マウス気管から基底細胞および粘膜下腺管細胞の単離

本手法の目的は、研究、修復、および再生のために、マウス気管粘膜下腺管から幹細胞を単離することです。まず、安楽死させたマウスから気管を摘出します。その後、気管を洗浄し、切断および消化します。

その後、上皮を機械的に剥離させ、さらに消化して単一細胞懸濁液を作成します。次いで、細胞を染色してソートし、最終的にin vivoおよびin vitroアッセイに使用するための処理を行います。最終的に、この手法は気道上皮幹細胞の自己複製と分化を制御する主要な経路の特定に役立ちます。

これらの手法は、気道のin vitroおよびex vivoにおける上皮の修復と再生のモデルを提供するため、非常に重要です。これにより、正常な気道修復だけでなく、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、嚢胞性線維症、喘息などの気道疾患の研究が可能になります。この手法を考案したきっかけは、基底細胞を導管幹細胞から分離するための特異的な表面マーカーが見つからなかったため、表面上皮と基底細胞を剥離して導管細胞のみを残すという方法を決定したことでした。ここでは、気管解剖の手順を実演します。

気道上皮の剥離、単一細胞懸濁液の調製、およびFAC sorting（蛍光活性化細胞選別）について解説します。私の研究室のポストドクトラル研究員が、in vitroおよびex vivoモデルにおいて選別した細胞を処理する手順を実演し、研究室マネージャーが補助します。まず、安楽死させたマウスの腹壁を切開することからこの手順を開始してください。

腸を脇に寄せて腹部大動脈を露出し、その後、これを剥離します。横隔膜および胸壁の内側を両側から切開して胸腔を開き、心臓と肺を露出させます。さらに頸部に向かって切開を続け、精細剪刀を用いて脂肪と唾液腺を除去し、気管を露出させます。

胸腺を除去し、肺をその下方および後方の結合組織から切り離します。次に、気管と食道の間へピンセットを挿入して、両者を分離させます。喉頭との接続部より上の気管最上部を切断します。

次に、ピンセットで気管を保持し、付着部から剥離させます。心臓、肺、およびブロックと共に摘出するためにさらに下方へ進み、左右の主気管支の大部分が含まれるように肺門付近で心臓と肺を切除します。解剖顕微鏡下で、氷上の回収培地を入れた小型シャーレに気管を移します。

非常に細い5番のピンセット、鉗子、静脈チューブ、およびハサミを使用して、気管に付着しているあらゆる組織を除去します。これには、リンパ節、反回神経周囲の脂肪、甲状腺、および残存する肺血管が含まれます。気管の上部は特に注意が必要であり、輪状軟骨（CRICO cartilage）と第1気管軟骨環（C1）の間に位置する最大の下粘膜腺群を損傷させることなく、大きな喉頭軟骨片を除去する必要があります。

次に、気管をC4とC5の間で上部と下部に切断します。切断後、気管の腔を通して両方を切開します。気管の下部は1 mLマイクロ遠心チューブに、上部は15 mLコニカルチューブに移し、酵素消化を行い、単一細胞懸濁液へと調製します。

手順の次の段階では、気管の下部と上部を処理して単細胞懸濁液を作製します。ここではこれらを同時に処理する必要がありますが、2つの方法は順次的に実演します。気管の下部を処理するには、それを16 unit dis spaceの1 mL分をマイクロ遠心チューブに加え、室温で30分間インキュベートします。

その後、気管を0.5 mg/mLのDNase Iを含むDMMが入った新しいチューブに移し、室温でさらに20分間消化させます。消化後、精密ピンセットを用いて組織を新鮮な回収培地を含む滅菌済みのシャーレに移します。次に、解剖顕微鏡下で、上皮シートをそっと引っ張って下層の基底膜から分離させ、表面上皮を剥離させます。続いて、ピペットを使用して剥離した上皮を含む培地を50 mLコニカルチューブに移し、4 °C、1000 ×gで遠心分離します。

遠心分離後、SNATを除去し、0.1%トリプシンEDTAを添加します。チューブを37 °Cの振盪インキュベーターで30分間インキュベートします。インキュベーション後、1000 µLチップピペットを用いて繰り返しピペッティングし、細胞の凝集を解消して単一細胞懸濁液にします。上気管を0.15%プロナーゼ1 mLを含むコニカルチューブに入れ、4 °Cで4時間インキュベートします。気管の下部は、16 unitsのdisc baseを含む培地1 mLが入った1 mLマイクロ遠心チューブに移します。

インキュベーション後、チューブを穏やかにボルテックスし、気管を新しい回収用培地に入れます。解剖顕微鏡下で、表面上皮が完全に剥離していることを確認します。微細剪刀を用いて気管を細かく刻み、粘膜下腺のコンパートメントを開放します。

0.15% pronase中で、室温にて緩やかに振盪しながらさらに1時間インキュベートします。pronaseを除去した後、気管組織を遠心分離して回収します。0.1% trypsin EDTAを加え、37 °Cで30分間、振盪しながらインキュベートします。

次に、70 µmのストレーナーを用いて大きな塊を除去します。その後、ストレーナーを培地で洗浄します。消化した細胞塊および残っている腺組織の塊を、10 mLシリンジを用いて20ゲージ、23ゲージ、および26ゲージの針に通します。

