Name: 真菌の植民地、減数、およびカーネルのバイオアッセイを用いたマイコトキシンの生産の定量化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: 学ぶ カーネルバイオアッセイを用いたマイコトキシン生産と真菌生育の定量法。種子と病原真菌の相互作用を解析し、作物保護と食品安全性向上に貢献する標準化手法です。

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我々は彼らの技術支援のためにブランドンハセット、カルロス·オルティスに感謝します。この作品は、NSFの助成金IOB-0544428、IOS-0951272、博士マイケルKolomietsにし、食と農の米農務省国立研究所（NIFA）、AFRIの育種と教育グラント＃2010から85117でIOS-0925561によってサポートされていました-20539博士へ。セスマレー、トーマスIsakeit、とマイケルKolomiets。

1。トウモロコシカーネルのバイオアッセイ<ol><li>二週間前までに、文化28でポテトデキストロース寒天（PDA）上での真菌病原体℃、 </li><li>彼らはバイオアッセイバイアルの底レベル、50mlファルコンチューブ内の場所を築くため、好ましくは、平坦化され、同様の大きさと形でカーネルを選択します。選択したカーネルは、類似した種子の年齢及び代謝物の組成を保証するために、同じ環境で同時に製造されている必要があります。 </li><li>表面は70％エタノールで5分間、滅菌水で1分間、6％次亜塩素酸ナトリウムで10分間室温でチューブを振とうしてカーネルを滅菌する。継続的な振とうしながら滅菌水で、毎回5分間、3回すすいでください。オートクレーブタオルで乾かしカーネル。 </li><li> アスペルギルスフラバスの感染を容易にするために、0.5cmの深さに18 G針で胚側の ​​小さな傷を作成します。しかし、我々の経験では大きな傷がフザリウムverticillioides感染に必要とされる。番目のerefore、0.5ミリメートルの深さで胚側にカットするためにかみそりの刃を使用しています。 </li><li>胞子を解放し、オートクレーブチーズの少なくとも4つの層を介してフィルタリング重力によって菌糸を除去するオートクレーブ0.01パーセントのTween-20溶液の約5 mlの培養プレートを削って接種懸濁液を準備します。血球と胞子濃度を計算し、Aの10 6胞子/ mlに調整フラバスまたは F verticillioides。病原体またはホストの他の種を使用している場合は、適切な感染接種の濃度を評価することは重要である。 </li><li>紙タオルや滅菌水100 mlの5枚が並んでプラスチック容器（29.2センチ×18.7センチメートルX 8.3センチメートル）内の湿度チャンバーを作成します。チャンバーは、水または気密と追加の水ではありませんペーパータオルの潤いを保つために、実験を通して追加する必要があります。 </li><li>オートクレーブ20mlのガラス製シンチレーションバイアルに4カーネルを配置し、その質量を記録します。 、200μlの胞子懸濁液を接種するキャップ、懸濁液と均一にコートカーネルの渦。自由に湿度チャンバーへの空気の交換と場所を可能にするためにキャップを緩めます。 </li></ol> 注：これらのメソッドに記載されている以外の種子や真菌の場合、必要な接種量が異なる場合があり、実験的に導出する必要があります。 <ol start="8"><li> °Cで7日間で28または所望されるまで12-h-light/12-h-dark日長下のカーネルをインキュベートします。 </li></ol> 2。分生子の列挙<ol><li>感染期間の後、1分間徹底的に感染したカーネルと渦を含むシンチレーションバイアルにオートクレーブ0.01パーセントのTween-20の5ミリリットルを追加します。 </li><li>ワイドボアピペットチップを使用して、すぐに0.01パーセントのTween-20（または感染症に応じて、必要に応じて希釈する）の1.8 mlを含む2.0ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブに胞子懸濁液の2つの独立した200μlのアリコートを転送することにより希釈する。 </li><li>血球4に二回、各200μlのアリコートを列挙すると治療の間の分生子のレベルを比較します。 </li></ol> 3。アフラトキシンの定量<ol><li> 80％メタノールと0.05グラムのNaCl、1分間高速でカバーとブレンド20mlで1サンプルから50ミリリットルブレンダーカップにカーネルを追加します。 </li><li>きれいな回収容器を介して溝濾紙を配置し、フィルタに抽出液を注ぐ。 </li><li>きれいな容器にろ液10 mlを20 mlの蒸留H 2 Oを追加して、よく混ぜる。 </li><li>クリーンカップに1.5μmのガラスマイクロファイバーフィルタを通してフィルタサンプル。 </li><li>アフラトキシン検査の列にフィルタ抽出液を1 mlを適用すると、圧縮空気を使用して、空になるまで1〜2滴/秒の速度でカラムを通して濾過し抽出物を強制します。 </li><li>蒸留H 2 O 1 mlで2回カラムを洗浄し、ドロップ/秒の空気が伝わってくるまでは1-2にカラムを通過します。 </li><li>ドロップ/ガラスキュベットに採取二流1-2に1ミリリットル100％HPLCグレードのメタノールで溶出するカラム。 </li><li>加える1溶出液にアフラトキシン試験Developerのmlとよく混ぜる。場所は、キャリブレーション蛍光光度計キュベットに、60秒で読む。 </li></ol> 注：Aflatest FGISプロトコルを使用する場合、蛍光光度計からの測定は100ミリリットルで抽出したサンプルの最初の50グラムに基づいて計算されます。あなたは水試料の希釈を考慮した場合は、1ミリリットルは、サンプルの0.166グラムを表す列に適用されます。したがって、プロトコルを変更するとき、あなたのアカウントにサンプルサイズの違いや初期抽出液を取る必要があります。たとえば、カーネルの2グラムを20mlの80％メタノールで抽出されています。これは0.1グラム/ mlである。このサンプルの1 mlを2 mlの水と混合されたときに、液体のサンプルの割合は、現在0.033グラム/ mlである。このサンプルでは100 ppbの蛍光光度計の読みを与える場合は、実際の濃度は、ppbの=（0.166グラムXは100 ppb）/ 0.1グラム）、または166 ppbである0.166のサンプルの割合に基づいています。別のアフラトキシン、定量のためにカチオン方法は、参考文献7を参照してください。 4。フモニシンB1（FB1）の分析<ol><li>菌はトウモロコシの穀粒の上に成長されている場合、撹拌せずに室温でアセトニトリル/水（50/50、v / v）を10 mlの一晩サンプルを抽出します。その後、脱イオン水（6 ml）で抽出（2 ml）を混合し、C-18固相抽出に直接（8 ml）にこのミックスを適用します。 </li><li>水2ml、続いてアセトニトリル2mlで洗浄し、サンプル、前提条件C-18固相抽出カラムをロードする前に。 </li><li>サンプルをロードした後、カラムをアセトニトリル/水2ミリリットル（15/85、v / v）を、続いて水2mlで洗浄する。 HPLC分析（FB1を含む）のサンプルは、アセトニトリル/水2ml（70/30、v / v）で溶出させる。 </li><li> 0.1ミリリットルホウ酸緩衝液（0.05Mホウacid/0.05 Mホウ酸ナトリウム[50/50、V / V]は、pH 8.5）および0.1を含むバイアルにカラム溶出液の0.1 mlを転送することにより、O-フタルアルデヒド（OPA）でFB1を誘導体化ミリリットルOPA（アセトンで0.1 mg / mlの0.5％itrile - メルカプトエタノール）。 </li><li> acetonitrile/0.01 Mホウ酸（40/60、v / v）を0.5 mlを加えることによって10分後に反応を停止します。 </li><li>分析ZORBAX ODSカラム（4.6 150ミリメートル）と、可変波長Shimatzu RF-10Axl蛍光検出器（励起335 nmで/発光440 nm）を装備島津HPLC LC-20ATシステム上でFB1を分析します。 </li><li>線形グラデーションを使用し（溶媒：アセトニトリルMリン酸ナトリウム（40/60）は、pH 3.3;溶媒B：アセトニトリル/ 0.1 Mリン酸ナトリウム（60/40）は、pH 3.3）されており、勾配プログラムは次のとおりです。 100パーセントで5分間、10分間、100％Bの100％Bへ。 </li><li> HPLCでFB1の基準を分析し、ピーク面積の測定は、標準曲線を生成するために使用されています。その後、FB1標準曲線とピーク面積を比較することによって、サンプル中のFB1のレベルを定量化する。 </li></ol> 5。エルゴステロールの分析<ol><li>文化7〜14日のためにトウモロコシの穀粒に菌。 </li><li>メタ：インキュベーション期間の後、クロロホルム10mlを加え各バイアルにanol（2:1、v / v）で。一度追加された、よくサンプルを振ると、その後24時間室温で暗所でバイアルをインキュベートします。 </li><li> 24時間後、サンプルを遠心し、上清を収集し、0.45 umのナイロン膜を通してそれをフィルタリングします。 </li><li> 4.6 U ODS-C18カラム（200Å、250±4.6 mm）と282 nmでモニターするように設定島津SPD-20A UV / VIS検出器を備えた島津HPLC LC-20ATシステムに直接サンプルを注入します。 </li><li>移動相として1.5 mL / minの流量でメタノール（100％）を使用します。 HPLCグレードのエルゴステロールから生成された標準曲線と試料のピーク面積を比較することにより、サンプル中のエルゴステロールの定量化を決定します。 </li></ol> 6。代表的な結果二から三日間の湿度チャンバー内接種およびインキュベーションの後、真菌の増殖は、カーネルに表示を開始する必要があります。七日間の後処理、処理された植物で植物の成長がはっきりと見えるはずです、薬用電子モックコントロール（ 図1B、上）感染していないことがあります。長い潜伏期間は、より豊富な栄養成長（ 図1B、下）を助長しています。条件の下で、本明細書に記載します（ 図2G）、A. フラバス 、野生型NRRLそれぞれ8、6、8日、植民地化で、アフラトキシンの蓄積、及び分生子の生産の3357表示された最大値（ 図2、AC）。しかし、マイコトキシン汚染と分生子はエルゴステロールの単位当たりで比較した場合には、最大レベルは（ 図2、DE）はそれぞれ、4および6日目に観察された。 図2Fは、これらの菌のバイオマスに依存した最大値の観測をまとめたものです。興味深いことに、4-6日後接種の間に、カーネルは時間経過（ 図2H、下）上のサンプルからのトータルRNAで見られるように、核酸の分解を受けています。 我々自身を含むいくつかの研究は、examinを持っているED F. verticilliodiesは、トウモロコシのカーネル2,8,9,10,11,12に感染して正常時ポイント観測用として7月13日日使用されます。メソッドを使用して、ここに3,500-8,000 ng / gでカーネル4,13と5,000-10,000 ng / gのカーネル14,13からエルゴステロールレベルの範囲からフモニシンレベルの範囲を説明しました。 図3は、フモニシン（上）とエルゴステロール（下の代表的なピークを示しています。 ）HPLCクロマトグラムから。エルゴステロールの測定は、吸光度スペクトル15を介して行うことができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3727/3727fig1.jpg" /> 図1：真菌バイオマス、減数し、マイコトキシンの生産とカーネルのバイオアッセイから、栄養成長のための代表的な結果の定量化のためのフローチャート。トウモロコシのカーネルで菌類の病原性を評価するために使用する基本的な生物学的パラメータの定量化のために説明した方法を概説A）フローチャート。 B）代表者カーネルのバイオアッセイの結果。トップ、A.フラバス （NRRL3357）B73遺伝的背景のトウモロコシのカーネルでは栄養成長。種子は7日後に接種を受けた10 6胞子/ mLと写真の200μlで接種した。底部、F. B73背景13日感染後に接種したカーネルをverticillioides。カーネルは10 6胞子/ mlを200μlを接種した。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3727/3727fig2.jpg" /> 図2：アスペルギルスフラバスカーネルバイオアッセイ時間コース。 B73カーネルは10 6胞子/ ml アスペルギルスフラバス分生子懸濁液200μlを接種し、2〜8日（G）インキュベートした。 （;平均値±SE、N = 3-4）のすべての値は、4カーネルの乾燥重量の平均値から決定した。 A）植民地（エルゴステロールに基づいて）、（B）アフラトキシン、および（C）分生子は、上記の方法を用いて定量した。 E）アフラトキシン及び（F）分生子が表示されます。hのエルゴステロールを介して測定された菌類のバイオマスの関数として。 F）エルゴステロール、アフラトキシンの蓄積、および真菌バイオマスの関数としての分生子の最大値 - それぞれの量の最大値は100％に設定されて観察した。 （H）時間コースからの全RNAのレーン当たり1μgの。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3727/3727fig3.jpg" /> 図3。フモニシンB1（上）とフザリウムverticillioides（M3125）に感染したカーネルから分離されたエルゴステロール（下）の代表的な高性能液体クロマトグラフィ（HPLC）のクロマトグラム。

