胎児性アルコール暴露のゼブラフィッシュモデルの催奇形性変化を評価する

この手順の全体的な目標は、エタノール曝露が発育中のゼブラフィッシュに及ぼす影響を研究することです。これは、最初にゼブラフィッシュを発生初期に正常な胚水中のエタノール用量にさらすことによって達成されます。次に、エタノールを除去し、魚を所望の時点まで成長させる。

その後、全体的な物理的変化と遺伝子発現の変化の両方が、対照胚と比較して治療でアッセイされます。最後に、胚をmRNA、モルフォース、または薬物で操作して、エタノールによって誘発される発生障害を変更できるかどうかを判断します。最終的に、定量的PCRとCでの2つのハイブリダイゼーションの組み合わせにより、ゼブラフィッシュの胚の発生に対するエタノール効果が遺伝子発現の変化に関連していることが示されています。

その後の遺伝子発現レベルの操作は、エタノール誘発性発生障害を改善または防止し得る。今日私たちが示している技術は、胎児性アルコール症候群の性質に関する知識を広げるだけでなく、脊椎動物の発達過程を保存するものです。今日デモンストレーションするのは、私の研究室の技術者であるステフ・エアハルトです エタノールで胚を治療する。

野生型の交配から胚水で摂氏28度のドームステージに育てます。クラッチからの胚を、皿ごとに10〜50個の胚で希望の数の皿に分割します。魚水中の体積に対して0.2〜2.5%のエタノール溶液を胚に加え、所望の曝露時間後最大24時間インキュベーターに戻します。

エタノールを含む水を特定の発生期間新鮮な胚水に置き換えて、定量的PCR用のmRNAを収集します。H一致した胚をeinorチューブに入れます。魚の水を取り除き、TCEPで溶解緩衝液を追加します。

電動粉砕機を使用して、胚を物理的に解離し、遠心分離機に入れてゆっくりと回転させます。溶質をプリクリアカラムに移し、カラムを遠心分離します。関連付けが解除された大きなピースを削除します。

RNA単離キットを使用してRNAを抽出します。次に、QPCRまたはマイクロアレイ解析の標準的な方法を使用してCDNAを合成し、C twoハイブリダイゼーションおよび抗体発現のための胚を調製します。受精後6〜24時間で、受精後6〜24時間で、摂氏4度で一晩、3回の洗浄とPBSプラス0.1%トゥイーンの後、固定します。

顕微鏡下で2つの鋭い鉗子を使用してチューンを取り除きます。次に、メタノール濃度の増加とPBT濃度の減少の一連の液体変化を使用して、胚をメタノールに移動します。胚を100%メタノールに移した後、マイナス20°Cで保存して軟骨を染色します。

受精後5〜6日に胚を育てます。摂氏4度の4%パラホルムアルデヒドで一晩固定します。次に、PBTで3回洗浄して、エタノール曝露によって遺伝子発現レベルが変化したかを判断します。

QPCRを実行するには、まずプライマーを設計してプライマーを検証します。3つの生物学的サンプルでそれらをテストしてください。これらの対照生物学的サンプルは、目的の遺伝子がその特定の年齢で発現している限り、任意の年齢にすることができます。

プライマーが検証されたら、事前に調製したCDNAを使用してQPCRランニングサンプルをトリプリケートで実行し、ゼブラフィッシュコントロールのコントロールサンプルを含めて、プライマーを使用してdhをギャップします。結果をギャップDHレベルに正規化します。次に、強力な方法を使用して遺伝子発現の相対レベルを計算します。

野生型と比較した実験の違いを示す2デルタデルタCTのバリエーション。Cでは、2つのハイブリダイゼーションコンストラクト。目的の遺伝子にリボプローブを標識しました。

