胎児性アルコール暴露のゼブラフィッシュモデルの催奇形性変化を評価する

この手順の全体的な目的は、ゼブラフィッシュの発生過程におけるエタノール曝露の影響を調べることです。まず、発生初期のゼブラフィッシュを、通常胚水に溶解した特定量のエタノールに曝露させます。次に、エタノールを除去し、目的の時点まで魚を成長させます。

次に、対照群の胚と比較して、処理後の胚における肉眼的な物理的変化および遺伝子発現の変化を解析します。最後に、mRNA、モルフォリノ、または薬剤を用いて胚を操作し、エタノールによって誘発された発育不全が改善または変化するかどうかを判定します。最終的に、定量PCRとin situ ハイブリダイゼーションを組み合わせることで、発育中のゼブラフィッシュ胚に対するエタノールの影響が遺伝子発現の変化に関連していることが示されます。

遺伝子発現レベルをその後に操作することで、エタノール誘発性の発生異常を改善または防止できる可能性があります。本日ご紹介する手法は、胎児性アルコール症候群の性質に関する知見を広げるとともに、脊椎動物における発生過程を保存するものです。本日の実演は、私の研究室の技術者であるSteph Erhardtが行い、胚へのエタノール処理について解説します。

野生型の交配により得られた胚を、胚用水を用いて28°Cでドーム期まで育成させます。1クラッチの胚を、1皿あたり10〜50個になるように、目的の皿数に分けて分配します。魚用水で0.2〜2.5% (v/v)に調製したエタノール溶液を胚に加え、目的の曝露時間が経過した後、最大24時間までインキュベーターに戻します。

定量PCR用のmRNAを回収するため、発生の特定の期間において、水を含むエタノールを新鮮な胚培養水に交換します。マッチしたH胚をエッペンドルフチューブに入れます。魚の培養液を除去し、TCEPを含む溶解バッファーを加えます。

電動パルバライザーを用いて胚を物理的に解離させ、その後、遠心機に入れて低速回転させます。溶出物をプリクリアカラムに移し、カラムを遠心分離します。これにより、解離した大きな破片を除去します。

RNA単離キットを用いてRNAを抽出します。次に、QPCRまたはマイクロアレイ解析の標準的な方法を用いてcDNAを合成し、in situ ハイブリダイゼーションおよび抗体染色のための胚を調製します。受精後6〜24時間の胚を4%パラホルムアルデヒド中で4°Cにて一晩固定し、その後、PBSおよび0.1%Tweenで3回洗浄します。

顕微鏡下で2本の鋭いピンセットを用いて、卵膜（choon）を除去します。次に、メタノールの濃度を上げ、PBTの濃度を下げる段階的な液置換を行い、胚をメタノールへと移行させます。胚を100% methanolに移した後、軟骨を染色するために-20°Cで保存します。

受精後5日から6日まで胚を育成させます。4℃で4%パラホルムアルデヒドを用いて一晩固定します。その後、PBTで3回洗浄し、エタノール曝露によってどの遺伝子発現レベルが変化したかを判定します。

まず、プライマーを設計し、その妥当性を検証することでQPCRを実施します。3つの生物学的サンプルを用いてテストを行ってください。これらのコントロールとなる生物学的サンプルは、目的の遺伝子がその特定の年齢で発現していれば、どのような年齢のものでも構いません。

プライマーの検証が完了したら、 previously prepared CDNA を用いて qPCR を行います。サンプルは 3 回繰り返し（triplicate）で測定し、ゼブラフィッシュのコントロールとして gapdh のプライマーを用いたコントロールサンプルを含めてください。結果を gapdh のレベルで標準化します。その後、$\Delta\Delta$Ct 法を用いて遺伝子発現の相対レベルを算出します。

野生型に対する実験群の差異を示す、2つのΔΔCt法による変動。Cでは、2つのハイブリダイゼーション構築物を示す。標的遺伝子にラベル化したリボプローブを導入する。

次に、標準的な条件下で、週齢を合わせた胚とともにインキュベートし、アルカリフォスファターゼを用いてハイブリダイゼーションパターンを検出します。解剖顕微鏡を用いてサンプルを撮影し、口の形状などの形態形成上の発達を評価します。また、生存胚を撮影し、眼間距離および体長を評価します。まず、胚をパラホルムアルデヒドで固定します。その後、画像を収集し、幼生における軟骨構造の発達に対するアルコール処理の影響を検討します。

