどを十分に清掃してください。ヌクレアーゼフリーのピペットチップ、チューブ、ガラス器具、および試薬の使用を強く推奨します。
1. T7 High-yield RNA Synthesis Kitを用いたIn vitro転写
転写反応用のDNAテンプレートには、Gaussia luciferase遺伝子と、コーディング配列の上流にT7プロモーターを含む線状化プラスミドを使用します（図1B）。
<ol>
	<li>T7 High Yield RNA Synthesis kitの構成成分を融解し、氷上で保持する。</li>
	<li>キャップなしRNAの場合、室温で以下の順序で反応液を調製する。</li>
</ol>
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>成分</td>
			<td>容量 (μl)</td>
			<td>最終濃度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ヌクレアーゼフリー水*</td>
			<td>X</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X 反応バッファー</td>
			<td>2</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP (100 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP (100 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP (100 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP (100 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>鋳型DNA *</td>
			<td>X</td>
			<td>1 μg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNAポリメラーゼミックス</td>
			<td>2</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>合計</td>
			<td>20</td>
			<td> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
1 μgのDNAを加え、ヌクレアーゼフリーウォーターを用いて全反応容量を20 μlにします。添加する水の量は、鋳型DNAの濃度によって異なります。
<ol start="3">
	<li>キャップ付きRNAの場合：室温で以下の順序に従って反応液を調製します：</li>
</ol>
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>構成要素</td>
			<td>容量（μl)</td>
			<td>最終</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ヌクレアーゼフリー水*</td>
			<td>X</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X反応バッファー</td>
			<td>2</td>
			<td>1倍</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP (100 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP (100 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP (100 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP (20 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>2mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3´-0-Me-m7G(5')ppp(5')G キャップアナログ (ARCA) (40mM)</td>
			<td>4</td>
			<td>8mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>鋳型DNA*</td>
			<td>X</td>
			<td>1 μg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNAポリメラーゼミックス</td>
			<td>2</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>合計</td>
			<td>20</td>
			<td> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
1 μgのDNAを加え、ヌクリーゼフリー水で全反応量を20 μlに調整します。加える水の量は、テンプレートDNAの濃度によって異なります。
<ol start="4">
	<li>ボルテックスで十分に混合し、ドライエアインキュベーター内で37 °Cで2時間インキュベートする。</li>
	<li>ステップ1.3〜1.4を用いて、CLuc遺伝子を含む直線状プラスミドからキャップ付きのCypridinaルシフェラーゼ（CLuc）転写物を合成する。このmRNAは、GLuc発現の標準化（ノーマライゼーション）のため、キャップ付きおよびキャップなしのGLuc mRNAと共に共導入する。</li>
</ol>
2. テンプレートDNAの除去
精製に進む前に、DNAテンプレートを除去するため、転写反応液にDNase I処理を施します。
<ol>
	<li>転写反応液にヌクレアーゼフリーウォーター 70 μl を加え、続いて DNase I 反応バッファー 10 μl を加える。</li>
	<li>反応液に DNase I 2 μl を加える。</li>
	<li>ドライエアーインキュベーターを用いて 37 °C で 15 分間インキュベートする。</li>
</ol>
3. キャップ付きおよびキャップなしRNAのカラム精製
<ol>
	<li>製造元の手順に従い、MEGAclearKitを用いてキャップ付きおよびキャップなしRNAを精製する（スピンカラムベースの任意のRNA精製キットが使用可能である）。</li>
	<li>NanoDrop分光光度計を用いてRNAを定量する。</li>
	<li>製造元の手順に従い、Agilent RNA 6000 Nano KitおよびAgilent 2100 Bioanalyzerを用いてRNAサンプルの品質を評価する。</li>
</ol>
4. Vaccinia キャッピングシステムを用いたRNAキャッピング
<ol>
	<li>精製したキャップ未付加GLuc mRNAを10 μg分量用意する。</li>
</ol>
標準的なキャッピング反応では、最大 10 μg（100nt 以上）の RNA をキャッピングできます。より多量の RNA をキャッピングする必要がある場合は、それに応じて反応量をスケールアップしてください。
<ol start="2">
	<li>ヌクレアーゼフリーウォーターを用いて、液量を 15 μl に調整します。</li>
	<li>RNAを 65 °C で10分間加熱し、二次構造を除去します。その後、氷上で5分間静置します。</li>
	<li>キャッピング反応を準備するために、変性させた 15 μl のRNAに、2 μl の 10X Capping Buffer、1 μl の GTP (10 mM)、1 μl の調製直後の S-adenosyl methionine (2 mM)、および 1 μl (10 units) の Vaccinia capping enzyme を添加します。</li>
	<li>軽くボルテックスして十分に混ぜ合わせ、ドライエアインキュベーター内で 37 °C で30分間インキュベートします。</li>
</ol>
5. キャップ付RNAのカラム精製
<ol>
	<li>MEGAclear Kitを用いて、キャップ処理したRNAを精製します（スピンカラムを用いた任意のRNA精製キットが使用可能です）。</li>
