Name: 初代ヒトナイーブおよびメモリーT細胞から誘導した調節性T細胞の生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: 学ぶ、ヒト初代ナイーブおよびメモリーT細胞から調節性T細胞を誘導する方法。単一ドナー内でTregと他のT細胞サブセットを比較し、免疫寛容のメカニズムを解明する。

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<p class="jove_content"&gt;著者は、フローサイトメトリー解析とソーティングと彼らの支援についてジェニファー·ストレンジとグレッグ·バウマンに感謝したいと思います。この作品は、NCRRからNIHグラント番号2P20 RR020171によってサポートされており、FMにケンタッキー大学のスタートアップ資金によりされた。GIEは、大統領大学院フェローシップとケンタッキー州の機会奨学金の支援を承認します。</p

1。バフィーコートからヒト末梢血単核細胞（PBMC）の分離<ol><li>病院や近くの血液センターの場所からバフィーコートのいずれかの単位を取得します。私たちの血液センターでは、正常な血液ドナーから得た単位当たりのバフィコートの約40〜60 mLで提供してくれます。 </li><li>バフィーコートを希釈するために滅菌したPBSを含むオートクレーブ500mLのガラス瓶に血液を注ぐ。 PBS +バフィーコートの最終容量は250mLのでなければなりません。 </li><li> 20 mLのLymphoprep溶液を用いて各10 50mLのコニカルチューブを埋める。 </li><li>優しくLymphoprep解決を邪魔しないように注意して、希釈したバフィーコートの25 mLのLymphoprepソリューションを重ねる。 </li><li> 500×gで室温で30分間チューブをスピン。リンパ球分画を邪魔しないようにするように、遠心機のブレーキをオフにしていることを確認してください。 </li><li> Lymphoprepとピペットを用いてプラズマ媒質層との界面でのPBMCを収集します。約1mLまでプラズマ媒質をオフに吸引まだPBMCを含むバフィーコート層をカバーしています。新しい50 mlチューブにPBMCを転送するために10 mLのピペットを使用しています。 </li><li> PBSで2回細胞を洗浄し、血球を計数するための冷RPMI 50mlに細胞を再懸濁します。 1×10 9 PBMCを-典型的な回復は8×10 8である。 </li></ol>この手順は、血液の小さなボリューム用にスケールダウンすることができます。全血サンプルの希釈は、PBSで1:1です。 2。合計CD4の磁気負の選択+ T細胞、CD4 + CD45RA +ナイーブT細胞またはCD4 + CD45RO + EasySep濃縮キットを使用してPBMCからのメモリーT細胞が（幹細胞技術） 4.25×10 8末梢血単核細胞〜1×10 8のために従うべき手順を実行します。 <ol><li> 2％FBSおよび1mMのEDTAを含むPBS中でmL当たり5×10 7の最終濃度にPBMCを再懸濁します。新鮮な14 mLの丸底ポリプロピレンチューブに細胞を移動します。 <ol clasS = &quot;lalpha&quot;&gt; <li> 合計ヒトCD4 + T細胞の負の選択によるの単離：ヒトCD4 + T細胞の濃縮抗体のカクテル（PBMCのmL当たり50μL）、混合し、室温で10分間インキュベートを追加します。 </li><li> 負の選択によるヒトナイーブT細胞の単離：PBMC細胞懸濁液、ミックスのmL当たりの抗CD45RO抗体50μLを加え、室温で15分間インキュベートします。キット（PBMCのml当たり50μL）、10分間室温で混合し、インキュベートで提供される濃縮カクテルを追加します。 </li><li> 負の選択によるヒトメモリーT細胞の分離は、人間の記憶CD4 +抗体のT細胞の濃縮カクテル（PBMCのmL当たり50μL）、ミックスを追加し、室温で10分間インキュベートします。 </li></ol></li><li>同様に、ソリューション全体に配布するだけでなく磁性粒子を混ぜ合わせます。渦ナノ粒子は、ナイーブなキットからしないでください。 </li><li>磁性粒子（合計100 CD4ためのPBMCのmL当たりμL+とナイーブT細胞の選択、メモリーT細胞選択のためのPBMCのmL当たり50μL）を追加します。優しくナイーブT細胞の選択やメモリまたは合計CD4 + T細胞選択のための5分間、10分間室温で2〜3倍とインキュベートをピペッティングにより混和する。 </li><li> PBSアップチューブあたり10 mLにボリュームを持って来るために2％FBSおよび1mM EDTAを含む追加します。