イメージングの前に胚を固定し、透明化するため、lcとblueを用いて数時間から一晩静置し、固定および透明化を行います。生存胚における細胞死を解析するため、5 mg/mLのアニリンオレンジを含むPBS中で胚を1時間インキュベートします。胚をPBSで3回洗浄した後、スライドグラスにマウントし、共焦点顕微鏡を用いてサンプルを撮影し、Zスタック画像から合成画像を作成します。

エタノール曝露により発現が低下した遺伝子を特定した後、目的遺伝子のキャップ付きmRNAを25〜200 pg/nLの濃度で1〜2細胞期の胚に注入します。卵を28 °Cに加熱したインキュベーター内でドーム期に達するまで回復させ、その後、前述と同様にエタノールで処理します。エタノール曝露の結果として発現が増加した遺伝子については、アンチセンスモルフォリノをpg〜ng量、1〜2細胞期の胚に注入してノックダウンを行います。

このプロトコールは、キャップ付きmRNAのものと同様です。mRNAやスプライシングモルフォリノを注入する場合は、R-T-P-C-Rを用いて効率を測定し、スプライシング済み転写物と未スプライシング転写物の量を比較して、用量依存的な遺伝子活性を分析してください。注入するモルフォリノの量を調整し、エタノールで処理する前に、胚を目的の段階まで発生させます。ゼブラフィッシュの胚をエタノールに曝露させると、他の脊椎動物で見られる表現型に関連した、多くの発生上および遺伝的な欠陥が生じます。

Noorを含む軸組織の異常発達は、noordの短縮や、場合によっては断絶を引き起こし、それが一部となって、ここで示されているような後の体節における異常につながります。未処理の対照群は強いシェブロン形状を示しますが、エタノール処理した体節は、sonic hedgehogシグナリングの減少で見られるU字型の外観を呈します。ここに見られる通りです。

エタノール曝露のもう一つの結果として、初期の発達遅延およびそれに続く神経系の欠陥の下流で起こる可能性のある、胚の体長の短縮が見られます。この知見は、発達期にエタノールに曝露した子供に見られる、思春期前状態の持続や低身長と類似しており、ゼブラフィッシュモデルがこのヒトの先天性疾患を理解する上で有用であることを示唆しています。動物モデルにおいては、深刻なエタノール曝露が、microcephaly（小頭症）やophthalmia（眼疾患）を含む顕著な胎児性アルコール症候群の表現型を引き起こすことが実証されています。

ゼブラフィッシュにおいて、眼間距離（IOD）はエタノール投与量に依存して減少しており、これはヒトの出生欠損の性質と一致しています。眼球欠損（Opia）は非常に高用量でのみ認められますが、低用量であってもIODの有意な減少が引き起こされることから、この動物モデルは正中顔面形成において同様の欠陥を有していることが示唆されます。この図では、未処理およびエタノール処理を施した胚におけるsix3bおよびgli1の初期遺伝子発現レベルを比較しています。

エタノール処理を施したサンプルでは、両方の遺伝子において発現レベルの低下が認められました。NC 2ハイブリダイゼーションを用いて、six3bおよびgooIDの発現パターンを解析した結果が示されています。ここで、未処理の対照群と比較して、エタノール処理を施した胚では、両遺伝子の空間的発現が減少していることが示されました。

両方の遺伝子が、将来的に頭部の正中面組織となる組織で発現しているため、受精8時間後の発現低下は、その後の発生過程におけるIODの減少と一致しています。エタノールによって影響を受ける遺伝子が特定されれば、それらの発現を増減させるメカニ즘が存在します。この例では、gli1レベルを上昇させるリガンドであるsonic hedgehogのmRNAを注入したところ、gli1の減少およびエタノール処理された胚における形態的な欠損が回復しました。

しかしながら、six three Bを注入しても、エタノール曝露による表現型を救済することはできませんでした。このビデオを視聴することで、発達中のゼブラフィッシュ胚においてエタノールによって生じる遺伝的および発達的欠損を調べる方法について、十分に理解できたはずです。ここで用いた手法は、発達中の脊椎動物胚における他の水溶性化合物の毒性を研究したい場合にも適用可能です。