	<li>製造元の指示に従い、Agilent RNA 6000 Nano KitおよびAgilent 2100 Bioanalyzerを用いて、RNAサンプルの品質を評価します。</li>
</ol>
6. TransIT mRNA Transfection Kitを用いたHeLa細胞へのトランスフェクション
<ol>
	<li>10%胎児牛血清を添加したHigh Glucose Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 150 μlを用いて、HeLa細胞を48ウェルプレートに播種する（0.7-2.3 × 105 cells/well）。</li>
	<li>細胞のコンフルエンシーが60-90%になるよう、37 °Cで16-24時間インキュベートする。</li>
	<li>GLuc（cappedおよびuncapped）およびCLuc RNAを100 ng/μl濃度に希釈する。</li>
</ol>
各トランスフェクションは8連で実施します。
<ol start="4">
	<li>エッペンドルフチューブを8本準備する チューブに。各チューブに以下を添加する。 1 μl キャップ未付加GLuc RNA、 1 μl キャップ付きCLuc RNA（標準化用）および 25 μl の無血清DMEMを加える。よく混ぜ合わせる。</li>
	<li>エッペンドルフチューブを8本用意し、各チューブに以下を添加する。 1 μl キャップ付きGLuc RNA（キャップアナログ）、 1 μl キャップ付きCLuc RNA（標準化用）および 25 μl 無血清DMEMで。よく混ぜ合わせる。</li>
	<li>8本のエッペンドルフチューブを用意し、各チューブに以下を添加します。 1 μl キャップ付きGLuc RNA（ワクシニア), 1 μl キャップ付きCLuc RNA（標準化用）および 25 μl 無血清DMEMの。よく混ぜ合わせる。</li>
	<li>追加 0.2 μl 最初の8本のチューブにmRNA Boost Reagentを加え、混合する。</li>
	<li>追加 0.2 μl 翻訳最初の8本のチューブのセットにIT mRNA試薬を加え、混合する。</li>
	<li>室温で2〜5分間インキュベートする（5分を超えてインキュベートしないこと）。</li>
	<li>HeLa細胞培養液を含むウェルに、トランスフェクション混合液を滴下して加えてください（参照 図3 （プレートセットアップ用）。</li>
	<li>2を用いて、ステップ7から10を繰り返します。nd および3rd 8本1組のチューブ。</li>
	<li>〜にて一晩（16時間）インキュベートする。 37 °C 5% CO条件下で2.</li>
</ol>
7. Gaussia ルシフェラーゼ (GLuc) アッセイ
BioLux Gaussia Luciferase Assay Kitを用い、以下の手順で各ウェルの上清のGLuc活性を測定します：
<ol>
	<li>BioLux GLuc Assay Buffer 1.5 mlにBioLux GLuc Substrate 15 μlを加えて、新鮮なアッセイ溶液を調製する（サンプル1つあたり50 μlのアッセイ溶液が必要）。サンプル分およびルミノメーターのインジェクターのプライミングに必要な量を調製する（製造元の指示書を参照）。</li>
	<li>チューブを数回反転させて十分に混合する（ボルテックスミキサーは使用しない）。</li>
</ol>
ルミネッセンスは、Berthold Technologies社のCentro LB 960マイクロプレートルミノメーターを用いて測定します。
<ol start="3">
	<li>ルミノメーターの注入量を 50 μl、積分時間を 2-10 秒に設定します。</li>
	<li>各ウェルの細胞培養上清を 10 μl ずつ 96 ウェルブラックプレートに分注します。</li>
	<li>インジェクターをアッセイ溶液でプライミングし、発光測定を行います。</li>
	<li>非導入ウェルから得られた値を陰性コントロールとして使用します。</li>
</ol>
8. Cypridina ルシフェラーゼ (CLuc) アッセイ
BioLux Cypridina Luciferase Assay Kitを用い、以下の手順で各ウェルの上清のCLuc活性を測定します。
<ol>
	<li>キットのマニュアルに従い、新鮮な再構成基質（100x）を調製する。</li>
	<li>BioLux Cypridina Luciferase Assay Bufferを解凍し、よく混ぜ合わせる（遮光すること）。</li>
	<li>CLucアッセイ溶液を調製するため、BioLux Cypridina Luciferase Assay Buffer 1.5 mlに、再構成基質（100x）15 μlを加える（サンプル1つあたり50 μlのアッセイ溶液が必要）。サンプル分およびルミノメーターのインジェクターのプライミングに必要な量を調製する（製造元の指示を参照）。</li>
	<li>チューブを数回反転させてよく混ぜ合わせる（ボルテックスミキサーは使用しない）。</li>
	<li>溶液を室温で30分間保持する（遮光すること）。</li>
</ol>
ルミネッセンスは、Berthold Technologies社製のCentro LB 960マイクロプレートルミノメーターを用いて測定します。
<ol start="6">
	<li>ルミノメーターを、注入量 50 μl、ディレイタイム 1-2 秒、積分時間 2-10 秒に設定します。</li>
	<li>各ウェルから細胞培養上清を 10 μl ずつ、96ウェルブラックプレートに分注します。</li>
	<li>インジェクターをCLucアッセイ溶液でプライミングし、発光量を測定します。</li>
	<li>未導入ウェルから得られた値を陰性コントロールとして使用します。</li>
</ol>
9. 代表的な結果
T7 High Yield RNA Synthesis Kitを用いると、20 μlの反応あたり最大180 μgの非キャップRNA、および40から50 μgのキャップRNAを合成できます。Agilent 2100 Bioanalyzerで分析した際、品質が良く分解されていないRNAであれば、RNA転写物を表す単一の鋭いピークが示されます。幅の広いピークや複数のピークが現れる場合は、RNAの分解を示しています。また、RNAのサイズを確認することも重要です。予想よりも長いRNA転写物が得られた場合は、テンプレートプラスミドDNAの消化が不完全であった可能性があります。RNAの分解や収率の低下は、通常、テンプレートDNAから反応系に混入した不純物が原因となります。図 2は、品質の良い分解されていないRNAをBioanalyzerで解析した際のエレクトロフェログラムとゲル画像の例です。
キャップ付きおよびキャップなしのGLuc RNAをHeLa細胞にトランスフェクションした後、インキュベーションを行い、細胞培養上清中のルシフェラーゼ活性を測定します。5'キャップ構造は、エキソヌクレアーゼによる分解からRNAを保護し8、mRNAの翻訳開始を促進する9ために重要です。したがって、RNAキャッピングはトランスフェクション実験において不可欠な工程です。共転写（キャップアナログ）法では、約80%がキャップされたRNAが約40 μg得られます。ワクシニアキャッピング酵素を用いたプロトコルでは、1反応あたり最大10 μgのRNA（100 nt以上）を、ほぼ100%の効率でキャッピングできます。
図 4は、キャップ付きおよびキャップなしのRNAサンプルを導入した培養細胞におけるルシフェラーゼ発現の差を示しています。キャップ付きRNAを導入した細胞培養では、キャップなしRNAを導入した細胞（ルシフェラーゼ活性を示さない）と比較して、著しく高いルシフェラーゼ発現が見られることが明確に分かります。さらに、図 4は、キャップアナログを用いる方法とワクチニアキャップ酵素を用いる方法の両方のキャッピング技術が、タンパク質に翻訳可能な機能的なキャップ付きRNA転写物を正常に生成できることを検証しています。t検定から得られた両側p値は0.2583であり、2つのキャッピング方法によるルミネッセンスデータに統計的な有意差はないことが示されました。
<img alt="T7転写の模式図。DNAテンプレート、RNA転写産物、ヌクレオチド配列のプロセス。" src="/files/ftp_upload/3702/3702fig1A.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="図 1.">
図1A. T7 RNAポリメラーゼによるRNA合成
 