静かに合計CD4 + T細胞、ナイーブおよびメモリーサブセットは、それぞれ5、10または2.5分間銀EasySep磁石に上限なしチューブを配置する前に2〜3回ピペッティングして混ぜる。 </li><li>まだEasySep磁石のチューブで、興味のある細胞を単離するために、新しい50 mlチューブに液体を注ぐ。 </li><li>ステップ2.5と優れた回復のための2.6を繰り返します。 </li></ol> 3。調節性T細胞を誘導する細胞培養条件<ol><li>第一抗CD3抗体を希釈することにより、ステップ1と2、コート組織培養プレートの前日（滅菌PBS中の1μg/ mLの濃度にOKT3クローン）。 6ウェルプレートはPBSを2mL +ウェルあたり抗CD3を追加するために、12ウェルプレートに1 mLを加え、または24ウェルプレートのウェルあたり500μLを追加します。コー​​ティングしたプレート4℃で使用するまで保管してください。 </li><li> RPMI-1640 2.06 mMのグルタミン-Iおよび25 mMのプリ補足し、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン及び50μMβ-メルカプトエタノール、10％熱不活性化ウシ胎児血清（FBS）を添加することにより偏光媒体を準備します。 HEPES緩衝液。次に、2 ng / mLのTGF-β、5 ng / mLのIL-2を追加します。ここで、一つのメディアに関心のリガンド又は阻害剤を追加することができます。偏光媒体の2×10 6細胞/ mLの濃度で、ステップ2から細胞を再懸濁します。 </li><li> 37前のウォームプレート°Cとセルを追加する前に、抗CD3でコーティングされた井戸のPBSを吸引除去する。 12ウェルプレートまたは24ウェルプレートの細胞を1mLの細胞の2mLを、6ウェルプレートに4 mLのウェルあたりの細胞懸濁液を追加します。の蒸発を減らすためにPBSで空の井戸を埋めるメディア。 37℃/ 5％CO 2で3日間インキュベートします。 </li><li> 3日後めっきでは、500×gで5分間遠心分離にプレートをスピンダウンする。プレートの下にT細胞に影響を与えずに、メディアの半分を削除し、新鮮な培地と交換します。井戸が細胞（3×10 6個 / ml以上の濃度）で過密になった場合あるいは、同様に別の抗CD3コートプレートにボリュームを分割し、元のボリュームに戻って新鮮な培地を追加します。 37℃/ 5％CO 2で二から三日以上インキュベートします。 </li></ol> 4。 T細胞の3つの集団の蛍光活性化セルソーティング（FACS） <ol><li>滅菌したPBSに0.5％（w / v）のウシ血清アルブミン（BSA）および2mM EDTAを加えることにより洗浄バッファーFACSを準備します。 4の場所バッファは°C、コールド取得します。 </li><li>ウェル細胞培養液から細胞を除去し、完全な細胞の回復を確実にするためにPBS 2mLで各ウェルを洗浄してください。 50 mLのポリプロピレンチューブ内のすべてのセルを配置し、10、500 xgで遠心分離分4℃で</li><li>細胞密度を決定するために血球の細胞をカウントします。 </li><li>補償制御のための4つの独立した5 mLの丸底ポリスチレンチューブ内の場所チューブあたり3〜5×10 5細胞を。 50 mLのポリプロピレンチューブ、チューブあたり以上35以上×10 6細胞の残りのセルを配置します。 </li><li> 4°Cと吸引メディアで5分間、細胞をスピンダウンする。 1×10 6細胞当たりの冷洗浄緩衝液90μLにソートする細胞を再懸濁します。冷洗浄緩衝液100μLの補償制御チューブに再懸濁します。 </li><li>ソートする細胞に、抗CD25-PE、1×10 6細胞当たりの抗CD127-APCの抗CD45RA-PE-Cy5で、1μLの3μLの2μLを兼ね備えています。第四管に抗CD127-APCの第3のチューブAND1μLにPE-Cy5で-第1の補償制御管、第二の管に抗CD25-PEの2μL、抗CD45RAの3μLにない抗体を加えなかった。暗闇の中で45分間氷上でチューブをインキュベートします。 </li><li&gt;はソートするセルと補償制御チューブに1 mLに冷洗浄緩衝液10mLを追加します。 4℃で5分間、500 xgですべての細胞を遠心℃、 </li><li>洗浄緩衝液のmL当たり1×10 7個の細胞の濃度でバッファと再懸濁し、細胞を吸引除去する。 40μmのナイロンセルストレーナーでろ過する前に、細胞のmL当たりのDNase IIの1.5μLを追加します。チューブあたり以上3.5未満mLで、複数の5 mLの丸底ポリプロピレンチューブに細胞を移動します。洗浄バッファー300μLで補償制御の細胞を再懸濁します。 </li><li> PE、APCとPE-Cy5のフィルタによってゼロクロス検出を最小限に抑えるためにMoFloフローサイトメーターで補正を設定します。 