初代ヒトナイーブおよびメモリーT細胞から誘導した調節性T細胞の生成

この手順の全般的な目的は、一次T細胞からヒト制御性T細胞を生成することです。まず、ヒト血液サンプルから末梢血単核細胞を単離します。次に、PBMC混合液からCD4陽性T細胞を精製し、培養します。

6日後、フローサイトメーターを用いて細胞をナイーブT細胞、メモリーT細胞、エフェクターT細胞、および誘導調節性T細胞のサブセットに分画し、サプレッサーアッセイを実施します。これらの細胞を用いて、本手法によってサプレッサー活性を持つヒト調節性T細胞が生成されることを実証します。マウス細胞を用いた手法に対する本手法の主な利点は、ヒトを用いた手法であるため生理学的および臨床的な関連性がより高く、単一のドナー内でtregsを他の細胞集団と比較することが可能である点にあります。

個体内のばらつきを排除します。この手法により、従来型T細胞から調節性T細胞への移行を制御するイベントは何か、あるいは調節性T細胞に特異的なシグナル伝達および転写イベントは何かといった、調節性細胞分野における重要な疑問に答えることができます。調節性T細胞が免疫恒常性において極めて重要な役割を担っているため、この技術の意義は、自己免疫疾患、炎症性疾患、およびがんの治療へと広がります。

一般的に、使用される手法が多岐にわたり、一部のステップにおいて最適な細胞培養条件の許容範囲が非常に狭いため、この技術に慣れていない個人にとっては困難を伴います。この手法は、Tregの発達に関する知見を提供できるだけでなく、T細胞系譜分化の可塑性のモニタリングや、T細胞ミリューがTregの発達を誘導または抑制する能力の解析にも利用可能です。Tregの発達に関する手順のデモンストレーションを行うのは、Andrea McCoolと、大学院生のMarie Catherine Ranier、Gavin Ellis、Catalina Vale Ortegaです。

まず、40～60 mLのBバフィーコートからヒト末梢血単核細胞を分離します。バフィーコートを希釈するため、150 mLの滅菌PBSを含むオートクレーブ済み500 mLガラス瓶に転送します。その後、さらに滅菌PBSを加え、最終容量を250 mLにします。次に、10本の50 mLコニカルチューブに、それぞれ20 mLのLymphoPrep溶液を満たします。

次に、希釈したバフィーコート25 millilitersを、Lympho prep溶液の上に静かに重層させます。この際、Lympho prep溶液を乱さないように注意してください。チューブを室温、500 times Gで30分間遠心分離します。リンパ球画分を乱さないよう、遠心分離機のブレーキを必ずオフにしてください。

遠心後、PBM CSはリンパ球調製層と血漿培地層の界面に位置し、回収可能な状態になります。PBMCを含むバフィーコート層を約1 mLの血漿培地が覆うまで、上澄みの血漿培地を吸引して除去します。10 mLピペットを使用して、PBMCを新しい50 mLチューブに移します。

細胞をPBSで2回洗浄した後、冷たいRPMI 50 mLで再懸濁し、血球計数計を用いて細胞数をカウントします。濃度を決定した後、通常、8 × 10⁸から1 × 10⁹個のpBMCが回収されます。pBMCを、2% FBSおよび1 mM EDTAを含むPBS中で、最終濃度5 × 10⁷/mLとなるように再懸濁します。その後、細胞を新しい14 mLポリプロピレン製ラウンドボトムチューブに移します。

次に、EAsキットを用いて、目的の細胞をネガティブセレクションします。キットに付属しているT細胞濃縮用カクテルには、一方に抗デキストリン抗体を、もう一方に不要な細胞表面抗原に対する抗体を持つテトラマー抗体複合体が含まれています。このカクテルを細胞に添加すると、テトラマー抗体複合体が不要な細胞を結合させます。

次にデキストランコーティング磁性粒子を添加し、これを四量体抗体複合体に結合させることで、不要な細胞を磁性粒子に連結させます。その後、磁石を用いて不要な細胞を目的の細胞から分離し、CD4陽性T細胞を単離するために回収します。1 × 10⁸から4.25 × 10⁸個のPBMCを15 mLコニカルチューブに分注します。次に、PBMC 1 mLあたり50 µLのヒトCD4陽性T細胞濃縮用抗体カクテルを添加します。

