真菌の植民地、減数、およびカーネルのバイオアッセイを用いたマイコトキシンの生産の定量化

この手順の全体的な目標は、分子種子真菌の相互作用を研究するために、マイコトキシンの生合成、腐敗、および成長を正確に定量化することです。これは、最初にカーネルバイオアッセイを設定することで達成されます。次にケディアを列挙し、次にマイコトキシンを定量します。

最後に、真菌バイオマスが測定されます。最終的には、高速液体クロマトグラフィーと組み合わせた胞子計数技術を用いたケディアバイオマスと二次代謝産物の定量化を通じて、マイコ毒素原性真菌の生殖発達と二次代謝に対する種子生理学の影響を示す結果を得ることができます。この手法を普及させる主な利点は、複数のラボ間でメソッドを標準化し、異なるラボの結果を相互解釈できるようにすることです。

この方法は、病原性真菌が植物の脂質代謝を病原性戦略として乗っ取るモードなど、分子種子微生物の相互作用の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。一般に、この方法に不慣れな個人は、アンギの異なる系統が異なる成長と発達パターンを示すため、苦労する可能性があります。したがって、迷路を実行する2週間前に、お気に入りの菌類の種子相互作用の条件を最適化することが不可欠です。

カーネルバイオアッセイ培養。摂氏28度のジャガイモデキストロース寒天またはPDA上の真菌病原体。開始する準備ができたら、年齢、形状、サイズが類似したカーネルを選択し、50ミリリットルのチューブに入れます。表面。

70%エタノールを加え、チューブを室温で5分間振とうして、カーネルを滅菌します。次に、滅菌水で1分間、6%次亜塩素酸ナトリウムで10分間振とうします。滅菌水で3回すすぎ、それぞれ5分間振とうします。

次に、オートクレーブタオルで穀粒を軽くたたいて乾かし、アスペルギルス属のフレーバーに感染させます。18ゲージの針を使用して、各カーネルの胚側に0.5センチメートルの深さの小さな傷を作ります。フザリウム頂点感染症の場合は、かみそりの刃を使用して0.5ミリメートルの深さの切り込みを入れます。

培養プレートに5ミリリットルのオートクレーブ、0.1%tween 20溶液を加えて接種懸濁液を調製し、細胞スプレッダーを使用して胞子をこすり落とします。重力によって菌糸体を除去し、少なくとも4層のオートクレーブチーズクロスで溶液をろ過します。ヘモサイトメーターを使用して胞子濃度を計算し、ミリリットルあたり6個の胞子に傾向があるように調整します。

両方の真菌種用。プラスチック容器に5枚のペーパータオルを敷き詰め、100ミリリットルの滅菌水を追加して、湿度チャンバーを作成します。次に、各オートクレーブに4つのカーネルを配置します。

設置用バイアルに20ミリリットルのガラス。それらの重量を量り、それらの質量を記録します。各バイアルキャップとボルテックスに200マイクロリットルの胞子懸濁液を加えて、カーネルを懸濁液で均一にコーティングします。

次に、キャップを緩めて空気を自由に交換し、バイアルを湿度チャンバーに入れます。12時間の光、12時間の暗い写真撮影期間、摂氏28度で7日間、または所望になるまでカーネルをインキュベートします感染期間の後、感染したカーネルを含むシミュレーションバイアルに5ミリメートルのオートクレーブ0.01%を20の間に加え、1分間徹底的にボルテックスします。幅の広いVREピペットチップを使用して、2つの別々の200マイクロリットルのアリコートを0.01%Tween 20の1.8ミリリットルを含む2ミリリットルのeinorチューブに移すことにより、胞子懸濁液をすぐに希釈します。

ヘモサイトメーターを使用して、各アリコートを2回カウントします。アフラトキシンを定量するには、1 つのサンプルからカーネルを 20 ミリリットルの 80% メタノールと 0.05 グラムの塩化ナトリウムが入った 50 ミリリットルのブレンダーカップに加えます。蓋をして、高速で1分間ブレンドします。

