I ·クライオキットを使用してマウスの精子の凍結保存と回復
December 12th, 2011
ここでは、マウス精子の凍結保存のための新開発のI•クライオキットを示しています。凍結融解精子を持つ二細胞期胚の開発は、このキットの使用で5マウス系統で一貫して改善された。 1.5年の期間に、49遺伝子改変マウス系統は、I•クライオキットで精子の凍結保存によってアーカイブされ、後に正常IVFによって回収。
この手順の全体的な目標は、マウスの精子を凍結保存することです。これは、最初にクライオ保存ストローを使用してマウスEPIから精子を収集することによって達成されます。その後、ストローは液体窒素で凍結され、温水で解凍して回収されるまで保管されます。
回収されたマウス精子は、最終的に体外受精に利用されます。既存の方法に対するこのキットの主な利点は、キットがマウスの精子を凍結保存し、回復するために必要なすべての材料が含まれていることです。まず、凍結保存するマウスのラインごとに15個の精子凍結保存ストローを組み立てることから始めます。
まず、0.25ミリリットルのストローを1ミリリットルのシリンジに、シリンジに最も近い綿のプラグで接続します。次に、各ストローに8センチメートルの体外受精培地をロードし、続いて1センチメートルの空気を入れます。第三に、15本のストローのそれぞれに、凍結保存する各ラインの保存するラインの名前をラベル付けします。
4ウェルディッシュのウェルに240マイクロリットルの凍結保護剤を入れます。冷凍キャニスターのハンドルに1ミリリットルのピペットを取り付けて、ハンドルを伸ばします。最後に、キットに付属の発泡断熱ボックスに15センチメートルの液体窒素を入れ、蓋を閉めます 安楽死。
2匹の肥沃な成体のオスのマウス。各ラインを凍結保存して外科的に行うには、それらのコダルEPIを削除します。マウスを背側レキュに置き、腹側体壁を開きます。
広大な敬意をそっと引っ張り、余分な脂肪を取り除きます。次に、精巣上体を見つけ、小さな片片の速い敬意でそれを無傷で取り除きます。EPIを、CPAを充填した準備済みの4ウェルディッシュのウェルに、解剖スコープで入れます。
各精巣上体に5〜7本の縦方向の切り込みを入れます。次に、鉗子を使用して、各速い差を静かに絞ります。精子を送り出すには、CPAと精巣上体の混合物を室温で3〜5分間インキュベートします。
インキュベーション中に手で皿を2〜3回静かに攪拌します。これにより、精子は吸引によって泳ぎ出すことができます。準備した各ストローに5ミリメートルの精子懸濁液を入れ、続いて1センチの空気
を入れます。冷凍プロセスでは、すべてのストローが均等にロードされることが重要です。15本のストローをすべてセットした後、各ストローの両端を慎重にヒートシールします。精子の生存を確保するために、10分以内に15本のストローすべてのプロセスを完了します。
すべてのストローが準備できたら、冷凍キャニスター精子カラムに入れます。まず、キャニスターをフォームボックスに入れ、液体窒素に垂直に浮かべます。10分間、キャニスターは垂直に浮かぶ必要があり、そうしないと精子の凍結速度が影響を受けます。
次に、キャニスターを液体窒素に浸します。したがって、精子は凍結保存され、液体窒素の長期保存の準備ができています。計画された精子の回復の約60時間前。
体外受精の前に女性を超排卵するために書かれたプロトコルに従ってください。解凍するストローごとに、摂氏37度と二酸化炭素5%で少なくとも1時間、すべての培地を準備し、平衡化します。これらの材料には、油で覆われた90マイクロリットルの精子処理培地を備えた35ミリメートルのシャーレが含まれます。
35ミリメートルのペトリ皿と3ミリリットルの体外受精培地は、カッティングディッシュとして機能し、5人の超排卵女性ごとに体外受精皿の500マイクロリットルをロードした4ウェルディッシュの1ウェルである体外受精皿を準備します。各IVF皿には、3ミリリットルのKSOMが入った35ミリメートルのペトリ皿である洗浄皿と、油で覆われた50マイクロリットルのKSOM培地が入った35ミリメートルのペトリ皿である胚培養皿を準備します。必要な材料がすべて揃ったら、ストローを保管庫からすばやく取り出し、摂氏37度のウォーターバスに2〜3分間入れます。
ストローを乾かします。次に、コットンプラグの下の空気柱に角度を付けて切り込みを入れます。ストローのもう一方の端で、別の気柱の上に別の角度のついたカットを作ります。
精子柱を切ることは避けてください。次に、200マイクロリットルのピペットを使用して、ストローの端から精子懸濁液を吸引し、精子処理培地の中央に沈着させます。落とす。次に、皿を45〜60分間インキュベートします。
精子の孵化中に、超排卵した女性のucsを分離し、それらをカッティング皿に移します。30ゲージの針または鉗子を使用して各卵管を引き裂き、卵丘細胞複合体を放出します。5人の女性から各IVFにCセシウムを移します。
まあ、最小限のメディアで。汚れた培地は受精効率を阻害するため、脂肪や血液の移し替えは避けてください。インキュベーション後、STMドロップの周辺から10〜15マイクロリットルの精子懸濁液を収集し、懸濁液を1つのIVFに沈着させます。
さて、受精のために細胞を4〜6時間共培養します。受精後、胚を洗濯皿で少なくとも2K SOM洗浄液に通します。次に文化。
KSOMの胚は、目的の発達段階に達するまで。チャールズリバー近交系マウス5系統の精子を凍結した。精子の運動性と急速な進行性の運動性の保護率は、それらの精子からの5つの系統にわたって81%から47%の範囲でした。
凍結融解精子の体外受精率は、1年半で26〜88%の異なる株で変化しました。合計49のGMマウス系統が精子凍結保存によってアーカイブされ、後にIVFによって4つの異なる雌株で回収されました。C、57、黒、6、BC、DBA、1、29、SVをマスターすると、精子凍結保存技術を適切に行えば30分で完了します。
この手順では、キャニスターに垂直に流れ、窒素を液体に流すことが重要です。
概要
この研究では、マウスの精子の効果的な凍結保存のためのI•Cryoキットを提示し、複数のマウス系統で胚の発育が向上することを実証しています。このキットは、精子の凍結保存を通じて遺伝子組み換えマウス系統のアーカイブを可能にし、その後の体外受精（IVF）による回復を容易にします。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 生殖生物学
- 凍結保存技術
- 体外受精（IVF）
背景
- マウスの精子凍結保存は遺伝子研究にとって重要です。
- 既存の方法は効率性や使いやすさに欠ける可能性があります。
- I•Cryoキットは凍結保存プロセスを合理化することを目的としています。
- 精子の成功的な回復はIVFの結果に不可欠です。
研究の目的
- マウスの精子を凍結保存する際のI•Cryoキットの有効性を評価すること。
- 凍結保存された精子が胚の発育に与える影響を評価すること。
- 将来の研究のために遺伝子組み換えマウス系統をアーカイブすること。
使用された方法
- 凍結保存用ストローを使用してマウスの副精巣から精子を採取すること。
- 長期保存のために液体窒素で精子を凍結すること。
- IVF手順で使用するための精子の解凍。
- 異なる系統間での精子の運動率とIVFの成功率の評価。
主な結果
- I•Cryoキットを使用した5つのマウス系統で胚の発育が向上しました。
- 49の遺伝子組み換えマウス系統が正常にアーカイブされ、回復されました。
- 精子の運動率は系統間で81%から47%の範囲でした。
- 凍結融解後の精子によるIVF率は26%から88%でした。
結論
- I•Cryoキットは精子の凍結保存の効率を大幅に向上させます。
- 遺伝子組み換え系統の成功的な回復は研究におけるその有用性を裏付けています。