1 mLの新生仔ウシ血清を含む5 mLの丸底のポリスチレンチューブにT細胞、ナイーブ（CD25-CD45RA +）とメモリ（CD25 - - CD45RA） - iTregs（細胞CD25 こんにちは CD127 -/LOW CD45RA）をソートするためにゲートを設定します。 </li></ol> 5。抑制アッセイ<ol><li> supprを作るessionアッセイ100 U / mLのペニシリン、ストレプトマイシン100μg/ mLで、5 ng / mLのIL-2およびTGF-βにAIM-Vの2 ng / mLを加えることによってメディア。 </li><li>手順1および2に示すように、アッセイの日は、異種のCD4 +バフィーコートからT細胞を精製する。これらは抑制アッセイの標的細胞となり、 図2、0日目に見られるように、CD25 + Treg細胞が含まれていません。 </li><li>代わりに2μLの細胞のmL当たり5 mMのストック溶液のわずか1μLを用いて除いては、製造元の指示に従って、CellTraceキットのラベル細胞。直接光から出たまま、5 mMのストック溶液を作るためにCFSE 1バイアルにCellTraceキットによって提供されるDMSOの18μLを追加します。 1×10 6細胞/ mlの最終濃度になるように温めておいたPBS + 0.1％（w / v）のBSAにおける標的細胞の必要な数（1×10 7の最大数まで）に再懸濁します。細胞のmL当たりの5mM CFSEの1μLを加え、5 minut、37°C​​の水浴中でインキュベートES。染色を急冷し、氷上で5分間インキュベートし、10％FBSを完全に、氷冷RPMI 5ボ​​リュームを追加します。風邪完全RPMIと抑制アッセイ培地100μLあたりに再懸濁し、1×10 5細胞で2回以上の細胞を洗浄します。 </li><li> Tregの抑制インスペクタビーズは 2×10 7ビーズ/ mLのストック濃度である。ペレット、ビーズの数は、エッペンドルフチュー​​ブ内で簡単に遠心分離して実験ごとに細胞の総数に等しい。 RPMIおよび再ペレットで一回ビーズを洗浄します。 RPMI吸引した後、再懸濁し、ビーズはとてもよく当たりビーズの適切な量の抑制アッセイ培地の8μLであることを。 </li><li> 96ウェル丸底組織培養プレートに、希望するターゲットにCFSEで染色した細胞（1×10 5細胞/ mL）を、インスペクタビーズや新鮮な抑制アッセイ培地の偏光およびソート細胞（1×10 5細胞/ mL）を追加（CFSE染色）：200μLの最終容量でエフェクター（ソート）の比率。すべての条件がtripliに設定されているケイツ。 </li><li>ウェルあたり92μL抑制アッセイ培地にCFSE染色した細胞、インスペクタビーズの8μL、新鮮な、染色細胞の1×10 5の100μLを加えることにより二つの制御条件の最初の準備をします。上記のようなものインスペクタビーズのTregせずに、同じ細胞成分と第二の制御を準備します。 </li><li>五日間37℃/ 5％CO 2でアルミホイルとインキュベートし、プレートをカバーしています。 </li><li>暗闇の中で、5 mLの丸底ポリスチレンチューブにピペッティングし、場所によって、各ウェルから細胞を収集します。 4°C、吸引メディアで5分間、500 xgで遠心し、ステップ4から洗浄バッファー300μL冷たいFACSに再懸濁します。最初の3×10 4 CFSE +細胞クエスト·ソフトウェアとヒストグラムで標的細胞を表すライブリンパ球ゲートからのイベントを分析します。 </li></ol> 6。代表的な結果 5日間の時間カップリングを介し、フローサイトメトリー疑似カラードットプロットの例RSE監視iTregの差別化がFoxP3のとCD25の共発現の相対に基づいて、CTLA-4とCD45RAは、 図2で見ることができます。 図3のヒストグラムはiTregs（CD25 こんにちは CD45RA - CD127 -/LOW細胞 ）がソートされている成功した抑制アッセイを示しています。規制/抑制能力を獲得した5日間の培養物からのサブセットのみですが、図4は、Tregの誘導を示しています。ナイーブT細胞プール（上パネル）およびメモリーT細胞プール（下パネル）から、標準iTreg培地中で5日間培養した後。初期の細胞のCFSE染色はどちらナイーブ（右上パネル）やメモリーT細胞（右下のパネル）だけ細胞分裂のいくつかのラウンド後にiTregs（最高Foxp3を発現する細胞）に分化することを示している。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3738/3738fig1.jpg" /> 図1実験手順の概略図。 PBMCをART細胞- + CD25 CD4の磁気負の選択の前に勾配遠心分離を介してヒト末梢血から分離電子。