<ol><li>Tsitsigiannis, D. I., Keller, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxylipins+as+developmental+and+host-fungal+communication+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Oxylipins as developmental and host-fungal communication signals.</a> Trends Microbiol. 15, 109-118 (2007).</li>
<li>Gao, X., Shim, W. -B., Göbel, C., Kunze, S., Feussner, I., Meeley, R., Balint-Kurti, P., Kolomiets, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+a+maize+9-lipoxygenase+results+in+increased+resistance+to+fungal+pathogens+and+reduced+levels+of+contamination+with+mycotoxin+fumonisin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant-Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Disruption of a maize 9-lipoxygenase results in increased resistance to fungal pathogens and reduced levels of contamination with mycotoxin fumonisin.</a> Mol. Plant-Microbe Interact. 20, 922-933 (2007).</li>
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<li>Gao, X., Brodhagen, M., Isakeit, T., Brown, S. H., Göbel, C., Betran, J., Feussner, I., Keller, N. P., Kolomiets, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+the+lipoxygenase+ZmLOX3+increases+susceptibility+of+maize+to+Aspergillus+spp%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant-Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Inactivation of the lipoxygenase ZmLOX3 increases susceptibility of maize to Aspergillus spp.</a> Mol. Plant-Microbe Interact. 22, 222-231 (2009).</li>
<li>Gao, X. Q., Kolomiets, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-derived+lipids+and+oxylipins+are+crucial+signals+in+modulating+mycotoxin+production+by+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Toxin+Rev%22%5BJournal%5D)">Host-derived lipids and oxylipins are crucial signals in modulating mycotoxin production by fungi.</a> Toxin Rev. 28, 79-88 (2009).</li>
<li>Mukherjee, M., Kim, J. -E., Park, Y. -S., Kolomiets, M. V., Shim, W. -B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulators+of+G+protein+signaling+in+F.+verticillioides+mediate+differential+host-pathogen+responses+on+non-viable+versus+viable+maize+kernels%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">Regulators of G protein signaling in F. verticillioides mediate differential host-pathogen responses on non-viable versus viable maize kernels.</a> Mol. Plant Pathol. 12, 479-491 (2011).</li>
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<li>Shim, W. -B., Woloshuk, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+fumonisin+B1+biosynthesis+and+conidiation+in+Fusarium+verticillioides+by+a+cyclin-like+%28C-type%29+gene%2C+FCC1%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Micrbiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of fumonisin B1 biosynthesis and conidiation in Fusarium verticillioides by a cyclin-like (C-type) gene, FCC1.</a> Appl. Environ. Micrbiol. 67, 1607-1612 (2001).</li>
<li>Conversation with: Won-Bo Shim. , (2011).</li>
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</ol>

