Name: 一酸化窒素の生物活性をアッセイするための分析手法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: 学ぶ一酸化窒素代謝物の正確な検出法。血液サンプルの迅速処理と組織採取による低酸素効果の最小化、生化学アッセイによる硝酸塩・亜硝酸塩・ニトロチオールの定量、大動脈輪を用いた内皮機能評価。疾患バイオマーカーとしての応用可能性を示す。

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著者らは、香港江博士に感謝したいと思いますとディーパParathasarthy、MPHは、技術支援のためのBDS。

1。全血採取<ol><li>ヒトからまたはNEM / EDTAを含むチューブで実験動物からの静脈血を採取する。 </li><li>直ちに血漿および赤血球細胞ペレットを準備する7分間14300 RCF（相対遠心力）でベンチトップ遠心分離機で血液をスピンダウンする。 </li><li>高速液体クロマトグラフィー（HPLC）および化学発光検出（CLD）分析のために血漿サンプルを準備します。 HPLC：沈殿物の血漿タンパク質への10分間プラズマ、13200 rpmでボルテックスと遠心に冷メタノールの1:1のボリュームを追加します。 HPLC分析のために上清を収集。 CLD：アリコート特にアッセイニトロソチオールにスルファニルアミドと塩化第二水銀を使用してサンプルとpreinc​​ubate。 </li><li> HPLCおよびCLD分析のために赤色細胞ペレットを準備します。 HPLC：10mMのNEM、2.5 mM EDTAおよび10mMのフェリシアン化を含む低張性溶解液に追加午前1時04分赤い細胞ペレット。 Vortexは徹底的にと、1:1メタノール、渦とcentrifを追加する沈殿タンパク質に10分間13200 rpmでuge。 HPLC分析のために上清を収集。 CLD。 10mMのEDTA、2.5 mM EDTAおよび10mMのフェリシアン化を含む低張性溶解液に1時04分赤い細胞ペレットを追加します。ニトロソチオールの特異的検出のためのスルファニルアミドと塩化第二水銀を含有するチューブに分注しサンプル。 </li></ol> 2。組織の抽出と準備<ol><li> NO代謝産物の組織レベルを決定するために、それは、上述したように試料調製のために血中遊離組織を採取することがまず必要です。完全な血液の交換は、左心室の頂部を介して生理的な緩衝液を注入することによって行われます。すべての血液が取り除かれた後、興味のある組織は、その後収穫することができます。 </li><li>組織サンプルをホモジナイズし、HPLCとCLD分析のために上記のようにサンプルを準備します。 </li></ol> 3。血管内皮機能のために大動脈リングの分離ティッシュオーガンバス<ol><li>マウスはanestになりますもはや応答ピンチをつま先と、手術前に頸椎脱臼を受けるようになるまで、ジエチルエーテルでhetized。開胸術は胸と腹部大動脈を露出するために実行されます。 25ゲージのシリンジは、左心室の頂部に挿入し、酸素クレブスHenseleit緩衝液、血液の自由な灌流されています。 </li><li>右心房は血液の出口を提供するためにカットされています。腹部大動脈は、外膜の除去と洗浄されます。 </li><li>リングは2ミリメートル長さのセグメントに切断し、生理的な緩衝液に浸し、4チャンネルの組織器官浴（DMT 720MO、AD·インスツルメンツ）にマウントされます。 </li><li>容器リングは37℃で酸素クレブス緩衝液（95％O 2および5％CO 2）で10 mlの器官浴に保持されます一グラム主張は、それぞれの大動脈リング（以前の実験で決定される最適な血管機能のための適切な開始張力）に配置されます。 8チャンネル進ブリッジ（Powerlab）及びデータ収集ソフトウェア（チャートバージョン5.2.2）すべての力の測定値を記録するために使用再。 </li><li>リングは、各臓器浴中の緩衝液で80分間平衡化を許可されているすべての20分に変更しました。 80分間平衡化した後、1μMのフェニレフリンは、最大下収縮のために、各リングに追加されます。 </li><li>安定した後など、アセチルコリンなどの内皮アゴニストは、血管弛緩のNO産生と程度を決定しないように追加されます。