次に、標準条件を使用して年齢が一致した胚とインキュベートし、アルカリホスファターゼを使用してハイブリダイゼーションパターンを検出し、解剖顕微鏡を使用してサンプルを画像化し、形態形成の発達を評価します。まず、胚をパラホルムアルデヒドで固定します。次に、画像を収集して、幼虫染色の発達中の軟骨構造に対するアルコール処理の影響を調べます。

lcとblueを使用してゼブラフィッシュを数時間固定し、イメージングする前に胚を一晩保持して透明にします。生きた胚の細胞死を解析するには、PBS中のaine orange1ミリリットルあたり5ミリグラムで1時間インキュベートします。胚をPBSで3回洗浄し、次に胚をスライドにマウントし、共焦点顕微鏡を使用してサンプルをイメージングし、Zシリーズを使用して複合材料を作成します。

エタノール曝露により発現が低下した遺伝子を同定した後、目的の遺伝子のキャップ付きmRNAのナノリットルあたり25〜200ピコグラムを1〜2細胞ステージに注入します。卵がドームステージに達するまで摂氏28度の加熱インキュベーターで卵を回復させ、その後、以前と同様にエタノールで処理します。エタノール曝露の結果として発現が増加した遺伝子については、ピコグラムからナノグラムの量のアンチセンスモルフォを1〜2細胞期の胚に注入してノックダウンします。

このプロトコールは、キャップ付きmRNAのプロトコールと似ています。mRNAを注入する場合、スプライシングモルフォは、R-T-P-C-Rを使用して効率を測定し、スプライシングされた転写物とスライスされていない転写物の量を比較して用量依存的な遺伝子活性を分析し、注入されたモリノを滴定し、胚を所望の段階まで成長させてからエタノールで処理します。ゼブラフィッシュの胚がエタノールにさらされると、他の脊椎動物に見られる表現型に関連する多くの発生的および遺伝的欠陥が生じます。

ヌールを含む軸組織の異常な発達は、ヌードの短縮と時折の破壊につながり、これは部分的には、ここに示すように体節の後の異常につながります。未処理のコントロールは強いシェブロン形状をしていますが、エタノール処理された体節は、音波ヘッジホッグシグナル伝達が減少したU字型の外観を帯びています。ここに示すように。

エタノール曝露の別の結果は、おそらく初期発生遅延とその後のヌール欠損の下流にあるのは、胚の長さの短縮です。この知見は、発育中にエタノールに曝露された子供に見られる思春期前の低身長の持続性に類似しており、ゼブラフィッシュモデルがこのヒトの先天性欠損症の理解に関連していることを示唆しています。動物モデルでは、重度のエタノール曝露が、合成やオピアなどの顕著な胎児アルコール症候群の表現型につながることが示されています。.

ゼブラフィッシュでは、眼内距離またはIODは、ヒトの先天性欠損症の性質と一致するエタノール用量依存的に減少します。Opiaは非常に高い用量でしか発見されませんが、低用量ではIODが大幅に減少し、この動物モデルが正中線の顔の発達に同様の欠陥があることを示唆しています。この図では、未処理の胚とエタノール処理した胚で、初期の遺伝子発現レベルである6つの3つのBとglee Oneを比較しています。

両方の遺伝子は、エタノール処理サンプル中の発現レベルの低下を示しました。NCツーハイブリダイゼーションを用いて、6つの3つのBとgooIDの発現パターンを以下のように解析した。ここで、両方の遺伝子は、エタノール処理された胚において、未処理の対照と比較して空間発現の減少を示しました。

どちらの遺伝子もC頭蓋顔面正中線組織になる運命にある組織で発現しているため、受精後8時間でのそれらの減少は、発生後のIODの減少と一致しています。エタノールの影響を受ける遺伝子が特定されると、その発現を増加または減少させるメカニズムがあります。この例では、グリーワンのレベルを増加させるリガンドであるソニックヘッジホッグにmRNAを注入し、グリーワンとエタノール処理胚の減少によるグロス欠損を救出しました。

しかし、6つの3つのBの注射は、エタノールに曝露された表現型を救うことができませんでした。このビデオを見れば、発生中のゼブラフィッシュの胚であるエタノールが作り出す遺伝的および発生的欠陥を探る方法についてよく理解できるはずです。ここで使用した技術は、発生中の脊椎動物の胚の他の水溶性化合物の毒性を研究したい人にも適用できます。