各針のサイズで数回パッキングを繰り返し、その後、より小さいサイズの針に移行します。これで、ほとんどの細胞が単一細胞懸濁液の状態になります。懸濁液を40 micronストレーナーでろ過し、ストレーナーを培地で洗浄した後、細胞を遠心分離して回収します。

その後、適切な量の培地で細胞を再懸濁し、細胞数をカウントして、直ちにFACStainingおよびソーティングに進みます。未染色および単染色によるコンペンセーション用チューブを準備するために十分な量の細胞を採取します。残りの細胞を、trop tubeおよびI TGA sixに対する一次抗体で室温で15分間染色します。インキュベーション後、PBSまたは回収用培地で洗浄し、上清を非常に慎重に取り除きます。

適切な二次抗体を用いて細胞ペレットを染色します。室温にて暗所で10分間インキュベートしてください。その後、洗浄して染色液を除去し、ペレットを分散させます。

これにより、蛍光活性化細胞分取（FACS）による細胞のソートが可能になります。ソート後の細胞を用いて、修復および再生のメカニズムを調査し、in vitro でのスフィア形成培養を行うことができます。成長因子減少Matrigel 100 µLと、最大 50,000 個のソート済み細胞を含む完全培地 100 µLを混合します。

この混合液を24ウェルtranswellプレートの上室にピペットで分注し、下室に完全培地400 µLを分注して37 °Cでインキュベートします。下室の培地は1日おきに交換し、毎週、または層が薄くなった場合にはそれより早いタイミングで、Matrigelをさらに100 µL添加してください。

通常、スフィアは7日後に形成され、数週間にわたって培養するか、または継代培養することが可能です。in vivoモデルでは、ソートした細胞ペレットを、Matrigelと1:1で混合した完全培地を用いて、50 µLあたり5,000〜10,000個の濃度で再懸濁します。レシピエントのC57BL/6マウスを麻酔し、背部および上背部を滅菌して除毛します。

皮膚の中央に縦方向の切開を加えます。はさみの刃の鈍い側を使用して、皮膚と胸壁後方の両側にあるポケット状の隙間を広げます。マウスの前肢を上方および後方へ押し上げ、肩甲骨の内側縁を移動させて確認します。

次に、300 µLのインスリン用注射器を用いて、肩甲骨の正中側かつ脊椎の外側にある脂肪組織に、細胞懸濁液を50 µL注入します。皮下で盛り上がり（ブレブ）が形成されるはずです。反対側にも同様に注入を行い、皮膚の切開部をクリップまたは縫合し、3週間経過させます。安楽死させたマウスの皮膚を前述と同様に開き、両側の脂肪組織全体を安全マージンを設けて摘出します。

周囲に形成および拡張した可能性のある組織構造の見落としを防ぐため、摘出した脂肪組織をPFAで固定し、パラフィン包埋して、ブロック切削時に構造を飛ばしたり見落としたりしないようにします。一度40 µmでトリミングし、その後4 µmの厚さで薄切します。

それをガラススライドに載せ、顕微鏡下で観察して上皮構造が存在するかどうかを確認します。何も見られない場合は、再度トリミングを行い、この手順を繰り返します。本ビデオで説明したマウス気管の剥離を行うと、ここにある剥離済み気管のように、光学顕微鏡で確認できる剥離した気管が得られます。

30分間の消化後、左側に消化された気管と剥離された気管が示されています。右側には、4時間のプロナーゼ消化後の様子が示されています。上皮を剥離させると、粘膜下腺が組織から放出され、ブドウの房のような形態になります。

表面上皮細胞の除去を黒い矢印で示しています。粘膜下腺および管内の細胞の除去を緑色の矢印で示しています。単一細胞懸濁液のフローサイトメトリーでは、ここに示すような前方散乱光（FSC）および側方散乱光（SSC）のプロットが認められるはずです。

導管細胞とそれ以外の細胞が良好に分離されています。蛍光活性化細胞分取（FACS）によるフローサイトメトリーで、Trop2抗体を用いて気管細胞を観察する場合、培養開始から約1週間後、Matrigel中にスフィアが確認されます。これらは基底細胞由来であれば腔内的な外見を呈し、導管細胞由来であれば淡い外見を呈します。このプロセスの効率は1〜2%程度であり、Matrigel中には依然として単一細胞が存在しますが、これらは自己複製能を持たない粘膜下腺導管由来の細胞であると考えられます。

基底球はより大きく、管腔のような外観を呈します。マウスの脂肪組織に管導管幹細胞を注入すると、球形で中心に管腔を持つ粘膜下腺様構造が形成されます。これらは、H&E染色を行わなくても組織ブロック内で確認できます。

これらの上皮構造を含む切片を得るには、脂肪組織を通過する多くの横切断を行う必要があります。このビデオを視聴することで、乳腺管細胞から幹細胞集団を単離する方法を十分に理解できるはずです。この技術を習得すれば、10時間で完了させることができます。本手順に続いて、スフィア形成や再生促進成長因子に関するさまざまな疑問を解決するために、培養条件を変更することが可能です。