<img alt="pCMV-GLucのプラスミドマップ、5764 bp；遺伝子発現、クローニングベクター、制限酵素部位。" src="/files/ftp_upload/3702/3702fig1B.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="図 2."> 
図 1B. GLuc遺伝子とT7プロモーターを含むpCMV-GLucベクター。
 
<img alt="RNAクロマトグラフィーの結果。キャップなしRNAとキャップありRNAの分析。電気泳動チャート。" src="/files/ftp_upload/3702/3702fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="図 2."> 
図 2. キャップありおよびキャップなしRNAのBioanalyzerエレクトロフェログラムおよびゲル画像。X軸はヌクレオチド（nt）単位のRNAサイズ、Y軸は蛍光単位（FU）を示す。A) 精製後のGLuc mRNA（キャップなし）のエレクトロフェログラム。B) Vaccinia キャップ酵素を用いてキャップ処理したGLuc mRNAのエレクトロフェログラム。C) キャップアナログを用いて共転写的にキャップ処理したGLuc mRNAのエレクトロフェログラム。D) Bioanalyzerによって生成されたゲル様画像。「L」レーンはRNAラダー、レーン1はキャップなしGLuc mRNA、レーン2はキャップアナログを用いてキャップ処理したGLuc mRNA、レーン3はVaccinia キャップ酵素を用いてキャップ処理したGLuc RNAである。
 
<img alt="遺伝子発現実験のプレートレイアウト図。サンプルタイプ：uncapped/capped GLuc および CLuc。" src="/files/ftp_upload/3702/3702fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="図 3."> 
図 3. HeLa細胞へのトランスフェクションにおけるプレートセットアップの例。各ウェルには、コンフルエンシーが60-90%のHeLa細胞が播種されている。適切なGLuc RNA（uncapped、キャップアナログによるcapped、またはVacciniaキャッピング酵素によるcapped）、capped CLuc RNA（ノーマライゼーション用）、mRNA Boost Reagent、およびTransIT mRNA Reagentからなるトランスフェクションミックスを各ウェルに添加する。各トランスフェクションは8反復で行う（図中の同色のウェル）。
 
 
<img alt="正規化されたルミネッセンスの棒グラフ。キャップありおよびキャップなしのGLuc RNA。RNA解析結果。" src="/files/ftp_upload/3702/3702fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="図 4."> 
図 4.HeLa細胞におけるGLucの発現。精製したキャップありおよびキャップなしのGLuc mRNAをHeLa細胞にトランスフェクションし、37 °Cで一晩（16時間）インキュベートした。各ウェルの細胞培養上清を用いてGLucおよびCLuc活性を測定し、ルミネッセンス値を記録した。GLucのルミネッセンス値は、キャップありCLuc RNAのルミネッセンス値で正規化した。
<img alt="GLuc発光比の公式、発光測定、正規化値の方程式、RLU。" src="/files/ftp_upload/3702/3702eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="式1">
* 正規化の前に、非導入細胞からのルミネッセンスをGLucおよびCLucの値から差し引いた。
 
商標
BioLuxは、New England Biolabs, Inc.の商標です。
TransITはMirus Bio LLCの登録商標です。
MEGAclearはAmbionの商標です。