アセチルコリン用量反応した後、お風呂は一酸化窒素、平滑筋の応答性を決定するために、100％の弛緩のための値を取得するためにニトロプルシドナトリウムの外因性の源​​ですすぎ、recontractedして、処理されます。 </li><li> NOのスカベンジャーは、明らかに血管弛緩のNOおよび抑制のリリースを示すために、浴に添加することはできません。 </li></ol> 4。代表的な結果 ENO-20専用のHPLCを使用するには、中の亜硝酸および硝酸の特異的かつ高感度に検出するためのハイスループットメソッドを使用して簡単に提供しています生体マトリックス。検出し、元のクロマトグラムの原理を図1に示されています。このメソッドは、亜硝酸及び硝酸を決定するための任意の生物学的サンプルに使用することができます。 NO代謝産物のCLDベースの検出では、NO分子のソースを決定するために、化学誘導体化ステップを必要とします。化学発光検出器の同時酸化脱ニトロソ化および還元的脱ニトロソ化の実験セットアップを図2に示されています。右側の反応容器にPBS pH7.4中800mmのフェリシアン化で満たされて、左側の反応容器を還元脱ニトロソ化のために酢酸（ 図2A）のヨウ化カリウム/ヨウ素混合物が充填されています。全体のセットアップは、 図2Bに示されています。 図3は、グループ固有の脱ニトロソ化亜硝酸を検出し、定量化できるアッセイ、ニトロソ、ニトロソアミンなどニトロシルヘムの製品を示しています。このメソッドは、以前にdescriされているベッドと4,5検証されています。これらの重要な生化学的解析が容易に実験動物の内皮NO産生を決定しないように隔離された大動脈リングの機能研究と相関することができます。この古典的な薬理実験では、簡単かつ正確に血管内皮機能と生産NOを評価することはできません。そのようなアセチルコリンなどの内皮アゴニスト血管反応性を測定する直接して実験動物の血液や組織で検出された生化学的なマーカーと相関させることができる内皮NO産生を決定することはできません。アセチルコリンの用量反応の典型的な表現は、 図4に示します。正常な内皮機能と健康な対照マウスは、リラックスしてアセチルコリンに応答します。内皮機能不全（高コレステロール血症のマウス）のマウスは、同じ刺激​​に対してNO産生を減少させないことが原因で減少し緩和を示しています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3722/3722fig1.jpg" /> イチジクURE 1。ENO-20およびサンプルのクロマトグラムによる亜硝酸及び硝酸の検出の原理。亜硝酸塩と硝酸塩の検出ENO-20方式の（上）模式図。 （下）10 pmolの亜硝酸及び硝酸の標準chromotogramは、ENO-20（亜硝酸及び硝酸の100 nM溶液の100μl）を注入した。 100μlの注入量と各陰イオンは1 nMの感度。タンパク質または着色された種との干渉はありません。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3722/3722fig2.jpg" /> パージ一酸化窒素ガスのガス相の検出にヨウ化/ヨウ素アッセイを使用してフェリシアン化及び還元脱ニトロソ化により、両方の酸化的脱ニトロソ化を使用して図2。CLD実験。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3722/3722fig3.jpg" /> 図3（パネル）グループ固有のchemicを含むサンプル前処理によって還元脱ニトロソ化アッセイにおける亜硝酸塩の化学発光検出、RSNO、RNNOらの試薬。ピーク面積の減算は、亜硝酸塩とRSNOsの検出を可能にする。フェリシアの酸化脱ニトロソ化ソリューションを使用してニトロシルヘム種（パネルB）化学発光検出。このメソッドは、RSNOs（GSNOまたはSNO-アルブミン）、またはRNNO（NO-ピロリジンとN-ニトロソアルブミン）との交差反応性を有するNO-ヘム製品の固有のものです。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3722/3722fig4.jpg" /> 図4分離された大動脈リング上のEx vivoの器官浴は、HPLCとCLDで検出された生化学的なマーカーと相関させることができる内皮NO産生の直接の尺度を提供しています。この図は、NO産生を減少させないことが原因で血管内皮機能障害を持つマウスの減少の緩和を示しています。