文化の中で五から六日後、細胞は、FACSを受け、抑制活性を測定するために異種のCFSE標識した標的細胞と共培養されています。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3738/3738fig2.jpg" /> 図2精製ヒト初代CD4 + CD25 - T細胞は培地をiTregで培養されています。細胞のアリコートは、CD45RAは、Foxp3、CTLA-4とCD25マーカーの進行状況を監視するためだけに分離（0日）後1日目、3、細胞培養の5で収集されます。 iTregプロファイルは、CD45RAに対応する-は、Foxp3 こんにちは 、CTLA-4 HiとCD25 ハイ （イングラフウィンドウで強調表示されている）。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3738/3738fig3.jpg" /> 図3精製CD4 + CFSEラbeled細胞（1×10 5 /ウェル）をソートナイーブ、メモリーまたはiTreg細胞（3×10 4 /ウェル）の存在下で抑制インスペクタビーズをTreg細胞で培養されています。 5日後、細胞を採取し、染色した細胞のCFSEプロファイルはフローサイトメトリーによって分析されます。 iTreg細胞の存在は完全にCD4細胞の増殖+ T細胞を消失させる。数字が除算を受けたCFSEで標識した細胞の割合を示している。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3738/3738fig4.jpg" /> 図は4つの精製したヒト初代ナイーブ（CD4 + CD25 - CD45RA +）とメモリ（CD4 + CD25 - CD45RO +）T細胞は、培地をiTregにおけるCFSE培養で染色されています。 5日後、細胞を表現型と細胞分裂率が推定されている。 図2に示すように、両方のサブセットに区別iTregサブセットはに対応していCD45RA - CD25 こんにちは FoxP3のHiとCTLA-4 のHi（後者の二つ示されていません）。比較CFSE染色プロファイルは、5日間の培養中で最も増殖細胞としてiTregs（ここでは最高に発現FoxP3のT細胞など）を識別します。

<ol><li>Powrie, F., Correa-Oliveira, R., Mauze, S., Coffman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+interactions+between+CD45RBhigh+and+CD45RBlow+CD4%2B+T+cells+are+important+for+the+balance+between+protective+and+pathogenic+cell-mediated+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Regulatory interactions between CD45RBhigh and CD45RBlow CD4+ T cells are important for the balance between protective and pathogenic cell-mediated immunity.</a> The Journal of Experimental Medicine. 179, 589-600 (1994).</li>
<li>Tarbell, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell-expanded%2C+islet-specific+CD4%2B+CD25%2B+CD62L%2B+regulatory+T+cells+restore+normoglycemia+in+diabetic+NOD+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell-expanded, islet-specific CD4+ CD25+ CD62L+ regulatory T cells restore normoglycemia in diabetic NOD mice.</a> The Journal of Experimental Medicine. 204, 191-201 (2007).</li>
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<li>Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+regulatory+T+cell+development+by+the+transcription+factor+Foxp3%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3.</a> Science (New York, N.Y.). 299, 1057-1061 (2003).</li>