<ol><li>Lazarev, D., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+splicing+and+transcription+are+not+sufficient+to+enhance+splicing+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Concurrent splicing and transcription are not sufficient to enhance splicing efficiency.</a> RNA. 13, 1546-1557 (2007).</li>
<li>Donze, O., Picard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+in+mammalian+cells+using+siRNAs+synthesized+with+T7%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Polymerase.+Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">RNA interference in mammalian cells using siRNAs synthesized with T7.</a> RNA Polymerase. Nucl. Acids Res. 30, 10-46 (2002).</li>
<li>Van Gelder, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nati.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1663-1667 (1990).</li>
<li>Schneider, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+T7+RNA+polymerase+based+in+vitro+linear+RNA+amplification+for+use+in+microarray+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of T7 RNA polymerase based in vitro linear RNA amplification for use in microarray experiments.</a> BMC Genomics. 5, 29-29 (2004).</li>
<li>Conry, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+messenger+RNA+polynucleotide+vaccine+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of a messenger RNA polynucleotide vaccine vector.</a> Cancer Research. 55, 1397-1400 (1995).</li>
<li>Huang, F., Wang, G., Coleman, T., Li, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+adenosine+derivatives+as+transcription+initiators+and+preparation+of+5%C3%A2%E2%82%AC%C2%B2+fluorescein-+and+biotin-labeled+RNA+through+one-step+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Synthesis of adenosine derivatives as transcription initiators and preparation of 5â€² fluorescein- and biotin-labeled RNA through one-step transcription.</a> RNA. 9, 1562-1570 (2003).</li>
<li>Warren, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+reprogramming+to+pluripotency+and+directed+differentiation+of+human+cells+with+synthetic+modified+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA.</a> Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).</li>
<li>Furuichi, Y., LaFiandra, A., Shatkin, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5%27-Terminal+structure+and+mRNA+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">5'-Terminal structure and mRNA stability.</a> Nature. 266, 235-239 (1977).</li>
<li>Topisirovic, I., Svitkin, Y. V., Sonenberg, N., Shatkin, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cap+and+cap+binding+proteins+in+the+control+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cap and cap binding proteins in the control of gene expression.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. 2, 277-298 (2011).</li>
<li>Lewis, J. D., Izaurflde, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+the+Cap+Structure+in+RNA+Processing+and+Nuclear+Export%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The Role of the Cap Structure in RNA Processing and Nuclear Export.</a> Eur. J. Biochem. 247, 461-469 (1997).</li>
<li>Inoue, K., Ohno, M., Sakamoto, H., Shimura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+the+cap+structure+on+pre-mRNA+splicing+in+Xenopus+oocyte+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Effect of the cap structure on pre-mRNA splicing in Xenopus oocyte nuclei.</a> Genes Dev. 3, 1472-1479 (1989).</li>
<li>Martin, S. A., Paoletti, E., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+mRNA+guanylyltransferase+and+mRNA+%28guanine+7-%29methyltransferase+from+vaccinia+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification of mRNA guanylyltransferase and mRNA (guanine 7-)methyltransferase from vaccinia virus.</a> J. Biol. Chem. 250, 9322-9329 (1975).</li>
<li>Martin, S. A., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+RNA+by+mRNA+guanylytransferase+and+mRNA+%28guanine-7-%29methyl-transferase+from+vaccinia+virions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Modification of RNA by mRNA guanylytransferase and mRNA (guanine-7-)methyl-transferase from vaccinia virions.</a> J. Biol. Chem. 250, 9330-9335 (1975).</li>
<li>Shuman, S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+use+of+vaccinia+virus+mRNA+capping+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Meth.+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Purification and use of vaccinia virus mRNA capping enzyme.</a> Meth. Enzymol. 181, 170-180 (1990).</li>
<li>Thiel, V., Herold, J., Scelle, B., Siddell, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectious+RNA+transcribed+in+vitro+from+a+cDNA+copy+of+the+human+coronavirus+genome+cloned+in+vaccinia+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Infectious RNA transcribed in vitro from a cDNA copy of the human coronavirus genome cloned in vaccinia virus.</a> J. Gen. Virol. 82, 1273-1281 (2001).</li>
<li>Marcotrigiano, J., Gingras, A. -C., Sonenberg, N., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cocrystal+Structure+of+the+Messenger+RNA+5%C3%A2%E2%82%AC%C2%B2+Cap-Binding+Protein+%28eIF4E%29+Bound+to+7-methyl-GDP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cocrystal Structure of the Messenger RNA 5â€² Cap-Binding Protein (eIF4E) Bound to 7-methyl-GDP.</a> Cell. 89, 951-961 (1997).</li>
<li>Stepinski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+properties+of+mRNAs+containing+the+novel+%22anti-reverse%22+cap+analogs+7-methyl+%283%27-O-methyl%29GpppG+and+7-methyl+%283%27-deoxy%29+GpppG%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Synthesis and properties of mRNAs containing the novel "anti-reverse" cap analogs 7-methyl (3'-O-methyl)GpppG and 7-methyl (3'-deoxy) GpppG.</a> RNA. 7, 1486-1495 (2001).</li>
<li>Kuge, H., Brownlee, G. G., Gershon, P. D., Richter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cap+ribose+methylation+of+c-mos+mRNA+stimulates+translation+and+oocyte+maturation+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Cap ribose methylation of c-mos mRNA stimulates translation and oocyte maturation in Xenopus laevis.</a> Nucl. Acids Res. 26, 3208-3214 (1998).</li>
<li>Schagat, T., Paguio, A., Kopish, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalizing+Genetic+Reporter+Assays%3A+Approaches+and+Considerations+for+Increasing+Consistency+and+Statistical+Significance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Notes%22%5BJournal%5D)">Normalizing Genetic Reporter Assays: Approaches and Considerations for Increasing Consistency and Statistical Significance.</a> Cell Notes. 17, 9-12 (2007).</li>
<li>Barbosa, E., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+%28nucleoside-2%27-%29+-+methyltransferase+from+Vaccinia+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">mRNA (nucleoside-2'-) - methyltransferase from Vaccinia Virus.</a> J. Biol. Chem. 253, 7698-7702 (1978).</li>
<li>Lockless, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+capped+RNA+substrates+by+VP39%2C+the+vaccinia+virus-encoded+mRNA+cap-specific+2%27-O-methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Recognition of capped RNA substrates by VP39, the vaccinia virus-encoded mRNA cap-specific 2'-O-methyltransferase.</a> Biochemistry. 37, 8564-8574 (1998).</li>
</ol>