<ol><li>Kelm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+metabolism+and+breakdown%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide metabolism and breakdown.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1411, 273-289 (1999).</li>
<li>Furchgott, R. F., Zawadzki, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+obligatory+role+of+endothelial+cells+in+the+relaxation+of+arterial+smooth+muscle+by+acetycholine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetycholine.</a> Nature. 288, 373-376 (1980).</li>
<li>Ignarro, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelium-derived+relaxing+factor+produced+and+released+from+artery+and+vein+is+nitric+oxide%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Endothelium-derived relaxing factor produced and released from artery and vein is nitric oxide.</a> Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 84, 9265-9269 (1987).</li>
<li>Feelisch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concomitant+S-%2C+N-%2C+and+heme-nitrosylation+in+biological+tissues+and+fluids%3A+implications+for+the+fate+of+NO+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Concomitant S-, N-, and heme-nitrosylation in biological tissues and fluids: implications for the fate of NO in vivo.</a> FASEB J. 16, 1775-1785 (2002).</li>
<li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+nitric+oxide+levels+in+the+red+cell%3A+validation+of+tri-iodide-based+chemiluminescence+with+acid-sulfanilamide+pretreatment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Measurement of nitric oxide levels in the red cell: validation of tri-iodide-based chemiluminescence with acid-sulfanilamide pretreatment.</a> J. Biol. Chem. 281, 26994-27002 (2006).</li>
<li>Angelo, M., Singel, D. J., Stamler, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+S-nitrosothiol+%28SNO%29+synthase+function+of+hemoglobin+that+utilizes+nitrite+as+a+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">An S-nitrosothiol (SNO) synthase function of hemoglobin that utilizes nitrite as a substrate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 8366-8371 (2006).</li>
<li>Bryan, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bound+NO+in+human+red+blood+cells%3A+fact+or+artifact%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%22%5BJournal%5D)">Bound NO in human red blood cells: fact or artifact.</a> Nitric Oxide. 10, 221-228 (2004).</li>
<li>Feelisch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Processing+of+Nitrite+in+Hypoxia%3A+An+Intricate+Interplay+of+Nitric+Oxide-Generating+and+-Scavenging+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Tissue Processing of Nitrite in Hypoxia: An Intricate Interplay of Nitric Oxide-Generating and -Scavenging Systems.</a> J. Biol. Chem. 283, 33927-33934 (2008).</li>
<li>Bryan, N. S., Grisham, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+detect+nitric+oxide+and+its+metabolites+in+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Methods to detect nitric oxide and its metabolites in biological samples.</a> Free Radic. Biol. Med. 43, 645-657 (2007).</li>
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<li>Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nitrate-nitrite-nitric+oxide+pathway+in+physiology+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug.+Discov%22%5BJournal%5D)">The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics.</a> Nat. Rev. Drug. Discov. 7, 156-157 (2008).</li>
</ol>

利害の衝突が宣言されません。

複数の生物学的区画内の関連するNO代謝産物の定量化のためにここで説明する方法は、内皮細胞によるNOの機能的な測定値と相関させることができ、健康と疾患におけるNOの生物学のフィンガープリントが可能になる。これらのメソッドは、高スループットのために適応させるための可能性のあるシンプルなサンプル調製を必要とします。これらの分子の相対量は、病気の実験モデルとヒト患者からもシリアルサンプル数におけるNOの産生およびその代謝運命を理解するのに役立ちます。人為的にサンプル調製時にこれらの製品の一部を生成するNOのベースのバイオマーカーと多くの分析法を検出しない多くの落とし穴があります。生体試料中の亜硝酸塩の慎重な会計処理が原因のシステインチオール6ニトロソ7の人為的形成との反応性が非常に重要です。嫌気的条件下で亜硝酸の特異的検出のためにCLDベースの方法論がでにつながる8つの異なる生物学的区画内の特定の亜硝酸還元酵素の活性に起因する一貫した結果。ここで説明するすべてのメソッドは、十分に文書化、検証および成果物9を排除または低減するために考慮の手順を考慮しています。...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> N-エチルマレイミド</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> 23030 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> E7889 </td></tr><tr><td>フェリシアン化カリウム</td><td>フルカ</td><td> 60299 </td></tr><tr><td> HPLC </td><td> Eicom株式会社</td><td> ENO-20 </td></tr><tr><td>オートサンプラ</td><td>オールコット</td><td></td></tr><tr><td> DMTミオグラフ</td><td> AD·インスツルメンツ</td><td></td></tr><tr><td> PowerLab </td><td> AD·インスツルメンツ</td><td></td></tr><tr><td>化学発光</td><td> EcoPhysics </td><td> CLD 88Y </td></tr><tr><td>遠心分離</td><td>エッペンドルフ</td><td> 5415D </td></tr><tr><td>アセチルコリン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> A6625 </td></tr><tr><td> R-（ - ）フェニレフリン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> P6126 </td></tr></tbody></table>

