Name: マウス気管から基底細胞および粘膜下腺管細胞の単離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: 学ぶマウス気管から基底細胞および粘膜下腺管細胞を単離する方法。機械的剥離と酵素処理により単一細胞懸濁液を作成し、FACSで分離します。この技術は気道上皮の再生と自己更新メカニズムの研究に応用されます。

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我々は、ブロード幹細胞研究センターのFACSを認識し、特に細胞選別を持つ彼らの助けのためにジェシカ·スコールズとフェリシアCodreaに感謝したいと思います。仕事がCIRM RN2-00904-1、K08 HL074229、米国胸部学会/ COPD財団ATS-06から065、懸念財団、UCLAのジョンソン総合がんセンター胸部腫瘍学プログラム/肺がんの胞子、カリフォルニア大学がんによって資金を供給された研究調整委員会とグウィンハーゼンチェリーメモリアル研究所（BG）。

手順の概要 1。気管切開 2。気管を洗浄し、それを切断 3。単一細胞懸濁液に酵素消化し、処理 4。 FACS用染色およびソート 5。 in vivoおよびin vitroモデルのために選別された細胞を処理する 1。気管切開<ol><li>ペントバルビタールの0.1 mg/0.2 ccの腹腔内注射でマウスを安楽死させる。 </li><li>腹壁を開いてカットし、腹部大動脈を露出し、それを解剖する側に腸を移動します。 </li><li>心臓や肺を露出するために両側の横隔膜と前胸壁を切断することによって胸を開きます。気管を露出するために脂肪と唾液腺を除去首にカットアップを続けます。 </li><li>胸腺を外し、下と後ろにその接続オフ肺を切った。 SEPARそれらの間に鉗子を挿入することで、食道から気管を食べその後、喉頭との接続上、その上部の大部分で気管を切った。その後、鉗子で気管を保持し、その添付ファイルからそれを解剖し、心臓と肺の専用ブロックでそれを除去するために下向き継続。左右の主気管支のほとんどが含まれるように門の近くに心臓や肺を切り取った。 </li><li>氷の上に培地を収集含む小さなシャーレに気管を置きます。 </li></ol> 2。気管を洗浄し、それをカッティング<ol><li>解剖顕微鏡の下で、それに接続された他のすべての組織から気管をきれいにする非常に細かい点鉗子（第5号）及びVannasテュービンゲンはさみ（FST 15003から08 finescience.com）を使用します。これは含まれています：リンパ節、反回神経、脂肪、甲状腺、残りの肺血管を。気管の上部には、SMGの最大の束を損なうことなく、大きな喉頭軟骨を除去するために、特別な注意を必要とそれは輪状軟骨と第一気管軟骨輪（C1）は4の間に提出されています。 </li><li>上部とC4とC5の間下部に気管を切断してから、気管の管腔を介して両方の部分を切り開いた。 </li></ol> 3。単一細胞懸濁液に酵素消化および処理（SCS） <ol><li> 5前述のように、30分間室温（RT）でエッペンドルフチューブ内16 Uディスパーゼ1ml中に気管の下部をインキュベートする。その後、室温でさらに20分間DMEM中で0.5 mg / mlのDNase Iを追加します。 </li><li>滅菌シャーレに新鮮収集培地に消化気管を外し、解剖顕微鏡で表面上皮を取り除くことにしました。 50mlコニカルチューブに取り除か上皮を含む培地を転送するためにピペットを使用しています。 </li><li> 4℃、1,000×gで取り除か上皮をスピンダウン上清を除去し、目を揺らしながら0.1％トリプシン/ EDTAとインキュベートを追加37の電子管℃で30分間インキュベーター（200 rpm）を振ること。インキュベーション後、1,000μlの先端を使用して、塊を分割し、単一の細胞懸濁液を形成するためにピペッティングします。 </li><li> 0.15％プロナーゼの1ミリリットルを含む円錐管の上部気管を置きます。その後、4時間、4℃でインキュベートする。 </li><li>チューブボルテックスした後、新鮮な培地に集気管を置き、表面上皮（SE）の完全な剥離があることを解剖顕微鏡下で確認してください。 </li><li> SMGコンパートメントを開くために細かいハサミで気管をミンチした後、低速振盪しながら室温でプロナーゼで1時間以上インキュベートします。 </li><li>気管組織をスピンダウンし、プロナーゼを削除するには、上記のように振とうしながら30分間トリプシン/ EDTAとインキュベートし、37℃で0.1％を加算します。 </li><li> 10mlのシリンジを使用して20G、23Gと26Gの針を通過消化細胞塊と腺の残りのチャンク。前に、それぞれの針のサイズで継代を数回繰り返し辞任。今では、ほとんどの細胞は、SCSにする必要があります。 </li><li>その後、ストレーナを洗浄し、細胞をスピンダウンし、40μMストレーナーを通して懸濁液をろ過する。それから媒体の適切な音量で再構成する細胞は、細胞をカウントし、染色し、FACSソーティングにすぐに進みます。私たちは、これが生存率に影響を及ぼし、深刻な効率性を形成する球を減少させることがわかったので、4℃で、または数時間氷上で細胞を放置しないでください。 </li></ol> 4。 FACS用染色およびソート<ol><li>その後、室温で15分間、一次抗体、ヤギおよびラットTrop2 ITGA6を持つ細胞の残りの部分を染色する染色されていないし、単一ステンド補償チューブを準備するために十分な細胞を取る。その後、PBSで洗ったり、培地を回収し、上清を除去し、非常に慎重に、細胞ペレットを破る。 </li><li>室温で10分間、暗所でインキュベート適切な二次抗体を用いて染色、洗浄、上清を除去した後、ペレットを破る。 </li><li> FACSにあなたの電圧と補償、破片出門、非常に小さな細胞、細胞ダブレットと死細胞を調整した後、ARIA、。 SMG細胞の20〜50％がTROP2 +6になりますしながら、SEからのほとんどの細胞はTROP2正でなければならない。 </li><li>あなたのソートTrop2用ゲート+ ITGA6 SMG（管細胞）からSEから+細胞（基底細胞）とTrop2 +の細胞（+ /-ITGA6陽性細胞）を設定</li></ol> 5。ために選別された細胞の処理： 体外培養および in vivo モデルにおける 5月9日の文化を形成してin vitroでの球で 5.1 <ol><li> 5万選別された細胞までを含む完全培地10,11100μlと&quot;マトリゲル減少成長因子&quot;の100μlを混ぜます（ 表1を参照）は、次にトランス24ウェルの上室にこの混合物を入れた。その後、37℃、下部チャンバーに完全培地400μlを入れ、インキュベート℃に隔日下部チャンバー内の媒体を変更し、マトリゲルの余分100μlを加える毎週またはそれは薄くなった場合、以前の。 </li></ol> in vivoモデル 5.2 <ol><li> 50μlあたり5,000-10,000細胞の濃度でマトリゲルと1:1で混合完全培地中で再構成するソート細胞ペレットを。 </li><li>受信者C57/BL6マウスを麻酔。鎮痛剤としてsubcutaenouslyカルプロフェン（5 mg / kg）を投与する。背中の上部にある中央の長手方向の皮膚切開を行い、次にその背中を殺菌し、剃る。切開は脂肪パッド注射部位だけでなく、注射後ブレブ形成を識別するのに十分な大きさでなければなりません。アクセスと可視化を最大化するために両側胸壁の皮膚と背中の間に袋を広げてはさみの鈍側を使用します。 </li><li>肩甲骨が動いて確認するまで、後方マウスの前肢を押すことにより、肩甲骨の内側縁を識別します。 300μlのBDのインスリン注射器に細胞懸濁液50μlを取り、ちょうど肩甲骨へ内側へと横方向の脂肪パッドにそれを注入する椎骨。あなたはあまりにも深いそうでなければブレブを見ることができるはずです。クリップやステッチ皮膚切開後、反対側に同じことを繰り返します。マウスを確認し、48時間1日1回（5 mg / kgを、サウスカロライナ州）カルプロフェンを与える。 </li><li> 3週間後、pentobarbatol（0.1 mg/0.2 CC、IP）にマウスを安楽死させる、上記のように皮膚を開き、周りに形成され、拡張された可能性のある組織構造の欠落を避けるために安全マージンの両側から全体の脂肪パッドを解剖。パラフィン12にPFAとembedで固定してください。