著者はすべてNew England Biolabs, Inc.の従業員です。

In vitro転写は、さまざまな用途に向けて高収量のRNAを得るための有用な手法です。T7 High Yield RNA Synthesis Kitを使用する最大の利点は、RNAの高収量を達成するために組成が最適化されていることです。さらに、キットに含まれる試薬にはヌクレアーゼ汚染がないため、高品質で完全なRNA転写産物を合成できます。本キットは高い安定性と柔軟性を備えて設計されており、mRNA、色素標識RNA、高比放射能放射能標識プローブ、およびキャップ付きRNAの合成に使用可能です。キットのマニュアルには、これらの各用途に必要な特定のプロトコルと追加材料のリストが記載されています。また、PCR産物や合成DNAオリゴヌクレオチドを転写テンプレートとして使用するための技術情報も含まれています。なお、この転写キットではT7プロモーターを含むDNAテンプレートのみが使用可能である点に注意してください。
本記事で解説する手法では、Vaccinia capping enzymeを用いた転写後RNAキャッピングと、RNAキャップ構造アナログを用いた共転写キャッピングについて実証します。これら両方の手法で、トランスフェクション後に機能的に活性を持つキャップ付きRNAが合成されることを示しました。5'キャップ構造はRNAの安定性と翻訳効率を向上させるため、マイクロインジェクション11やトランスフェクション7の実験において重要です。共転写キャッピング法では、約80%のキャップ率を持つRNAを40-50 μg生成します。m7Gの3'-ヒドロキシ基がブロックされた3'-0-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA cap analog (ARCA)を使用することで、キャップが正しい方向で組み込まれることが保証される点に注意が必要です17。より大量のRNAをキャッピングする場合、両方の手法において標準的な反応系をスケールアップすることが可能です。しかし、共転写キャッピングでは比較的高価な成分であるキャップアナログを使用するため、コスト面ではVaccinia Capping Systemの方が現実的な選択肢となります。また、Vaccinia Capping Systemはキャッピング効率がほぼ100%に達するため、より優れた手法と言えます。
上述のRNAキャッピング法では、5'末端にCap 0構造を持つRNAを合成します。Cap 1構造は、RNAの5'末端の最初のヌクレオチドのリボース糖の2'-O位に、さらなるメチル化が加わったものです。Cap 1構造はRNAの翻訳効率を高めることが報告されており18、2'-O-メチルトランスフェラーゼを用いることで導入が可能です20, 21。
本論文で述べる手法は、任意のmRNAの転写、キャッピング、およびトランスフェクションに利用できます。本プロトコルでは、多くの利点があることから、特にルシフェラーゼであるGLucおよびCLucを使用しました。これらは細胞培地中に直接分泌されるため、細胞溶解の必要がありません。また、高い生物発光信号強度を示し、活性測定が高感度で容易に実施できるという特徴があります。細胞内でのGLucの発現は、RNA自体の機能以外のさまざまな要因によって影響を受ける可能性があることに注意してください。具体例としては、ピペッティングエラー、ウェルごとの細胞数のばらつき、トランスフェクション効率などが挙げられます。これらの要因を考慮するために、データの正規化が行われます。本プロトコルでは、内部標準としてCLuc RNAをGLuc RNAと共に共トランスフェクションします。GLucの発光強度をCLucのコントロール値で除することで、トランスフェクションにおけるエラーやばらつきが正規化されます19。

<table><tbody><tr><td>T7 High Yield RNA 合成キット</td><td>New England Biolabs</td><td>E2040S</td><td></td></tr><tr><td>3&amp;rsquo;-0-Me-m&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt;G(5&amp;rsquo;)ppp(5&amp;rsquo;)G RNA キャップ構造アナログ</td><td>New England Biolabs</td><td>S1411S</td><td></td></tr><tr><td>DNase I（RNaseフリー）</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>Vaccinia Capping System</td><td>New England Biolabs</td><td>M2080S</td><td></td></tr><tr><td>MEGAclear キット</td><td>Ambion</td><td>AM1908</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 分光光度計</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Nano キット</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1511</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Trans&lt;/em&gt;IT mRNA トランスフェクションキット</td><td>Mirus Bio LLC</td><td>MIR2250</td><td></td></tr><tr><td>HyClone* 古典的液体培地：Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle&amp;rsquo;s Medium, High Glucose</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30285.01</td><td></td></tr><tr><td>HyClone 非必須アミノ酸</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30238.01</td><td></td></tr><tr><td>Centro LB 960</td><td>Berthold Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioLux&lt;em&gt; Gaussia&lt;/em&gt; ルシフェラーゼアッセイキット</td><td>New England Biolabs</td><td>E3300S</td><td></td></tr><tr><td>BioLux &lt;em&gt;Cypridina&lt;/em&gt; ルシフェラーゼアッセイキット</td><td>New England Biolabs</td><td>E3309S</td><td></td></tr><tr><td>RNase インヒビター（マウス）</td><td>New England Biolabs</td><td>M0314</td><td></td></tr><tr><td>RNase インヒビター（ヒト胎盤）</td><td>New England Biolabs</td><td>M0307</td><td></td></tr><tr><td>pCMV-GLuc コントロールプラスミド</td><td>New England Biolabs</td><td>N8081</td><td></td></tr></tbody></table>