一酸化窒素の生物活性をアッセイするための分析手法

Analytical Techniques for Assaying Nitric Oxide Bioactivity

一酸化窒素（NO）は1（血液の循環で1秒未満）、生物学的システムに住んでいた非常に短い二原子フリーラジカルです。 NOは含めて本質的な機能を調節する、私たちの体内で作ら最も重要なシグナル伝達分子の一つと考えられませんが、血圧、免疫応答と神経通信の規制に限定されない可能性があります。したがって、生体マトリックスでの正確な検出および定量は、健康と疾患におけるNOの役割を理解することが重要です。 NOのような短い生理的半減期で、NO生化学の反応生成物を検出するための代替戦略が開発されている。複数の生物学的区画内の関連するNO代謝産物の定量化は、 生体内で生産、生物学的利用能および代謝NOに関して貴重な情報を提供します。単にそのような血液または血漿のような単一コンパートメントをサンプリングすると、常に全体のBOの正確な評価を提供することはできません特に組織中のNOのステータスを、DYはありません。実験動物の選択組織と血液を比較する能力は、はるかに健康と病気におけるNOのバイオマーカーの診断および予後診断ユーティリティなどの基礎科学と臨床医学の間のギャップを埋めるのに役立ちます。したがって、興味のある特定の組織へ血漿又は血液の外挿なしの状態は、もはや有効なアプローチではありません。結果として、メソッドを開発し、in vivoでの実験動物の複数の区画内のNOとNO関連製品/代謝物の検出および定量化が許可されて検証され続けています。と硝酸塩（NO 3 - ） -亜硝酸（NO 2）にNO合成酵素によって生産からの可溶性グアニル酸シクラーゼ（sGC）の活性化への最終的な酸化にNO生化学の確立されたパラダイムは、in vivoでの NOの影響の一部を表すことができる。 S-nitrosothiを形成するタンパク質のチオール基、二級アミンと金属とのNOとNO由来の代謝物の相互作用OLS（RSNOs）、N-ニトロソアミン（RNNOs）、およびニトロシルヘムは、それぞれのNOのcGMP依存しない効果を表しており、NOによるSGCの活性化として、生理学的に可能性が同様に重要である。生理中のNOの真の理解は、同時に複数のコンパートメントをサンプリングin vivo実験から導出されます。一酸化窒素（NO）の手法は複雑で、しばしば混乱の科学と多くの議論とNO生化学に関するません議論の焦点となっています。我々の能力特異的に上のNOのヒンジを伴わない新しい機構やシグナル伝達経路の解明は、選択的かつ高感度検出とNOと関連するすべての複雑な生体マトリックス中のNOの製品や代謝産物を定量化する。ここでは、高速液体クロマトグラフィーによる亜硝酸及び硝酸の迅速かつ高感度分析のための方法と同様のNO分子のソースなどのex vivoで決定するために、化学derivitazationとin vitroでのオゾンベースの化学発光で使用して生体試料中の遊離NOの検出を発表臓器浴筋運動記録法。

一酸化窒素（NO）の内因性産生は、生物多様な機能を調節する。それは、NOベースのシグナリングの中断または調節不全は、多くのヒト疾患に関与していることがますます明らかになりつつあります。関連するNOの代謝産物を定量化しないための方法は、ヒトの疾患の新しい診断または予後バイオマーカーを提供することがあります。

一酸化窒素（NO）は二原子の遊離基であり、生物学的システム内では極めて短寿命である（循環血液中では1秒未満）1。NOは...