- 方法のさらなる最適化により処理時間を短縮できる可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Mouse sperm cryopreservation provides a cost-effective and scalable solution for archiving genetically modified strains, reducing reliance on live animal colonies and mitigating risks of line loss. The I•Cryo kit enhances predictive confidence in strain preservation by improving post-thaw sperm motility and IVF-derived embryo development across multiple inbred backgrounds. This supports strategic portfolio management in preclinical research by enabling reliable long-term storage and on-demand recovery of valuable disease models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional validation of genetic models by ensuring recoverability of sperm for IVF-based phenotypic screening.
- Operational Value: Reduces animal husbandry burden and costs associated with maintaining live colonies of low-throughput or inducible models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized sperm source for consistent IVF assays, supporting reproducible compound effect evaluation in fertilization and early embryonic development.
- Operational Value: Facilitates assay readiness through cryobanked sperm, eliminating variability from male-to-male or batch-to-batch differences in fresh sample collection.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains genetic integrity of disease models over time, enabling longitudinal studies and cross-generational experimental continuity.
- Operational Value: Supports multi-site collaboration by allowing distribution of cryopreserved sperm instead of live animals, reducing transport complexity and biosafety concerns.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery workflow from early model generation through preclinical validation, serving as a bridge between genetic engineering and functional phenotyping via IVF.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling recovery of cryopreserved sperm for IVF, allowing assessment of genetic modifications on fertility and early embryogenesis.
- Screening: Enables standardized IVF-based assays using thawed sperm, improving reproducibility in evaluating sperm function, capacitation, and fertilization competence.
- Analytics: Generates quantitative readouts such as sperm motility (% progressive), rapid progressive motility, and embryo development rates, which inform go/no-go decisions on model stability.
- Translational Research: Connects genetic modification to developmental outcomes by enabling IVF with cryopreserved sperm, supporting biomarker-linked phenotypic screening in preimplantation embryos.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable cryobanking platform for ongoing archiving and recovery of GM lines, reducing redundant rederivation efforts across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in model preservation by demonstrating improved motility and embryo development over basic CPA methods.
- Operational Value: Standardizes cryopreservation workflow through kit-based components, reducing user variability and training time.
- Strategic Value: Lowers long-term costs of strain maintenance and reduces risk of irreversible line loss due to breeding failure, genetic drift, or pathogen outbreak.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of GM lines for archiving based on strategic value, with confidence in future recoverability.
Implementation Considerations
- Requires technical proficiency in sperm collection, straw handling, and heat sealing to ensure sample integrity.
- Depends on access to liquid nitrogen storage and controlled thawing equipment (37°C water bath) for consistent post-thaw performance.
- Necessitates standardized IVF media and superovulation protocols for reliable fertilization and embryo culture outcomes.
- Performance may vary across genetic backgrounds, necessitating strain-specific optimization of incubation and washing steps.
- Limited by the need for fertile females and IVF expertise for sperm recovery, restricting direct application to natural mating-based assays.