細心の注意は、トリミングや構造をバイパスしたり、見落とさないブロックを切削中に採用すべきである。ベストプラクティスは、一旦、4μmのスライスをカットスライドガラスの上に置き、ブロックかどうかのこの部分の任意の &quot;上皮構造&quot;があるかどうか確認するために、顕微鏡下でそれを調べる40μmをトリミングすることである。見たものが何もない場合は、もう一度トリミングし、この手順を繰り返します。 </li></ol> 6。代表的な結果 STRI図1Aに示すように、光学顕微鏡で見える裸に気管になり、マウスの気管pping。 図1Bは、上皮がブドウの組織と似た房から解放された粘膜下腺ストリッピング後の気管の明視野ビューを示しています。 プロナーゼはITGA6エピトープを削除し、TROP2ダクト細胞がITGA6に分離できない理由はここにある+と - 集団。しかし、ITGA6エピトープを保持ディスパーゼは、非常に短いインキュベーション時間であってもすべての表面上皮および管細胞を消化するため、3基底細胞からダクトを分離するために使用することはできません。単一の細胞懸濁液のフローサイトメトリーは、 図2Aに示されている前方散乱と側の散布図が表示されるはずです。残りの部分から管細胞の良好な分離気管細胞は、蛍光活性化細胞sortiためのフローサイトメトリーでTrop2抗体で見られるかどうか図2Bに示すように、NG（FACS）。球は、文化の中で、約1週間後にマトリゲルに表示され、 図3に示すように、外観に密集している必要があります。このプロセスの効率は1-2％であり、単一セルの順序がまだマトリゲル中に存在する可能性が高いと自己再生能力を持っていない粘膜下腺管から細胞を表すということです。 図4に示されている粘膜下腺様構造の形成におけるマウスの脂肪パッドの結果にダクト幹細胞の注入。これらはあっても、H＆E染色せずにブロックで見られている。これらは球状であり、中央の内腔を有する。多くのクロスセクションでは、これらの上皮構造を逃さないようにするために、脂肪パッドを介して行う必要があります。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3731/3731fig1.jpg" /> 図1：気管上皮の酵素消化。表面上皮細胞の除去はBLACと共に示されているk個の矢印、粘膜下腺管の細胞の除去は、緑色の矢印で示されています。光学顕微鏡で見える裸にされた気管はディスパーゼ消化の30分後に、プロナーゼ消化の4時間後に表示されます。 <img alt="図2A" src="/files/ftp_upload/3731/3731fig2A.jpg" /> 図2A。私。上皮表面が剥離した後、マウスの気管から代表的な前方散乱および側方散乱プロットを示す単一の細胞懸濁液のフローサイトメトリー。 II。マウスの気管から管細胞におけるTROP2表現するための代表的なFACSプロット。 <img alt="図2B" src="/files/ftp_upload/3731/3731fig2B.jpg" /> 図2B。私。代表的な前方散乱および側方散乱プロットを示したマウス気管の下部3分の2の剥奪表層上皮からの単一細胞懸濁液のフローサイトメトリー。 II。 suコマンドでITGA6式の典型的なFACSプロット上皮をrface。 ⅲ。緑の中の基底細胞集団のゲーティングを示す背面表面上皮から前方および側方散乱のもう一つの代表的なFACSプロット。 IV。典型的なITGA6とTROP2が緑色に細胞集団を表現する。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3731/3731fig3.jpg" /> 図3の球の開発のタイムコース。 A.ダクト球。球は培養液中で約1週間後にマトリゲルに表示する必要があると、ほとんどすべての外観が密集している。球体を形成していない単一細胞も見られている。 （スケールバー= 50μm）である。 B.基礎球は外観が大きく、管腔である。球体を形成していない単一細胞も見られている。 （スケールバー= 50μm）である。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3731/3731fig4.jpg" /> 図4：粘膜下腺様構造の形成におけるマウスの脂肪パッドの結果にダクト幹細胞の注入。代表的な構造脂肪パッドに示されており、一部はアルシアンブルー過ヨウ素酸シッフ染色とムチン（ライトブルー）の製造示されています。