hela細胞のトランスフェクションに続いてgaussiaルシフェラーゼmrna のインビトロ転写とキャッピングの

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro転写とは、対応するプロモーター配列（T7、T3、SP6）および転写対象の遺伝子を含む線状DNAテンプレートから、RNAポリメラーゼによってRNA転写産物を合成することである（図 1A）。一般的な転写反応は、テンプレートDNA、RNAポリメラーゼ、リボヌクレオチド三リン酸、RNase阻害剤、およびMg2+イオンを含む緩衝液で構成される。
さまざまなアプリケーションにおいて、高品質なRNAが大量に必要となることがよくあります。 in vitro スプライシングなどのRNAの構造および機能研究において、転写が報告されている。1, 哺乳類細胞におけるRNAi実験2、「エバーワイン法」によるアンチセンスRNA増幅3, マイクロアレイ解析4 およびRNAワクチン研究において5本手法は、放射標識および色素標識プローブの作製にも利用可能です。6ウォーレン、 他 最近報告された、～のトランスフェクションによるヒト細胞のリプログラミング in vitro 転写後のキャップ付きRNA7New England Biolabs社のT7 High Yield RNA Synthesis Kitは、1反応20μlあたり最大180μgのRNAを合成できるように設計されています。本キットを用いて、最大10kbまでの長さのRNAの転写に成功しています。転写対象となる遺伝子の上流にT7プロモーター配列が含まれていれば、線状化プラスミドDNA、PCR産物、および合成DNAオリゴヌクレオチドを転写テンプレートとして使用することが可能です。
真核生物において、RNAへの5'末端キャップ構造の付加は重要なプロセスである。これはRNAの安定性8、効率的な翻訳9、核輸送10、およびスプライシング11に不可欠である。このプロセスでは、RNAの5'三リン酸末端に7-メチルグアノシンキャップが付加される。RNAのキャップ付加は、キャップ付加酵素を用いて転写後に、あるいはキャップアナログを用いて転写同時に行うことができる。酵素法では、Vacciniaウイルスのキャップ付加酵素を用いてmRNAにキャップを付加する12,13。この酵素は、GTPとS-アデノシルメチオニンをドナーとして、RNAの5'末端に7-メチルグアノシンキャップを付加する（キャップ0構造）。どちらの手法においても、トランスフェクションや、リバースジェネティクスシステム用のウイルスゲノムRNAの作製15、eIF4Eなどのキャップ結合タンパク質の結晶学的研究16といった他のアプリケーション14に適した、機能的に活性なキャップ付きRNAが得られる。
以下に述べる手法では、NEB社のT7 High Yield RNA Synthesis Kitを用いて、Gaussia ルシフェラーゼ（GLuc）および Cypridina ルシフェラーゼ（CLuc）のキャップ付きおよびキャップなしRNA転写体を合成します。キャップなしGLuc RNAの一部には、Vaccinia Capping System（NEB社）を用いてキャップ処理を施します。テンプレートDNAとしては、GLucまたはCLuc遺伝子とT7プロモーターを含む直線化プラスミドを使用します。転写されたRNAをHeLa細胞にトランスフェクションし、細胞培養上清中のルシフェラーゼ活性を測定します。キャップ付きCLuc RNAは、GLuc発現を標準化するための内部コントロールとして使用します。

本手法では、Gaussiaルシフェラーゼ（GLuc）遺伝子を含む線状化プラスミドから、キャップ付きおよびキャップなしの両方のmRNAを高収量でin vitro合成する方法について解説します。合成したRNAを精製し、キャップなしRNAの一部にVacciniaウイルスキャッピング酵素を用いて酵素的にキャップを付加します。最終ステップとして、mRNAをHeLa細胞にトランスフェクションし、細胞培養上清のルシフェラーゼ活性を測定します。