室温で10分間混合し、インキュベートします。磁性粒子を混合し、溶液全体に均一に分散させます。pbmc 1 mLあたり100 µLの磁性粒子を添加します。

ピペッティングで2〜3回穏やかに混ぜた後、室温で10分間インキュベートします。FBSとEDTAを含むPBSを加え、1本あたりの容量を10 millilitersにし、ピペッティングで2〜3回穏やかに混ぜます。次に、キャップを外したチューブをceptマグネットに入れ、チューブを入れたまま5分間静置します。

回収率を高めるため、目的の細胞を分離して新しい50 milliliterチューブに液体を移します。チューブにPBS-FBS-EDTAを追加して混合し、サンプルを再びマグネットに配置して、この工程を繰り返します。細胞の分離が完了したら、細胞数をカウントし、室温で500 ×gで5分間遠心分離します。

細胞ペレットを分極化培地で再懸濁し、濃度を2 × 10⁶ cells/mLにします。その後、ビデオの次のセクションに記載されている通り、調節性T細胞を誘導するための培養に進みます。anti-CD3コート済みの6ウェル組織培養プレートを37 °Cで予熱しておきます。

プレートが温まったら、ウェルからPBSを吸引します。次に、CD four陽性濃縮細胞懸濁液を各ウェルに4 mLずつ加えます。培地の蒸発を抑えるため、空のウェルにはPBSを満たします。その後、3日間インキュベートします。

プレートを500 ×gで5分間遠心分離します。次に、プレート底面の細胞を乱さないように培地を半分取り除き、新しい培地と交換してさらに2〜3日間インキュベートします。これで細胞を、次節で述べるフローサイトメトリー（FACS）でソートするか、後述する抑制アッセイのターゲット細胞として使用することができます。2〜3日経過後、細胞およびフローサイトメトリー用の適切なコンペンセーションコントロールを調製します。誘導された調節性ナイーブT細胞およびメモリーT細胞を分離するためのソートでは、付属文書に従い、ソート対象の細胞をanti-CD25 PE、anti-CD45RA PE-Cy5、およびanti-CD127 APCで染色します。

また、FACS解析用に、適切なコンペンセーションコントロールに抗体を必ず添加してください。染色後、細胞を洗浄バッファーを用いて1×10⁷ cells/mLの濃度で再懸濁し、1.5 µL/mLのDNase Iを添加して、40 µmのナイロンセルストレーナーでろ過します。細胞を5 mLのラウンドボトムポリプロピレンチューブに移し、1本あたり3.5 mLを超えないようにしてください。

補正コントロール細胞を300 µLの洗浄バッファーで再懸濁します。フローサイトメーターの補正を行い、PE A PCおよびPE sci-fiフィルターによるクロス検出を最小限に抑えます。ソート後の制御性T細胞がT細胞の増殖を抑制できるか評価するため、tregs、ナイーブT細胞、およびメモリーT細胞を、1 mLの新生仔牛血清を含む5 mLポリスチレン製ラウンドボトムチューブにソートするようにゲートを設定します。

ここでは抑制アッセイを行います。ソートされていないCD4陽性濃縮細胞をターゲット細胞として使用します。これらの細胞には、CD25陽性誘導調節性T細胞が含まれていない必要があります。

まず、細胞トレースキットを用い、メーカーの指示に従ってターゲット細胞をCFSEでラベルします。その際、細胞1mLあたり2µLではなく、5Mストック溶液を1µL使用してください。次に、マイクロ遠心チューブ内で、総細胞数と同数のtreg抑制検査ビーズを迅速遠心によりペレット化します。ビーズをRPMIで1回洗浄し、遠心後に再度ペレット化してください。

RPMIを吸引し、96ウェル丸底組織培養プレートの各ウェルに、適切な濃度の抑制アッセイ培地8 µLで再懸濁します。CFSE染色した標的細胞を8 µL添加します。ビーズと分極ソートされた細胞を確認し、新鮮な抑制アッセイ培地で最終容量まで調整します。