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</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

気道からダクトおよび基底細胞を単離するために、この手法は、気道の修復及び再生及び気道疾患の我々の理解を向上させるために重要である。ここで説明する手法は、いくつかの重要なステップがあります。第一は、最適化された酵素消化期間です。第二は、細胞の毛刈りを防止するだけでなく、細胞塊を分割するために徐々に高くゲージ針で継シリアルを介して単一細胞懸濁液を作成することです。第三は、FACS分析し、適切な抗体を用いた細胞のゲーです。 ITGA6とNGFR様酵素ストリップ表面エピトープの一部として、1つの可能な修正は、エピトープを倹約するために酵素消化プロトコルを変更することです。このプロトコルはまた、細胞型の表面マーカーに特異的な抗体を変更することによって、気管の内皮細胞または他の間葉系細胞を単離するために使用することができる。 ダクトおよび基底細胞の分離の限界基底細胞と剥離上皮表面と背後にあるいくつかの基底細胞を残しての可能性のための必要性から管細胞を区別するために、表面マーカーの私達の現在の不足に関連しています。管細胞に特化した表面マー...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>媒体10を完了して下さい ： DMEM-F-12、50/50、1X） </td><td>メディアテック</td><td> 15から090-CV </td></tr><tr><td> HEPES（15mMの） </td><td>インビトロジェン</td><td> 15630 </td></tr><tr><td>炭酸水素ナトリウム（3.6ミリメートルまたは0.03％） </td><td>インビトロジェン</td><td> 25080 </td></tr><tr><td> L-グルタミン（4mMの） </td><td>メディアテック</td><td> 25から005-Clを</td></tr><tr><td>ペニシリン（100 U / ml）を</td><td>メディアテック</td><td> 30から001-CI </td></tr><tr><td>ストレプトマイシン（100μgの/ M） </td><td>メディアテック</td><td> 30から001-CI </td></tr><tr><td> アムホテリシンB（0.25μg/ ml）を</td><td> ロンザ </td><td> 17-836R </td></tr><tr><td>でsulin（10μg/ ml）を</td><td>シグマ</td><td> I6634 </td></tr><tr><td>トランスフェリン（5μg/ ml）を</td><td>シグマ</td><td> T1147 </td></tr><tr><td>コレラ毒素（0.1μg/ ml）を</td><td>シグマ</td><td> C8052 </td></tr><tr><td>上皮成長因子（25 ng / ml）を</td><td> BD </td><td> 354001 </td></tr><tr><td>ウシ下垂体抽出物（30μg/ ml）を</td><td>インビトロジェン</td><td> 13028-014 </td></tr><tr><td>ウシ胎児血清（5％） </td><td>フィッシャー</td><td> SH3008803HI </td></tr><tr><td>レチノイン酸（0.05μM） </td><td>シグマ</td><td> R2625 </td></tr><tr><td>マトリゲル減少した成長因子</td><td> BD </td><td> 354230 </td></tr></tbody></table> 表1は、。メディアコンポーネントを完了します。 <table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </TD&gt; <td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td>プロナーゼ</td><td>ロッシュ</td><td> 10165921001 </td><td> 0.15パーセントで使用： 4 AT-O / N°C消化合計気管細胞を（ALI培養用）を単離する -4時間消化4℃隔離するためにSMG </td></tr><tr><td>ディスパーゼ</td><td> BD Biosciences社</td><td> 354235 </td><td>室温で30分：16号機で使用</td></tr><tr><td> DNase Iを</td><td>シグマ</td><td> DN25 </td><td> 0.5 mg / mlで使用される： 室温で20〜30分間</td></tr></tbody></table> 表2。気管の酵素消化のために使用される酵素。

マウス気管から基底細胞および粘膜下腺管細胞の単離

Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea

大気道が1と我々は息毒素や感染性病原体による損傷することが影響を受けやすい環境と直接接触しており、。大気道が故に、私たちの体を守るための効率的な修復機構を必要とします。この修​​復プロセスは、気道内の幹細胞から発生し、気道から、これらの幹細胞を単離する修復および再生のメカニズムを理解する上で重要である。これは、気道疾患2につながることができます異常な修理を理解するためにも重要である。この方法の目的は、マウス気管粘膜下腺管から新規幹細胞集団を単離するために、粘膜下腺の3修復および再生のメカニズムを識別するために、in vitroおよび in vivoモデル系において 、これらの細胞を配置することです。この生産は、大規模な気道3からダクトおよび基底幹細胞を分離し、アッセイするために使用できる方法を示していますこれは、私たちを許可します嚢胞性線維症、喘息および慢性閉塞性肺疾患などの気道の疾患を研究する。現在、粘膜下腺管細胞を単離するためのメソッドはありませんし、粘膜下腺の再生を研究するin vivoモデルでは存在しています。

ここでは、マウスの気管から基礎および粘膜下腺管細胞を単離するための我々のプロトコルを示しています。また、作成するために背マウス脂肪パッドに幹細胞を注入する方法を実証<em生体内で&gt;</em粘膜下腺の再生&gt;モデル。

大気道は外部環境と直接接しているため、吸入した毒素や感染因子の影響を受けやすく、損傷しやすい特性を持っています 1. ...

本手法の目的は、研究、修復、および再生のために、マウス気管粘膜下腺管から幹細胞を単離することです。まず、安楽死させたマウスから気管を摘出します。その後、気管を洗浄し、切断および消化します。その後、上皮を機械的に剥離させ、さらに消化して単一細胞懸濁液を作成します。次いで、細胞を染色してソートし、最終的にin vivoおよびin vitroアッセイに使用するための処理を行います。最終的に、この手法は気道上皮幹細胞の自己複製と分化を制御する主要な経路の特定に役立ちます。これらの手法は、気道のin vitroおよびex vivoにおける上皮の修復と再生のモデルを提供するため、非常に重要です。これにより、正常な気道修復だけでなく、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、嚢胞性線維症、喘息などの気道疾患の研究が可能になります。この手法を考案したきっかけは、基底細胞を導管幹細胞から分離するための特異的な表面マーカーが見つからなかったため、表面上皮と基底細胞を剥離して導管細胞のみを残すという方法を決定したことでした。ここでは、気管解剖の手順を実演します。気道上皮の剥離、単一細胞懸濁液の調製、およびFAC sorting（蛍光活性化細胞選別）について解説します。私の研究室のポストドクトラル研究員が、in vitroおよびex vivoモデルにおいて選別した細胞を処理する手順を実演し、研究室マネージャーが補助します。まず、安楽死させたマウスの腹壁を切開することからこの手順を開始してください。腸を脇に寄せて腹部大動脈を露出し、その後、これを剥離します。横隔膜および胸壁の内側を両側から切開して胸腔を開き、心臓と肺を露出させます。