HeLa細胞のトランスフェクションに続いてGaussiaルシフェラーゼmRNA のインビトロ転写とキャッピングの

in vitro 転写とは、対応するプロモーター配列を含む線状DNAテンプレートから、RNAポリメラーゼによってRNA転写体を合成することである。

この手順の全体的な目的は、キャップ付きおよびキャップなしのmRNA（Ga luciferaseの転写産物）をHeLa細胞にトランスフェクションし、細胞培養液中のルシフェラーゼ活性を測定することです。まず、T seven high yield RNA synthesis kitを用いて、in vitro転写によりGa luciferaseのキャップなしおよびキャップ付きmRNAを合成します。mRNAのキャッピング方法について、2つの手法を提示します。一方は転写時にキャップアナログを使用し、もう一方は転写後のキャップ付加にワクチニアキャップ付加酵素を使用します。次のステップは、キャップ付加済みおよび未付加のmRNA転写体をHeLa細胞にトランスフェクションすることです。最終的に、未付加またはキャップ付加済みmRNAに由来するルシフェラーゼ活性を、HeLa細胞培養上清において比較します。独自の転写反応系を構築する場合と比較して、この方法の主な利点は、T7 high yield RNA synthesis kitが検証および最適化されており、高収量で、かつ何よりも重要な点として、高品質な全長RNA転写物を産生できることです。これは、RNA翻訳を成功させ、機能的に活性なタンパク質を発現させるために極めて重要です。したがって、この手法はRNAトランスフェクションに関する知見を提供します。また、in vitro転写RNAは、マイクロインジェクション、マイクロアレイ解析、ハイブリダイゼーションベースのブロット、およびRNAの構造と機能の研究などの他のアプリケーションにも利用可能です。この例示反応に使用するDNAテンプレートは、Gaussianルシフェラーゼまたはgluc遺伝子を含む直線化プラスミドです。T7プロモーターを用いることで、キャップ付きおよびキャップなしの両方の産物が合成されます。まず、T7高収量RNA合成キットの構成成分を融解し、氷上で保持します。RNAのコンタミネーションを避けるため、手袋を着用し、ベンチ表面、ピペットおよびその他の器具を十分に洗浄してください。キャップなしRNAを合成する場合、ヌクレアーゼフリーのピペットチップ、チューブおよびガラス器具の使用を強く推奨します。室温で反応系を準備し、まず10 x バッファーと水を加え、次にヌクレオチドとDNAテンプレート、最後にポリメラーゼミックスを加えます。キャップ付きRNAを合成するには、試薬の添加順序が重要です。キャップアナログを用いて同様の反応混合液を作成しますが、ここではキャップアナログヌクレオチドを添加します。標準ヌクレオチドを添加した後、軽くボルテックスして反応成分を混合し、その後パルススピンを行い、ドライエアインキュベーターにて37 °Cで2時間インキュベートします。内部コントロールとして、線状化プラスミドからcLukeのキャップ転写物を合成するための2つ目の反応系を構築します。cLukeの発現は、gluc発現の正規化に使用されます。インキュベーション後、各反応混合物からDNAテンプレートを除去します。70 µLのヌクレアーゼフリー水を加え、続いて10 µLのDNase I反応バッファー、そして2 µLのDNase Iを加えます。DNase Iを37 °Cのドライエアインキュベーターで15分間反応させます。次に、スピンカラムベースの任意のRNA精製キットを用いて反応液を精製し、NanoDrop TM分光光度計を用いてRNA量を定量します。最後に、Agilent RNA 6,000 nano KitおよびAgilent 2100バイオアナライザーを用いてRNAの品質を評価します。標準的なキャッピング反応を行うために、精製した未キャプキャップgluc mRNA 10 µgを15 µLのヌークleaseフリー水に溶解します。これは適宜スケールアップ可能です。RNAを65 °Cで10分間加熱して二次構造を解消し、その後5分間氷上に置きます。キャッピング反応を準備するために、キャッピングバッファー、GTP、新鮮に希釈したS-アデノシルメチオニン、およびワクシニアキャッピング酵素を、変性させたRNAに加えます。反応成分を軽くボルテックスし、パルススピンを行い、ドライエアインキュベーターを用いて37 °Cで30分間反応させます。インキュベーション後、前のセクションの最後で行った手順に従ってRNAの精製および分析を行います。まず、HeLa細胞を播種します。48ウェルプレートの28ウェルに、1ウェルあたり70～230,000個の細胞と、10%血清を添加した高グルコースDMEM 150 µLを分注します。細胞が60〜90%コンフルエントになるまで、37 °Cでプレートをインキュベートします。これには通常16〜24時間かかります。細胞の準備ができたら、トランスフェクション混合液を調製します。RNAを100 ng/µLの濃度に希釈します。次に、3種類の異なる反応のために24本のマイクロ遠心チューブを準備します。各反応を8本のチューブに重複して分注します。各チューブに、キャップを開けた状態で1 µLのgluc RNA、標準化のためにキャップを閉じた状態で1 µLのc luke RNA、および25 µLの serum free を加えます。DMEMをピペッターを用いて、次の8本のチューブに十分に混合します。同様の反応系を構築しますが、最後から8本のチューブには、キャップアナログを用いて調製したキャップ付きgluc RNAを、キャップなしのgluc RNAの代わりに追加します。また、最初の8本のチューブには、キャップアナログを用いて調製したgluc RNAの代わりに、ワクシニア反応で得られたキャップ付きgluc RNAを加え、さらに0.2 µLのmRNA boost試薬を混合し、続いて0.2 µLを混合します。Transit mRNA試薬を用いて、反応を室温で5分以内で進行させます。反応開始から2分後、各混合液を培養細胞が入ったウェルに滴下し始めます。この手順を、ワクシニア反応で得られたcap、アナログcap gluc、RNA、およびcapped gluc RNAを含む次の2組のチューブについても繰り返します。4つのウェルを陰性対照として残し、細胞を37°C、5% carbon dioxide条件下で一晩インキュベートします。Glucアッセイには、Biox GIA Luciferase assay kitを用いて上述の手順を行います。Biox gluc assay buffer 1.5 mLにBiox gluc substrate 15 µLを加えて、新鮮なアッセイ溶液を調製します。最終混合液をボルテックスしないでください。CLUアッセイのため、チューブを転倒させて混合します。100倍濃度の基質を調製し、 freshly reconstitute（直前に再構成）してください。次に、再構成した基質15 µLをBlu Cienaルシフェラーゼアッセイバッファー1.5 mLに加えて、アッセイ溶液を作成します。C Lukeアッセイ溶液をボルテックスせずに混合し、遮光した状態で室温で30分間インキュベートします。これでアッセイ溶液の準備が完了しました。マイクロプレートルミノメーターを用いて細胞の発光を測定します。ルミノメーターの設定を、アッセイ溶液 50 µL を 2～10 秒かけて注入するように調整します。次に、各細胞培養上清 10 µL を 96 ウェル黒色プレートの各ウェルに転移させます。アッセイ液でインジェクターをプライミングし、ルミネッセンスの測定に進みます。T7高収量RNA合成キットを使用し、Agilent 2100バイオアナライザーで分析した場合、1反応（20 µL）あたり最大180 µgの非キャップRNA、および40〜50 µgのキャップRNAを合成することが可能です。良好な品質で完全な状態です。RNAは、RNA転写物を表す単一の鋭いピークを示すはずです。幅の広いピークや複数のピークが見られる場合は、RNAの分解を示しています。また、RNAのサイズを確認することも重要です。予想よりも長い転写産物が得られた場合は、テンプレートプラスミドの消化が不完全であった可能性があります。DNA/RNAの分解や収率の低下は、通常、テンプレートから反応系に混入した不純物が原因です。DNAトランスフェクション後、インキュベーションを行い、ルシフェラーゼ活性を測定しました。5'キャップ構造は、エキソヌクレアーゼによる分解からRNAを保護し、翻訳開始を促進するために重要です。したがって、RNAキャッピングはトランスフェクション実験において不可欠な工程です。キャップ付き転写産物とキャップなし転写産物をトランスフェクションした細胞培養間での発光量の測定値の差がこれを明確に裏付けており、また、キャップアナログを用いる手法とワクシニアキャッピング酵素を用いる手法のいずれのキャッピング技術においても、機能的なキャップ付きRNA転写産物が正常に生成されることが示されています。このビデオを視聴することで、トランスフェクションおよびその他の様々なアプリケーションに使用するための、高品質なキャップ付きRNA転写産物の合成方法について十分に理解することができたはずです。