本実験の総合的な目的は、生物学的試料中の一酸化窒素代謝物を正確かつ特異的に検出する方法を実証することである。まず、採取直後に血液試料を処理することで、代謝物の消失やアーティファクトの形成を防ぐ。同時に、低酸素環境が一酸化窒素代謝物に及ぼす影響を最小限に抑えるため、迅速かつ効率的な組織採取を行う。大動脈リングを採取し、器官浴に吊り下げて内皮機能を評価します。さらに、生化学的アッセイを用いて、組織内の硝酸塩レベル、亜硝酸塩レベル、ならびにニトロチオールおよびその他のニトロ化産物の相対レベルを定量します。これらのアッセイを用いて実験群と対照群の動物を適切に比較することで、一酸化窒素の生成と代謝に関する有用な情報を得ることができます。単一の手法やアッセイよりもこのマルチシステムアプローチを用いる主な利点は、複数の器官系における一酸化窒素の生化学的状況をより広範に把握できる点にあります。これにより、これらの代謝物のうちどれに予後予測または診断上の有用性があるのか、また、一酸化窒素代謝物のレパートリーが内皮細胞での一酸化窒素の生成および利用可能性をどのように反映しているかを理解し始めることができます。プロセスの各ステップがサンプルの完全性を維持するために不可欠であるため、本手法を視覚的に実演することが極めて重要です。一般的な学術誌のメソッドセクションを読んでも、サンプル収集や組織抽出の詳細な手順が十分に記載されていないことが多く、これらのステップを把握するのは困難です。本手順の実演は、私の研究室のシニアリサーチサイエンティストであるHong Jing博士が行います。本プロトコルのために、血液採取を行う人間または実験動物を用意してください。実験動物を使用する場合は、その後組織の検査も行います。まず、25ゲージの針を下大静脈に挿入し、全血を採取します。500から1000 µLを採取した後、左心室心尖部から生理的緩衝液を注入して動物体内の残血を洗い流し、下大静脈から血液と緩衝液が流出することで完全に血液置換が行われるようにします。静脈血は、採取直後にNEMおよびEDTAを含む1.5 mL遠心チューブに回収してください。遠心分離後、14,300 RCFで7分間スピンダウンします。ピペットを用いてRBCペレットから血漿を吸引し、別のチューブに移します。分離した血漿サンプルのHPLC用調製として、まず50 µLの回収血漿に、同 volumesの冷メタノールを加えます。混合液が白濁するまで、3〜5秒間激しくボルテックスします。次に、14,300 RCFで7分間遠心分離します。血漿タンパク質を沈殿させるため、上清を別の1.5 mLチューブに回収し、分析まで4°Cで保存します。化学発光分析用に血漿を調製するには、残りの血漿量（通常 200 〜 400 µL 程度）を2分量に分けます。血漿の半分に、5%酸性硫化物溶液を容量比10%添加し、10分間待機して調製します。これで、このサンプルはCLD分析に使用可能な状態になります。5分後、2%塩化水銀を10%容量加え、血漿のもう一方の半分を調製します。室温にて、酸性化スルホンアミドを10%容量加えます。さらに10分間待ち、このサンプルを血漿と同様にCLDに注入します。RBCペレットは、HPLCまたはCLDのいずれの分析にも使用して調製できます。まず、細胞ペレット1部に対して低張溶出液4部の割合で混合します。CLD分析の場合は、混合物を十分にボルテックスしてください。細胞の調製は、血漿と同様に行います。まず、同量のメタノールを添加します。次に、混合物を3〜5秒間激しくボルテックスし、続いて14,300 RCFで7分間遠心分離します。次に、上清をピペットで回収し、HPLCを用いて組織内の一酸化窒素代謝物レベルを分析するまで4 °Cで保存します。実験動物の目的組織を用いる場合は、まず前節に記載した方法で血液を採取し、調製してください。組織の採取は通常の方法で行いますが、組織が低酸素状態にならないよう、迅速かつ効率的に行うことに細心の注意を払ってください。採取後、組織サンプルをN-E-M-E-D-T-A含有PBSを用いて1:5の比率でホモジナイズします。次に、赤血球（RBCs）について前述した手順に従い、ホモジナイズした組織をHPLCおよびCLD分析用に調製します。