一酸化窒素の生物活性をアッセイするための分析手法

次の実験の全体的な目標は、生体サンプル中の一酸化窒素代謝物を正確かつ特異的に検出する方法を実証することです。これは、まず採取直後に血液サンプルを処理し、代謝物の損失やアーチファクトの形成を防ぐことで達成されます。同時に、一酸化窒素代謝物に対する低酸素環境の影響を最小限に抑えるために、迅速かつ効率的な組織採取が行われます。

大動脈リングを採取して臓器浴に吊るし、内皮機能を評価します。さらに、生化学的アッセイを使用して、硝酸塩レベル、亜硝酸塩レベル、および組織中のニトロチオールおよびその他のニトロ飽和製品の相対レベルを定量化します。これらのアッセイを使用すると、実験動物と対照動物を適切に比較することで、一酸化窒素の産生と代謝に関する貴重な情報を得ることができます。

このマルチシステムアプローチを単一の方法やアッセイよりも使用する主な利点は、複数の臓器系における一酸化窒素生化学の全体像を把握できることです。したがって、これらの代謝産物のどれが予後的または診断的有用性を持つのか、また、一酸化窒素代謝産物のレパートリーが内皮の一酸化窒素の形成と利用可能性をどのように反映しているかを理解し始めることができます。この分析法の視覚的なデモンストレーションは、サンプルの完全性を維持するためにプロセスの各ステップが重要であるため、非常に重要です。

これらのステップの一部は、サンプル収集と組織抽出の細かい詳細のために、一般的なジャーナルの読み方セクションからは明らかではありません。この手順をデモンストレーションするのは、Dr.Hong Jingです。私の研究室の上級研究員 このプロトコルでは、組織も検査される実験動物の採血のために人または実験動物を用意しています。

まず、下大静脈に25ゲージの針を挿入して全血を採取します。500〜1000マイクロリットルが収集されたら、左心室の頂点から生理学的緩衝液を注入することにより、動物に残りの血液を注入し、血液と緩衝液が下静脈cvaから出るときに完全な血液交換を可能にします。静脈血は、採取直後にNEMとEDTAを含む1.5ミリリットルの遠心分離管に採取する必要があります。.

遠心分離後7分間、血液を14, 300 RCFでスピンダウンします。RBCペレットから血漿をピペットで吸引し、別のチューブに移します。HPLC用に単離した血漿サンプルを調製するには、まず、50 μLの血漿コレクションに1対1の容量の冷メタノールを加えます。

渦巻き、混合物が曇るまで3〜5秒間激しく。次に、混合物を14,300 RCFで7分間遠心分離します。血漿タンパク質を沈殿させるには、スーパーナトを別の1.5ミリリットルのチューブに集め、分析できるようになるまで摂氏4度で保存します。.

化学発光分析用のプラズマを準備するには、残りのプラズマ容量(約200〜400マイクロリットル)を取り、それを2つの容量に分割します。血漿の半分を調製するには、10%の体積の5%酸性化硫化物を加え、10分間待ちます。.これで、このサンプルはCLD分析の準備が整いました。

5分後に2%塩化水銀の10%ボリュームを追加して、血漿の残りの半分を準備します。.室温で、10%容量の酸性化スルホンアミドを加えます。.さらに10分待ってから、このサンプルをプラズマのようにCLDに注入します。

RBCペレットは、どちらの分析でもHPLCおよびCLD用に調製できます。まず、1部の細胞ペレットを4部の低張溶解液に混合します。CLD分析のために混合物を徹底的にボルテックスします。

細胞の調製は、血漿に対して行われるものと同じです。等量のメタノールを加えることから始めます。次に、混合物を3〜5秒間激しく渦巻き、続いて14,300 RCFで7分間回転させます。

次に、上清をピペットで取り除き、HPLCで分析して一酸化窒素代謝物の組織レベルを測定できるようになるまで、摂氏4度で保存します。実験動物から関心のある組織では、まず前のセクションで説明したように血液を採取して調製し、組織の採取は通常どおり、組織が低酸素にならないように速度と効率に特別な注意を払って行う必要があります。採取したら、PBSを含むN-E-M-E-D-T-Aの1対5の比率で組織サンプルをホモジナイズしました。