in-vitro-transcription-capping-gaussia-luciferase-mrna-followed-hela

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

幹細胞治療への関心の高まりとともに、分子イメージング技術は、移植後の幹細胞の挙動のモニタリングに最適です。ルシフェラーゼレポーター遺伝子は、細胞の生存、場所、およびin...

in vitroおよびヒト胚性幹細胞のin vivoでの生物発光レポーター遺伝子イメージングの

ここに我々は彼らの成長と転移時に転移性乳癌細胞で発現ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼ酵素の両方の生物発光反応を構築可視化し、定量化するための方法を説明...

生体デュアル基質生物発光イメージングにおける

概日時計は、個々の細胞内で機能する、すなわち、それらは細胞自律的である。ここでは、非侵襲的、ルシフェラーゼベースのリアルタイム生物発光技術を用いた細胞自律的なクロックモデルを生成するための方法を説明します。レポーター細胞は、概日生物学を研究するのに扱いやすい、機能的なモデル系を提供する。...

ルシフェラーゼ生物発光レポーターを用いた遺伝子発現のモニタリング細胞自律的な概日時計のリズム

細胞プロセスのシステム·レベルの理解を達成することは、現代の細胞生物学の目標です。我々はここでゲノム規模のRNAiライブラリーを用いた遺伝子の機能を調べるために、様々な細胞機能のエンドポイントのルシフェラーゼレポーターを多重化するための戦略について説明します。...

培養細胞における癌関連シグナル伝達を問い合わせるための多重ルシフェラーゼベースのスクリーニング·プラットフォーム

このビデオの記事では、細胞におけるタンパク質発現の誘導のために修飾されたmRNA のインビトロ合成を記載する。...

ヒト細胞におけるタンパク質発現の誘導のために修飾されたmRNAのインビトロ合成における

セルベースの​​システムにおけるマラリアのタンパク質の発現は、依然として厳しいです。我々は、HeLa細胞からマラリアrhoptry組換えタンパク質を発現するための2つのステップと、一段階IVT（ インビトロ翻訳 ）無細胞発現系を示します。我々はrhoptryタンパク質を精製するのNi-樹脂親和性に基づく精製システムを使用しています。...

の発現のためのHeLaベースの無細胞発現系<em&gt;マラリア原虫</em&gt; Rhoptryタンパク質

GL261神経膠腫細胞は、神経膠芽腫の有用な免疫適格動物モデルを提供します。このプロトコルの目標は、in vivo 生物発光イメージングを使用して頭蓋内腫瘍の成長を監視するための適切な技術を実証し、腫瘍免疫学および神経膠芽腫を治療するための免疫療法アプローチを研究するためのルシフェラーゼ修飾 GL261...

神経膠芽腫のための免疫担当動物モデルの生物発光イメージング

この作業では、活性エンハンサーがどのように特定され、実験的に検証されるかについての実験的なワークフローを提供します。...

レチノイン酸誘導された胚性幹細胞分化の間に活性化された予測と遺伝子調節要素の検証

このプロトコルでは、転写調節の眠れる森の美女システムによって人間のゲノムへの興味の遺伝子の安定した統合を実現する方法について説明します。統合導入された細胞の分子アッセイ、ひと細胞の体外伝達不良レンチウイルスベクターの作製が報告されます。...

統合欠陥レンチウイルスベクターにパッケージ化された転写調節睡眠美容システムによって効率的な体外転位法

ここでは、スクリーニングフォーマットにおけるeIF4F複合ダイナミクスの薬物誘発摂動を評価することを可能にする生細胞におけるeIF4E-eIF4G相互作用を測定するプロトコルを提示する。...

ライブセルにおけるeIF4E-eIF4G相互作用を測定してeIF4Fアセンブリをモニタリング

ここでは、ショウジョウバエ胚を用いた溶解液の調製方法と体外翻訳の方法について詳しく説明します。...

ショウジョウバエ溶解液における細胞フリーin vitro mRNA翻訳

学ぶ HeLa細胞へのキャップ付き・無しGaussiaルシフェラーゼmRNAトランスフェクション法。T7高収率RNA合成キットとVacciniaウイルスキャッピング酵素を用いて、in vitro転写と酵素学的キャッピングを実施し、ルシフェラーゼ活性を測定する。

HeLa細胞のトランスフェクションに続いてGaussiaルシフェラーゼmRNA のインビトロ転写とキャッピングの

さらに動画を探す