さらに頸部に向かって切開を続け、精細剪刀を用いて脂肪と唾液腺を除去し、気管を露出させます。胸腺を除去し、肺をその下方および後方の結合組織から切り離します。次に、気管と食道の間へピンセットを挿入して、両者を分離させます。喉頭との接続部より上の気管最上部を切断します。次に、ピンセットで気管を保持し、付着部から剥離させます。心臓、肺、およびブロックと共に摘出するためにさらに下方へ進み、左右の主気管支の大部分が含まれるように肺門付近で心臓と肺を切除します。解剖顕微鏡下で、氷上の回収培地を入れた小型シャーレに気管を移します。非常に細い5番のピンセット、鉗子、静脈チューブ、およびハサミを使用して、気管に付着しているあらゆる組織を除去します。これには、リンパ節、反回神経周囲の脂肪、甲状腺、および残存する肺血管が含まれます。気管の上部は特に注意が必要であり、輪状軟骨（CRICO cartilage）と第1気管軟骨環（C1）の間に位置する最大の下粘膜腺群を損傷させることなく、大きな喉頭軟骨片を除去する必要があります。次に、気管をC4とC5の間で上部と下部に切断します。切断後、気管の腔を通して両方を切開します。気管の下部は1 mLマイクロ遠心チューブに、上部は15 mLコニカルチューブに移し、酵素消化を行い、単一細胞懸濁液へと調製します。手順の次の段階では、気管の下部と上部を処理して単細胞懸濁液を作製します。ここではこれらを同時に処理する必要がありますが、2つの方法は順次的に実演します。気管の下部を処理するには、それを16 unit dis spaceの1 mL分をマイクロ遠心チューブに加え、室温で30分間インキュベートします。その後、気管を0.5 mg/mLのDNase Iを含むDMMが入った新しいチューブに移し、室温でさらに20分間消化させます。消化後、精密ピンセットを用いて組織を新鮮な回収培地を含む滅菌済みのシャーレに移します。次に、解剖顕微鏡下で、上皮シートをそっと引っ張って下層の基底膜から分離させ、表面上皮を剥離させます。続いて、ピペットを使用して剥離した上皮を含む培地を50 mLコニカルチューブに移し、4 °C、1000 ×gで遠心分離します。遠心分離後、SNATを除去し、0.1%トリプシンEDTAを添加します。チューブを37 °Cの振盪インキュベーターで30分間インキュベートします。インキュベーション後、1000 µLチップピペットを用いて繰り返しピペッティングし、細胞の凝集を解消して単一細胞懸濁液にします。上気管を0.15%プロナーゼ1 mLを含むコニカルチューブに入れ、4 °Cで4時間インキュベートします。気管の下部は、16 unitsのdisc baseを含む培地1 mLが入った1 mLマイクロ遠心チューブに移します。インキュベーション後、チューブを穏やかにボルテックスし、気管を新しい回収用培地に入れます。解剖顕微鏡下で、表面上皮が完全に剥離していることを確認します。微細剪刀を用いて気管を細かく刻み、粘膜下腺のコンパートメントを開放します。0.15% pronase中で、室温にて緩やかに振盪しながらさらに1時間インキュベートします。pronaseを除去した後、気管組織を遠心分離して回収します。0.1% trypsin EDTAを加え、37 °Cで30分間、振盪しながらインキュベートします。次に、70 µmのストレーナーを用いて大きな塊を除去します。その後、ストレーナーを培地で洗浄します。消化した細胞塊および残っている腺組織の塊を、10 mLシリンジを用いて20ゲージ、23ゲージ、および26ゲージの針に通します。各針のサイズで数回パッキングを繰り返し、その後、より小さいサイズの針に移行します。これで、ほとんどの細胞が単一細胞懸濁液の状態になります。懸濁液を40 micronストレーナーでろ過し、ストレーナーを培地で洗浄した後、細胞を遠心分離して回収します。その後、適切な量の培地で細胞を再懸濁し、細胞数をカウントして、直ちにFACStainingおよびソーティングに進みます。未染色および単染色によるコンペンセーション用チューブを準備するために十分な量の細胞を採取します。残りの細胞を、trop tubeおよびI TGA sixに対する一次抗体で室温で15分間染色します。インキュベーション後、PBSまたは回収用培地で洗浄し、上清を非常に慎重に取り除きます。適切な二次抗体を用いて細胞ペレットを染色します。