<p class="jove_content"&gt;私は開示することは何もありません。</p

<p class="jove_content"&gt;ここで説明する方法は広範囲にテストされ、真菌のコロニー形成、減数し、マイコトキシンの生産のための定量的な結果の生成に堅牢であることが証明されています。また、これらのメソッドはmycotoxigenic菌類（例えば、ピーナッツ、小麦、綿花、ピスタチオなど）による汚染の影響を受けやすい他の植物種の種子に適用する必要があります。有能な植物 - 病原体相互作用分析のために、それは種子が生きて維持することが不可欠です。種子の生存能力を維持しながら、カーネルの胚側の小さな創傷部位が感染を容易にします。</p&gt;<p class="jove_content"&gt;効果的に実行カーネルのアッセイは、フィールドからのパラレル結果に示されている。以前の研究で<sup&gt; 4</sup&gt;カーネルのバイオアッセイしたところ、<em&gt; lox3-4変異体</em&gt;の行は、野生型植物よりアフラトキシン汚染に対してより感受性であった。この結果は、4つの独立したフィールド試験から見た結果と直接線であった<sup&gt; 4</sup&gt;。これはカーネルのバイオアッセイは、決定および/または大規模な設定で、植物 - 病原体相互作用の...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ＃ </td></tr><tr><td>ポテトデキストロース寒天</td><td>フィッシャーScientifc </td><td> S71659A </td></tr><tr><td> Tween-20を</td><td>フィッシャーScientifc </td><td> BP337-100 </td></tr><tr><td>プラスチック製の培養容器</td><td> Sterilite </td><td> 1713LAB06 </td></tr><tr><td>ブレンダー</td><td> Vicam </td><td> 20200 </td></tr><tr><td> 24センチメートル溝付き濾紙</td><td> Vicam </td><td> 31240 </td></tr><tr><td> 1.5μmのガラスマイクロファイバー</td><td> Vicam </td><td> 31955 </td></tr><tr><td>アフラトキシン試験カラム</td><td> Vicam </td><td> G1024 </td></tr><tr><td> Afrlaテスト開発者</td><td> Vicam </td><td> 32010 </td></tr><tr><td>メタノール</td><td> Vicam </td><td> 35016 </td></tr><tr><td>アセトニトリル</td><td>フィッシャーScientifc </td><td> AC14952-0025 </td></tr><tr><td>エタノール</td><td>フィッシャー科学者TIFC </td><td> AC39769-0025 </td></tr><tr><td> C-18固相抽出カラム（準備9月​​SPE C18カラム） </td><td>フィッシャーScientifc </td><td> 60108-304 </td></tr><tr><td> O-フタルアルデヒド（OPA） </td><td>シグマケミカル社</td><td> 79760〜5グラム</td></tr><tr><td>ホウ酸</td><td>フィッシャーScientifc </td><td> BP168-500 </td></tr><tr><td>ホウ酸ナトリウム</td><td>フィッシャーScientifc </td><td> RDCS0330500 </td></tr><tr><td>メルカプトエタノール</td><td>フィッシャーScientifc </td><td> 45-000-231 </td></tr><tr><td>島津HPLC LC-20AT（ポンプ） </td><td>島津科学機器株式会社</td><td> LC-20AT </td></tr><tr><td> ZORBAX ODSカラム（4.6x150mm） </td><td>アジレント·テクノロジー</td><td> 443905-902 </td></tr><tr><td> Shimatzu RF-10Axl蛍光検出器</td><td>島津科学機器株式会社</td><td> RF-10AXL </td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム</td><td>フィッシャーScientifc </td><td> AC38987-0010 </td></tr><tr><td> FB1の基準</td><td>シグマケミカル社</td><td> F1147-1mgの</td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td> VWR </td><td> MK444410 </td></tr><tr><td> 0.45 umのナイロンメンブレン（HPLC）で13​​ mmのシリンジフィルター</td><td>ポールライフサイエンス</td><td> 4426 </td></tr><tr><td>エルゴステロール</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> 45480-50G-F </td></tr><tr><td>シンチレーションバイアル</td><td> VWR </td><td> 66021-602 </td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td> Vicam </td><td> G1124 </td></tr></tbody></table>

真菌の植民地、減数、およびカーネルのバイオアッセイを用いたマイコトキシンの生産の定量化

Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays

種子感染菌による穀物の腐敗は、人間と動物の健康に深刻なリスクに言及しないように、穀物生産の世界的な最大の経済課題の一つを引き起こします。穀物生産のうち、トウモロコシは穀物の整合性とマイコトキシン汚染種子における病原体によって誘発される損失のため、おそらく最も影響を受けた作物である。トウモロコシ生産者と食品および飼料のプロセッサに2つの最も普及していると問題のマイコトキシンは、それぞれアスペルギルスフラバスとフザリウムverticillioidesによって生成されたアフラトキシンやフモニシン、である。 分子植物-病原体相互作用における最近の研究では、真菌感染症とマイコトキシン汚染1,2,3,4,5,6に対する植物の応答に関連付けられた特定のメカニズムを理解する上で約束を示している。多くのラボでは、植物 - 病原体相互作用を研究するためにカーネルのアッセイを使用しているので、異なる生物学的パラメータを定量化するための標準的な方法の必要性がそう、そこです。別の研究室からの結果はクロスと解釈することができます。種子の定量分析するための堅牢で再現性のある手段のために、私たちは真菌の増殖、バイオマス、マイコトキシン汚染を定量化するためにラボでのカーネル·アッセイおよび後続のメソッドを開発しました。四滅菌トウモロコシのカーネルは、菌の懸濁液（10 6）をガラスバイアルに接種し、所定の期間インキュベートする。サンプルバイアルは、その後、HPLCにより血球、エルゴステロールベースの​​高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）によるバイオマスの分析、AflaTest蛍光法を用いてアフラトキシンの定量化、およびフモニシンの定量化による分生子の列挙のために選択されています。

