I ·クライオキットを使用してマウスの精子の凍結保存と回復

この手順の全体的な目的は、マウス精子を凍結保存することです。まず、凍結保存用ストローを用いてマウスの精巣上体（EPI）から精子を回収します。次に、ストローを液体窒素中で凍結させ、温水で解凍して回収するまで保存します。

回収されたマウス精子は、最終的に体外受精に使用されます。既存の手法に対する本キットの主な利点は、マウス精子の凍結保存および回収に必要なすべての材料がキットに含まれていることです。一般的に、この手法に不慣れな方は、ストローの取り扱いおよび充填に苦労することがあります。まず、凍結保存するマウスの系統あたり15本の精子凍結保存用ストローを準備します。

まず、各0.25 milliliterストローを1 milliliterシリンジに接続します。このとき、綿プラグがシリンジに近い側にくるようにしてください。次に、各ストローにIVF培地を8 centimeters分、続いて空気を1 centimeter分充填します。最後に、凍結保存する各系統について、保存対象の系統名を15本の各ストローに記載します。

4ウェルディッシュのウェルに240 µLの凍結保護剤を満たします。凍結キャニスターのハンドルに1 mLピペットを取り付け、ハンドルの長さを延長します。最後に、キットに付属のフォーム断熱ボックスに15 cmまで液体窒素を満たし、蓋を閉じて安楽死させます。

生殖能のある成体雄マウス2匹を用意します。凍結保存および外科的手法を用いる各系統について、尾側EPIを除去します。マウスを背臥位にし、腹壁を切開します。

広背筋をそっと引っ張り、余分な脂肪を除去します。次に、精巣上体を特定し、少量の広背筋と共にそのまま摘出します。解剖顕微鏡下で、CPAを満たした準備済みの4ウェルディッシュのウェルに精巣上体を入れます。

各精巣上体に5〜7本の縦切り目を入れます。次に、ピンセットを用いて、各切り目を軽く圧迫します。精子を押し出すため、CPAと精巣上体の混合液を室温で3〜5分間インキュベートします。

インキュベーション中に、ディッシュを手で2〜3回そっと揺らします。これにより、精子が吸引によって泳ぎ出します。準備した各ストローに、精子懸濁液を5 mm分ロードし、続いて空気を1 cm分入れます。

凍結工程において、すべてのストローに均等に充填することが重要です。15本すべてのストローに充填した後、各ストローの両端を注意深く熱シールします。精子の生存率を確保するため、15本すべての工程を10分以内に完了させてください。

すべてのストローの準備が完了したら、それらを凍結キャニスターの精液カラムに装填します。まず、キャニスターをフォームボックスに入れ、液体窒素中で垂直に浮遊させます。精液の凍結速度に影響が出るため、キャニスターは10分間垂直に浮遊させておく必要があります。

次に、キャニスターを液体窒素に浸します。これにより精子は凍結保存され、液体窒素による長期保存が可能な状態になります。予定している精子回収の約60時間前に、

IVFの前に、記載のプロトコルに従って雌に超排卵処置を行います。解凍するストローごとに、すべての培地を準備し、37 °C、5% carbon dioxideの条件下で少なくとも1時間平衡化させます。これらの材料には、オイルで覆われた90 µLの精子処理培地のドロップが入った35 mmペトリ皿が含まれます。

切断用ディッシュとして、3 mLのIVF培地を入れた35 mmペトリ皿を用意し、さらに、超排卵させた雌5匹につき1つのIVFディッシュ（500 µLのIVF培地を満たした4ウェルプレートの1ウェル）を用意します。各IVFディッシュに対して、洗浄用ディッシュ（3 mLのKSOMを入れた35 mmペトリ皿）と、胚培養用ディッシュ（オイルで被覆された50 µLのKSOM培地ドロップを配置した35 mmペトリ皿）を準備します。必要な材料がすべて揃ったら、速やかにストローを保管場所から取り出し、37 °Cの恒温水槽に2〜3分間浸します。

ストローの水分を拭き取ります。次に、綿プラグの下にある空気柱に斜めに切り込みを入れます。ストローの反対端で、もう一つの空気柱に同様に斜めの切り込みを入れます。

精子カラムを切断しないように注意してください。次に、200 µL ピペットを用いてストローの端から精子懸濁液を吸引し、精子処理培地ドロップの中央に滴下します。その後、ディッシュを 45 〜 60 分間インキュベートします。

精子のインキュベーション中に、超排卵させた雌から子宮角を摘出し、カッティングディッシュに移します。30ゲージの針またはピンセットを用いて各輸卵管を破裂させ、卵丘細胞複合体を放出させます。5匹の雌から回収した卵丘細胞複合体を、各IVFに移します。

培地を最小限の量で採取します。不純な培地は受精効率を低下させるため、脂肪や血液の混入は避けてください。インキュベーション後、STM液滴の周辺から精子懸濁液を10〜15 µL回収し、IVF用容器の1つに注入します。

次に、受精させるために細胞を4〜6時間共培養します。受精後、洗浄皿を用いて胚を少なくとも2回のSOM洗浄にかけます。その後、培養します。

目的の発達段階に達するまで、胚をKSOMで培養します。Charles River社の5種類の近交系マウス由来の精子を凍結しました。これらの精子における精子運動率および快速前進運動率の保持率は、5株間で81%から47%の範囲でした。

凍結融解精子を用いたIVF率は、1年半にわたる異なる系統間で26%から88%まで変動しました。合計49株のGMマウスラインが精子凍結保存によってアーカイブされ、その後、C57BL/6、BC DBA/1、129SVの4つの異なる雌系統でのIVFによって回収されました。精子凍結保存技術を習得すれば、適切に実施することで30分以内に完了させることができます。

この手順では、キャニスターに垂直に流し、液体窒素を用いることが重要です。