きれいな収集容器に流動濾紙を置き、抽出物をフィルターに注ぎます。10ミリリットルの濾液をきれいな容器に移します。20ミリリットルの蒸留水を加えてよく混ぜます。

1.5ミクロンのガラスマイクロファイバーフィルターでサンプルをろ過し、きれいなカップに入れます。1ミリリットルのろ過抽出物をALEテストカラムに適用し、圧縮空気を使用して、ろ過された抽出物を1秒あたり1〜2滴の速度でカラムに押し込みます。空気が入るまで、1秒あたり1〜2滴でカラムを通過させることにより、1ミリリットルの蒸留水でカラムを2回洗浄します。

100%HPLCグレードのメタノール1ミリリットルを1秒あたり1〜2滴の速度でカラムに溶出し、Glass Q Vetに回収し、1ミリリットルのエールテスト現像液をEITに追加してよく混合します。Q VETを校正済み蛍光計に入れ、60秒で読み取ります acin B oneまたはFB one分析の場合、各カーネルバイオアッセイサンプルに水中のアセトニド試験の50 50溶液10ミリリットルを加え、攪拌せずに室温で一晩抽出します。

抽出物を6ミリリットルの脱イオン水と混合し、2ミリリットルのアセチルニトリルで前処理したC 18固相カラムに適用し、続いて2ミリリットルの水で前処理します。サンプルをロードした後、カラムを2ミリリットルの水で洗浄し、続いて2ミリリットルのアセチルニトリルを水で洗浄します。HPLC分析用のサンプルを含むFBを、2ミリリットルのアセチルニトリル水で溶出します。

0.1ミリリットルのホウ酸緩衝液と0.1ミリリットルのアルデヒドを含むバイアルに1ミリリットルのカラムEITを移し、10分間インキュベートしてFBを誘導体化します。0.5ミリリットルのアセチルニトリルと0.01モルのホウ酸溶液を加えて反応を停止します。FB 1 を HPLC で分析し、アセチル ニトリル 0.1 モルリン酸ナトリウムの線形グラジエントを使用します。

サンプルをFB 1標準曲線と比較して、ステロール培養、トウモロコシの真菌を7〜14日間分析します。インキュベーション期間後、各バイアルに10ミリリットルのクロロホルムメタノールを加えます。サンプルをよく振ってから、バイアルを室温の暗所で24時間インキュベートします。

サンプルを 5 、 000 RPM で 3 分間遠心分離します。次に、上清を0.45ミクロンのナイロンメンブレンでろ過します。サンプルをHBLCカラムに直接注入し、100%メタノールで毎分1.5ミリリットルの流速で溶出します。

HPLCグレードまたはグールから生成された標準曲線とピーク面積を比較することにより、サンプルを定量します。接種後、湿度チャンバーで2〜3日間インキュベートします。ここに示すように、真菌の成長がカーネルに現れ始めるはずです。

接種された穀粒上の70年代の処理後の栄養成長ははっきりと見えるべきですが、模擬対照は感染していないべきであり、より長い孵卵期間はより豊富な栄養成長を助長します。この図は、野生型NR 3 3 5 7が、それぞれ4日、6日、8日でコロニー形成、アフラトキシン、蓄積、およびケディア産生の最大値を示したことを示しています。しかし、マイコトキシンの汚染と濃度をロール単位あたりで比較すると、それぞれ4日と6日で最大レベルが観察されました。

ここに示されているのは、このビデオでデモンストレーションされた方法を使用した HPLC クロマトグラムからのフモニシンとロールの代表値です。フモニシンのレベルは、カーネルのグラムあたり 3 、 500 〜 8 、 000 ナノグラムの範囲で、ロールレベルはカーネルのグラムあたり 5 、 000 〜 10 、 000 ナノグラムの範囲です。カーネルバイオアッセイが完了すると、実験サンプルの数にもよりますが、イオン、マイコトキシン、真菌バイオマスをすべて2〜4日以内に測定できます。

この手順を試みるときは、この手順に続いて、できるだけ無菌のフィールドで方法を実行することを忘れないでください。フィト、ハーモニクス、リピドミクス、プロテオミクス、トランスクリプトミクス、またはその他の原子間法などの他の方法を実行して、この重要なクロスキングダム相互作用に関与している遺伝子、タンパク質、ホルモン経路などの追加の質問に答えることができます。