200 µLの培地を用います。すべての条件は3連でプレートに播種します。コントロールを準備するには、100 µLのCFSE染色細胞、8 µLのインスペクタービーズ、および1×10⁵個の新鮮な未染色細胞を、92 µLのサプレッサーアッセイ培地に加えます。

最初の2つのコントロールウェルに、1ウェルあたりの培地を分注します。次に、CFSE染色細胞100 µLと、92 µLのサプレッサーアッセイ培地に懸濁した未染色の新鮮な細胞1 × 10⁵個を添加します。続く2つのコントロールウェルに、1ウェルあたりの培地を分注します。

プレートをアルミホイルで覆い、暗所としてインキュベーター内に5日間静置します。ピペッティングによって各ウェルから細胞を回収し、5 mLのポリスチレン製ラウンドボトムチューブに入れます。細胞を4 °Cで500 ×g、5分間遠心分離します。

培地を吸引し、300 µLの冷たいFox washing bufferで再懸濁します。誘導調節性T細胞分化の進行をモニターするため、精製したヒト一次CD4陽性CD25陰性T細胞をiTreg培地で培養し、0、1、3、5日目に分注して回収し、フローサイトメトリーによりCD45RA、FoxP3、CTLA4、およびCD25マーカーの発現を解析しました。これらの疑似カラードットプロットに見られるように、5日間のタイムコースにおいて、TGF-βおよびIL-2存在下でのCD3架橋に応答して細胞がin vitroで増殖および分化し、最終的にCD45RA陰性、FoxP3高発現、CTLA4高発現、およびCD25高発現のプロファイルに至ります。これは、従来のT細胞前駆細胞から誘導tregが分化したことを示しています。次に、生成されたtregのT細胞増殖抑制能を相対的に評価します。

CFSEで標識した細胞を、ソートしたナイーブメモリーT細胞およびiTreg細胞と共に、Tregサプレッションインスペクタービーズ存在下で培養し、その結果をこのヒストグラムに示します。CD25高発現、CD45RA陰性、CD127低発現の誘導性制御性T細胞のみが、5日間の培養後に抑制能を獲得したサブセットとなっています。

これは、本システムで生成された細胞が、表現型および機能の両面において抑制性調節性T細胞であり、FOX P3およびCD25を一過性に発現するものの免疫抑制能を持たない活性化従来型T細胞ではないことを示しています。誘導調節性T細胞の存在により、CD4陽性T細胞の増殖は完全に消失します。数値は、T細胞精製サブセットにおいても同様の結果となることを確認するために、分裂したCFSE標識細胞の割合を示しています。

ヒト末梢血由来のナイーブT細胞およびメモリーT細胞をCFSEで染色し、Treg培地で培養した。5日後、細胞のフェノタイプ解析を行い、図に示すように細胞分裂率を算出した。ここでは、ナイーブT細胞プールおよびメモリーT細胞プールから、5日間の培養を経てTregを誘導した。

標準的なIT reg培地において、CFSEで染色しました。初期細胞の染色結果から、ナイーブT細胞およびメモリーT細胞のいずれも、数回の細胞分裂を経て初めて制御性T細胞へと分化することが示されています。CFSE染色のプロファイルを比較すると、5日間の培養期間において、誘導制御性T細胞が最も増殖能の高い細胞であることが分かります。このビデオを視聴することで、単一のドナーから得られたナイーブT細胞、メモリーT細胞、または全T細胞の集団から、誘導Tregを得る方法について十分に理解できるはずです。この手順を試みる際は、以下の点に留意してください。

全工程を通じて無菌操作を維持し、本手順に従ってCFSEが光にさらされないようにすることが重要です。細胞分裂速度の違い、特定のサイトカイン合成、および調節性T細胞と従来型T細胞の間でのイオンチャネルの使用状況といった他の疑問を明らかにするために、機能解析などの他の手法を、開発後に実施することができます。この手法は、免疫学分野の研究者が、ヒト患者における自己免疫疾患やその他のtreg関連の病理を探索する道を開きました。

ヒト血液の取り扱いは極めて危険であるため、本手順の実施にあたっては、適切な血液銀行での検査や適切な廃棄処理などの予防措置を必ず講じてください。