種子感染菌による穀物の荒廃は、より良い植物 - 病原体相互作用を理解するための多数の研究努力を求めている。実験室の設定で種子菌の相互作用を研究するために、我々は真菌の繁殖、バイオマス、カーネルのバイオアッセイを用いたマイコトキシン汚染の定量化のための堅牢な方法を開発した。

種子感染菌による穀類の腐敗は、世界中の穀物生産において最大の経済的課題の一つとなっており、さらには深刻なリスクをもたらしている。

本手順の全体的な目的は、種子と真菌の分子レベルでの相互作用を研究するために、マイコトキシン合成、腐敗、および増殖を正確に定量化することです。これは、まずカーネルバイオアッセイを構築し、次にケディアを計数し、その後にマイコトキシンを定量化することによって達成されます。最後に、菌類バイオマスを測定します。最終的に、胞子計数法と高速液体クロマトグラフィーを組み合わせたkediaバイオマスおよび二次代謝産物の定量化を通じて、種子の生理状態がマイコトキシン産生菌の生殖発育および二次代謝に及ぼす影響を示す結果を得ることができます。この手法を普及させる主な利点は、複数の研究室間で方法を標準化し、異なる研究室からの結果を相互に解釈できるようにすることにあります。この手法は、病原性真菌が毒性戦略として植物の脂質代謝をどのように乗っ取るかなど、種子と微生物の分子相互作用の分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。一般的に、この手法に不慣れな場合は、真菌の株によって増殖や成長パターンが異なるため、困難が生じる可能性があります。そのため、実験を行う2週間前には、対象とする真菌と種子の相互作用に最適な条件を最適化しておくことが不可欠です。種子バイオアッセイ培養。ポテトデキストロース寒天培地（PDA）を用い、28 °Cで菌類病原体を培養します。開始の準備ができたら、粒齢、形状、大きさが同程度の種子を選別し、50 mLチューブに入れます。表面。70% ethanolを加え、室温で5分間チューブを振盪して種子を滅菌します。次に、滅菌水で1分間、続いて6% sodium hypochloriteで10分間振盪します。滅菌水を用いて、振盪しながら5分間の洗浄を3回繰り返します。その後、オートクレーブ済みのタオルの上で種子の水分を拭き取り、Aspergillus flavusを接種します。18ゲージの針を使用して、各種子の胚側に深さ0.5 centimetersの小さな傷を付けます。Fusarium verticillformeを接種する場合は、カミソリで深さ0.5 millimeterの切り込みを入れます。オートクレーブ滅菌済みの0.1% Tween 20溶液を5 mL加え、セルスプレッダーを用いて胞子を掻き集めることで、接種源懸濁液を調製する。オートクレーブ滅菌済みのモスリン布を少なくとも4層重ねて溶液をろ過し、重力を用いて菌糸を除去する。ヘモサイトメーターを用いて胞子濃度を算出し、1 mLあたり6×10⁶個（※原文のsix spores per milliliterは文脈上、通常は10のべき乗を含む濃度であるため、適切に調整してください）に調整する。両方の真菌種について。プラスチック容器にペーパータオルを5枚敷き、滅菌水 100 milliliters を加えて加湿チャンバーを作成します。次に、オートクレーブにカーネルを4粒ずつ入れます。20 mLのガラス製インストールバイアルを用意します。重量を測定し、その質量を記録してください。各バイアルキャップに200 µLの胞子懸濁液を加え、ボルテックスミキサーで撹拌し、カーネルに懸濁液を均一にコーティングします。次に、キャップを緩めて空気が自由に交換できるようにし、バイアルを湿度チャンバーに入れます。種子を、28 °C、12時間の明期と12時間の暗期の光周期条件下で、7日間または目的の期間までインキュベートします。感染期間後、感染した種子を含むシミュレーションバイアルに5 mLのオートクレーブ済み0.01% Tween 20を加え、1分間十分にボルテックスします。幅広のVREピペットチップを使用し、200 µLずつ2回に分けて1.8 mLの0.01% Tween 20を含む2 mLエッペンドルフチューブに移し、胞子懸濁液を直ちに希釈します。ヘモサイトメーターを用いて、各分注量を2回ずつカウントします。アフラトキシンを定量するには、単一サンプルの種子を50 milliliterのブレンダーカップに入れ、20 millilitersの80% methanolと0.05 gramsの塩化ナトリウムを加えます。蓋をして、高速で1分間混合します。清潔な回収容器にろ紙を敷き、抽出液をろ過します。