成マウスをジエチルエーテルで麻酔し、足指へのピンチ刺激に反応しないことを確認した後、開胸術を行います。胸骨から恥骨領域まで正中切開し、胸腔および腹腔を露出させます。次に、酸素飽和Krebs Alite緩衝液で動物を灌流します。25ゲージの注射器を用いて、左心室の心尖部に緩衝液を注入します。この際、血液の排出路を確保するため、右心房を切開しておきます。灌流後、肝臓、肺、および大動脈を覆っている可能性のあるその他の組織を切り取り、除去して、腹部大動脈を単離します。次に、ピンセットで心臓を保持し、動物の後壁から大動脈を丁寧に切り離します。心臓と大動脈を氷で満たしたペトリ皿に入れます。ディッシュ内に冷えたKrebs緩衝液を入れます。大動脈から脂肪および外膜を慎重に切り取り、除去します。洗浄の際、血管内皮を傷つけないように注意してください。5分ごとに新鮮な氷冷酸素飽和バッファーに交換し、大動脈の代謝を抑制して低酸素状態を防ぎます。次に、メスを用いて大動脈を3 mmの長さのリング状セグメントに切断します。これらのセグメントを、酸素飽和Krebsバッファーを満たした4チャンネル10 mL組織器官バスに移します。トランスデューサーノブを使用して、各大動脈リングに1.5 gの予張力を加えます。経験的な知見に基づくと、血管運動機能を最適化するための適切な開始張力は1.5 gです。マウスの張力測定を8チャンネルのオクタルブリッジとデータ収集ソフトウェアを用いてモニタリングおよび記録し、リングを80分間平衡化させます。その際、20分ごとに緩衝液を交換し、その後実験に進みます。組織の張力が平衡に達した後、各リングに100 nanomolarのフェニレフリンを添加し、最大下収縮を誘発させます。リングの張力が安定し、一定のトーンが維持されたところで、アセチルコリンなどの内皮作動薬を用いて用量反応分析を行います。これにより、一酸化窒素の産生量と血管弛緩の程度を決定します。アセチルコリンに対する用量反応試験の後、バスをKrebs緩衝液で洗浄し、各臓器バスに100 nanomolarのフェニレフリンを添加して血管を収縮させます。その後、可溶性グアニル酸シクラーゼ阻害剤であるODQの有無において、ニトロプルシドナトリウムなどの外因性一酸化窒素源に対する平滑筋リングの反応性を決定します。このアプローチにより、血管の100%弛緩値を決定するとともに、血管弛緩における一酸化窒素反応を媒介する可溶性グアニル酸シクラーゼの不可欠な性質を実証します。ODQはアセチルコリンに応答したナイトロプルシドによる弛緩を抑制するため、健康な対照マウスの大動脈リングは弛緩しましたが、内皮機能不全を持つマウスの大動脈リングでは、一酸化窒素産生の減少により弛緩が抑制されました。また、対照動物を用いて、亜硝酸塩の化学発光によるグループ特異的な脱ニトロシル化アッセイも実施しました。還元脱ニトロシル化アッセイを用いて、RSNOおよびRNNOを検出しました。ピーク面積を差し引くことで、亜硝酸塩およびrSNOレベルを測定しました。この手法は、これらの一酸化窒素代謝物の血中レベルが組織レベルをどのように反映しているか、また、さまざまな疾患条件下で疾患代謝物がどのように変化するかなど、一酸化窒素および血管生物学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。複数の器官系および単独個体の循環系全体において、これらの関連する一酸化窒素代謝物の定常状態濃度と半減期を決定することで、疾患プロセスの特異的な分子シグネチャーの特定が可能となり、一酸化窒素に基づいた新しい治療法の定義に寄与します。これにより、臨床医は疾患の重症度や進行に関するより優れたバイオマーカーを備えることができるようになります。一般的に、一酸化窒素研究の分野に不慣れな個人は、生物学的試料に含まれるこれら低レベルの一酸化窒素代謝物を検出および定量するのに十分な感度を持つ手法が少ないため、困難に直面します。さらに、技術に習熟していない者が試料処理を行うと、アーチファクトが発生しやすく、それが誤ったデータやデータの誤解釈につながる可能性が高くなります。