室温にて暗所で10分間インキュベートしてください。その後、洗浄して染色液を除去し、ペレットを分散させます。これにより、蛍光活性化細胞分取（FACS）による細胞のソートが可能になります。ソート後の細胞を用いて、修復および再生のメカニズムを調査し、in vitro でのスフィア形成培養を行うことができます。成長因子減少Matrigel 100 µLと、最大 50,000 個のソート済み細胞を含む完全培地 100 µLを混合します。この混合液を24ウェルtranswellプレートの上室にピペットで分注し、下室に完全培地400 µLを分注して37 °Cでインキュベートします。下室の培地は1日おきに交換し、毎週、または層が薄くなった場合にはそれより早いタイミングで、Matrigelをさらに100 µL添加してください。通常、スフィアは7日後に形成され、数週間にわたって培養するか、または継代培養することが可能です。in vivoモデルでは、ソートした細胞ペレットを、Matrigelと1:1で混合した完全培地を用いて、50 µLあたり5,000〜10,000個の濃度で再懸濁します。レシピエントのC57BL/6マウスを麻酔し、背部および上背部を滅菌して除毛します。皮膚の中央に縦方向の切開を加えます。はさみの刃の鈍い側を使用して、皮膚と胸壁後方の両側にあるポケット状の隙間を広げます。マウスの前肢を上方および後方へ押し上げ、肩甲骨の内側縁を移動させて確認します。次に、300 µLのインスリン用注射器を用いて、肩甲骨の正中側かつ脊椎の外側にある脂肪組織に、細胞懸濁液を50 µL注入します。皮下で盛り上がり（ブレブ）が形成されるはずです。反対側にも同様に注入を行い、皮膚の切開部をクリップまたは縫合し、3週間経過させます。安楽死させたマウスの皮膚を前述と同様に開き、両側の脂肪組織全体を安全マージンを設けて摘出します。周囲に形成および拡張した可能性のある組織構造の見落としを防ぐため、摘出した脂肪組織をPFAで固定し、パラフィン包埋して、ブロック切削時に構造を飛ばしたり見落としたりしないようにします。一度40 µmでトリミングし、その後4 µmの厚さで薄切します。それをガラススライドに載せ、顕微鏡下で観察して上皮構造が存在するかどうかを確認します。何も見られない場合は、再度トリミングを行い、この手順を繰り返します。本ビデオで説明したマウス気管の剥離を行うと、ここにある剥離済み気管のように、光学顕微鏡で確認できる剥離した気管が得られます。30分間の消化後、左側に消化された気管と剥離された気管が示されています。右側には、4時間のプロナーゼ消化後の様子が示されています。上皮を剥離させると、粘膜下腺が組織から放出され、ブドウの房のような形態になります。表面上皮細胞の除去を黒い矢印で示しています。粘膜下腺および管内の細胞の除去を緑色の矢印で示しています。単一細胞懸濁液のフローサイトメトリーでは、ここに示すような前方散乱光（FSC）および側方散乱光（SSC）のプロットが認められるはずです。導管細胞とそれ以外の細胞が良好に分離されています。蛍光活性化細胞分取（FACS）によるフローサイトメトリーで、Trop2抗体を用いて気管細胞を観察する場合、培養開始から約1週間後、Matrigel中にスフィアが確認されます。これらは基底細胞由来であれば腔内的な外見を呈し、導管細胞由来であれば淡い外見を呈します。このプロセスの効率は1〜2%程度であり、Matrigel中には依然として単一細胞が存在しますが、これらは自己複製能を持たない粘膜下腺導管由来の細胞であると考えられます。基底球はより大きく、管腔のような外観を呈します。マウスの脂肪組織に管導管幹細胞を注入すると、球形で中心に管腔を持つ粘膜下腺様構造が形成されます。これらは、H&amp;E染色を行わなくても組織ブロック内で確認できます。これらの上皮構造を含む切片を得るには、脂肪組織を通過する多くの横切断を行う必要があります。このビデオを視聴することで、乳腺管細胞から幹細胞集団を単離する方法を十分に理解できるはずです。この技術を習得すれば、10時間で完了させることができます。本手順に続いて、スフィア形成や再生促進成長因子に関するさまざまな疑問を解決するために、培養条件を変更することが可能です。

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