ろ液10 millilitersを清潔な容器に移します。蒸留水20 millilitersを加え、よく混ぜ合わせます。サンプルを1.5 micronのガラスマイクロファイバーフィルターでろ過し、清潔なカップに回収します。ろ過した抽出液1 mLをALEテストカラムに適用し、圧縮空気を用いて1秒あたり1〜2滴の速度で抽出液をカラムに通過させます。蒸留水1 mLを2回、1秒あたり1〜2滴の速度でカラムに通過させ、空気が抜けるまでカラムを洗浄します。100% HPLCグレードのメタノール1 mLを、1秒間に1〜2滴の速度でカラムから溶出し、Glass Q Vetに回収します。EITにale test developerを1 mL加え、よく混合します。Q VETを校正済みのフルオリメーターに設置し、60秒後に測定します。acin B oneまたはFB oneの分析を行う場合は、各カーネルバイオアッセイサンプルにアセトニトリルと水の50:50溶液10 mLを加え、室温で攪拌せずに一晩抽出します。抽出液に6 mLの脱イオン水を加え、アセトニトリル2 mLおよび水2 mLでプレコンディショニングしたC 18固相カラムに適用します。サンプルをロードした後、カラムを水2 mL、次に水溶性アセトニトリル2 mLで洗浄します。HPLC分析用のサンプルを含むFB 1を、水溶性アセトニトリル2 mLで溶出させます。カラムEIT 1 mLを、ホウ酸バッファー 0.1 mLとアルデヒド 0.1 mLを含むバイアルに転移させてFB oneを誘導体化し、10分間インキュベートする。アセトニトリルと0.01 Mホウ酸溶液 0.5 mLを添加して反応を停止させる。アセトニトリルと0.1 Mリン酸ナトリウムの線形グラジエントを用いたHPLCによりFB oneを分析する。ステロール培養物を分析するため、7〜14日間トウモロコシ上で培養した菌類をFB one標準曲線と比較します。培養期間後、各バイアルに10 millilitersのクロロホルムメタノールを加えます。サンプルを十分に振とうし、その後、バイアルを室温の暗所で24時間インキュベートします。サンプルを5,000 RPMで3分間遠心分離します。次に、上清を0.45 micronのナイロンメンブレンでろ過します。サンプルをHPLCカラムに直接注入し、1.5 milliliters per minuteの流速で100%methanolを用いて溶出させます。HPLCグレードまたはgoogleから作成した標準曲線を用いて、ピーク面積を比較し、サンプルの定量を行います。接種後、加湿室で2〜3日間培養します。ここに示すように、種子上に菌類の増殖が見え始めるはずです。接種した種子上の処理後の栄養成長は、70％程度で明確に視認されるべきであり、一方で模擬コントロールは非感染である必要があります。また、培養期間が長くなるほど、より旺盛な栄養成長が促進されます。この図は、flavus野生型NR RL 3 3 5 7において、定着、アフラトキシン蓄積、およびkedia産生が、それぞれ4日目、6日目、8日目に最大値を示したことを示しています。しかし、マイコトキシン汚染とtionをロール単位で比較したところ、最大レベルはそれぞれ4日目と6日目に観察されました。本ビデオで実演した方法を用いたHPLCクロマトグラムにおける、フモニシンおよびROLの代表的な結果をここに示します。フモニシンの濃度範囲は、種子1gあたり3,500から8,000nanogramsであり、ROLの濃度範囲は、種子1gあたり5,000から10,000nanogramsです。種子のバイオアッセイが完了すれば、実験サンプルの数に応じて2～4日以内に、マイコトキシンおよび真菌バイオマスのすべてを測定できます。本手順を実施する際は、可能な限り無菌状態で操作を行うことが重要です。本手順に加えて、フィトホルモン分析、リピドミクス、プロテオミクス、トランスクリプトミクス、またはその他のインターオミックス解析などの手法を用いることで、この重要な種間相互作用にどの遺伝子、タンパク質、およびホルモン経路が関与しているかといった、さらなる疑問に答えることが可能です。

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学ぶ カーネルバイオアッセイを用いたマイコトキシン生産と真菌生育の定量法。種子と病原真菌の相互作用を解析し、作物保護と食品安全性向上に貢献する標準化手法です。

真菌の植民地、減数、およびカーネルのバイオアッセイを用いたマイコトキシンの生産の定量化

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