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医学

炎症性細胞シグナル伝達分子である一酸化窒素(NO)のレベルは、一般的にGriess試薬を使用してアッセイされます。このプロトコルでは、生きたショウジョウバエの脳組織を利用した修正Griessアッセイを作成し、シンプルで定量化可能で再現性の高い方法でNOの分泌を検出しました。...

ショウジョウバエの神経炎症反応における一酸化窒素レベルの新しい全組織定量アッセイ

この記事では、 顔を同時に検出し、細胞内の一酸化窒素（NO）とスーパーオキシドアニオン（O 2の可視化エンための蛍光色素ジアミノ-2ジアセテート（DAF-2DA）およびジヒドロ（DHE）を使用して適応が比較的容易な方法を記載しています.- ）は、それぞれ、肥満マウスモデルの新たに単離された無傷の大動脈です。...

無傷の動脈の内皮層における一酸化窒素とスーパーオキシドのエン顔検出

一酸化窒素 (NO) は、血管の恒常性における重要なシグナル伝達分子です。NO in vivo...

化学発光法を用いて、生物学的材料に、一酸化窒素経路に亜硝酸塩と硝酸塩、代謝物を測定します

以前の研究は、大気中の窒素酸化物の窒素同位体組成が環境中の異なる発生源の影響を区別する可能性があることを示唆しています。私たちは、時間ごとの時間分解能でN同位体分析のための大気NOxの高い収集効率のための自動化されたモバイルなフィールドベースの方法について報告します。...

NOの窒素同位体分析のための自動化、高解像度モバイル収集システム<sub&gt; X</sub

本稿では、収穫後の害虫駆除のための一酸化窒素 (NO) くん蒸プロトコルについて説明します。燻蒸室前に超低酸素条件を確立する窒素 (N2) を使用してフラッシュを注入します。最後に、チェンバースは N2 2への暴露を防ぐために周囲の空気に製品を公開する前に NO...

窒素酸化物ガスで害虫駆除のため研究所くん蒸処理の手順

ここでは、血小板の血液で機密性の高い一酸化窒素センサーとしての潜在的な使用に対処するためのプロトコルを提案する.一酸化窒素の発電機としての初期血小板の調製及び亜硝酸と脱酸素化赤血球の使用をについて説明します。...

VASP のリン酸化を測定することによって血液中の一酸化窒素の血小板ベースの検出

硝酸塩と亜硝酸塩のレベルを測定および比較するために、ラット骨格筋組織の4つの異なる筋肉群を均質化するための3つの異なる方法のプロトコルを提示します。さらに、異なるサンプル重量を比較して、組織のサンプルサイズが均質化の結果に影響を与えるかどうかを調査します。...

硝酸塩および亜硝酸塩測定のためのラット骨格筋ホモジネートの調製

ここでは、化学発光ベースのアッセイを高感度に使用して、一酸化窒素およびその生物学的に関連する誘導体を検出するためのプロトコルを提示する。...

自動酸化およびニトロソ化化合物からの一酸化窒素およびその誘導体の検出のための化学発光ベースのアッセイ

このプロトコルは、三ヨウ化物ベースの化学発光アッセイを用いて頂端分泌中の亜酸塩を測定することで、気道上皮培養中の一酸化窒素(NO)産生を定量化する方法を説明しています。...

マウス気管上皮細胞培養中の一酸化窒素生成の測定 空気と液体界面で分化

我々は、FDAに承認された、超常磁性酸化鉄（SPIO）、ferumoxytol（Feraheme）で幹細胞を標識して追跡するためのテクニックを説明します。可視化のために磁気共鳴（MR）イメージングを利用したこの細胞のイメージング技術は、患者の成功または失敗した幹細胞のengraftmentsの長期的な監視と診断のための容易にアクセス可能です。...

Ferumoxytol、FDA承認酸化鉄ナノ粒子で幹細胞のラベリング

学ぶ一酸化窒素代謝物の正確な検出法。血液サンプルの迅速処理と組織採取による低酸素効果の最小化、生化学アッセイによる硝酸塩・亜硝酸塩・ニトロチオールの定量、大動脈輪を用いた内皮機能評価。疾患バイオマーカーとしての応用可能性を示す。

一酸化窒素の生物活性をアッセイするための分析手法

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