次に、赤血球について前のセクションで説明したように、HPLCおよびCLD分析のために均質化された組織を調製します。成体マウスにダチルエーテルを麻酔し、つま先のつま先つまみに反応しないことを確認した後、開胸術を行います。胸骨から恥骨領域まで正中線切開を行い、胸腔と腹腔を露出させます。

次に、酸素化されたクレブスアライトバッファーで動物を灌流します。25ゲージのシリンジを使用して、バッファーを左心室の頂点に注入します。右心房は、血液の出口を提供するために切り開かれています。

灌流後、大動脈を覆っている可能性のある肝臓、肺、およびその他の組織を切り取って除去することにより、腹部大動脈を分離します。次に、一対の鉗子で心臓を保持し、動物の後壁から大動脈を穏やかに切り取ります。氷で満たされたペトリ皿に心臓と大動脈を入れます。

皿の中の冷たいクレブスバッファー。大動脈から脂肪と外膜を慎重に切り取り、きれいにします。洗浄中に血管内の内皮を損傷しないようにしてください。

大動脈の代謝を遅く保ち、5分ごとに新鮮な氷の冷たい酸素化バッファーに移すことにより、低酸素症を防ぎます。次に、メスを使用して大動脈を3ミリメートルの長さのリング状のセグメントに切断します。セグメントを、酸素化クレブス緩衝液を充填した4チャンネル10ミリリットル組織器官浴に移します。

トランスデューサーノブを使用して、各大動脈リングに1.5グラムのプリテンションをかけます。経験的知見によると。1.5グラムは、最適な血管運動機能のための適切な開始張力です。

マウスモニターで、8チャンネルオクタルブリッジとデータ収集ソフトウェアを使用して力測定を記録し、リングを80分間平衡化させ、20分ごとにバッファーを交換してから、実験を続行します。組織の張力が平衡化した後、各リングに100ナノモルのフェンネルラインを追加して、最大以下の収縮を実現します。リング張力が安定し、トーンのレベルが安定したら、アセチルコリンなどの内皮アゴニストに対する用量反応分析を実行します。.

これにより、一酸化窒素の生成と血管の弛緩の程度が決まります。アセチルコリンへの用量反応後、浴をクレブス緩衝液ですすぎ、各臓器浴に100ナノモルのフェンネルリンを加えて血管を収縮させます。.再度、次に、一酸化ナトリウム側などの一酸化窒素の外因性源に対する平滑筋輪の応答性を決定します ODQの有無にかかわらず、可溶性猛烈なシクラーゼの阻害剤

このタイプのアプローチは、血管の 100% の緩和値を決定し、血管の弛緩に対する一酸化窒素応答を媒介する可溶性ガイル シクラーゼの本質的な性質も示しています。ODQはアセチルコリンに応答してニトロナトリウムIDEへの弛緩を防ぐため、大動脈リングは健康制御から、マウスは弛緩したが、内皮機能障害のあるマウスの大動脈リングは一酸化窒素産生の減少による弛緩の低下を示した。亜硝酸塩の対照動物に対するグループ特異的デニトロ化アッセイも実施されました。

RSNOおよびRNNOは、還元的デニトロスアッセイを用いて検出した。ピーク面積を差し引くことにより、亜硝酸塩とr snoのレベルを測定しました。この方法は、これらの一酸化窒素代謝物の循環レベルが組織レベルをどのように反映するか、さまざまな病状で疾患代謝物がどのように変化するかなど、一酸化窒素および血管生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。

これらの関連する一酸化窒素代謝物の定常状態濃度と半減期を複数の臓器系および単一の動物の循環全体にわたって決定することで、疾患プロセスの特定の分子シグネチャの特定が可能になり、新しい一酸化窒素ベースの治療法を定義するのに役立ちます。これにより、臨床医は疾患の重症度または進行に対するより優れたバイオマーカーを身に付けることができます。一般的に、硝酸分野に不慣れな個人は、多くの人が生物学的サンプルに見られるこれらの低レベルのトリ酸代謝物を検出して定量するのに十分な感度で最小限に抑えるため、苦労するでしょう。まず第一に、芸術の1つの非スキルは、サンプル処理中に誤ったデータやデータの誤解を必要とするアーティファクトを作成する可能性があります。