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<li>Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunologic+Self-Tolerance+Maintained+by+Cd25%2BCd4%2BRegulatory+T+Cells+Constitutively+Expressing+Cytotoxic+T+Lymphocyte-Associated+Antigen+4%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immunologic Self-Tolerance Maintained by Cd25+Cd4+Regulatory T Cells Constitutively Expressing Cytotoxic T Lymphocyte-Associated Antigen 4.</a> The Journal of Experimental Medicine. 192, 303-310 (2000).</li>
<li>Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD127+expression+inversely+correlates+with+FoxP3+and+suppressive+function+of+human+CD4%2B+T+reg+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+ T reg cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 203, 1701-1711 (2006).</li>
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<li>Reneer, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripherally+induced+human+Regulatory+T+cells+uncouple+Kv1.3+activation+from+TCR-associated+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Peripherally induced human Regulatory T cells uncouple Kv1.3 activation from TCR-associated signaling.</a> European Journal of Immunology. , (2011).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

Tregの転送が自己免疫移植片拒絶反応および他の免疫または炎症媒介性疾患との闘いで膨大な治療可能性を秘めていますが、その効率的な生成と安定した保守のための方法はまだ開発されていない。ヒトT細胞を循環させる唯一の百分の1から5は、Tregsのであるので、その制御の拡大と分化は、クリニックにTregの実装の主要な抑止力としては、この不足を克服しています。我々はTGN1412試験13から学んだように一方で、それは深く、任意の治療計画を実装する前に、オーケストレーション、ヒトT細胞の運命決定、分子イベントを理解することが科学的かつ倫理的に必要です。分化をiTregのこの方法では、ナイーブ、メモリー、エフェクターT細胞とiTregs結果の集団は、遺伝子発現または単一のヒト末梢血ドナーから派生した細胞の集団の間の機能の比較を容易にします。私たちの手の中に、ソートされた細胞がされている機能的に測定するイオンチャネルの使用14にクランプキーシグナル伝達事象を調べるためにウェスタンブロットでは、遺伝的変化を測定するマイクロアレイと定量RT-PCR分析では、パッチで比較。 <p class="jove_...

<table border="1"><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> Lymphoprep </td><td>軸シールド</td><td> 1114547 </td><td>室温で保つ</td></tr><tr><td>冷蔵ベンチトップ遠心機</td><td>エッペンドルフ</td><td> 5810R </td><td></td></tr><tr><td>明るいライン血球</td><td> Hausser科学</td><td> 3110 </td><td></td></tr><tr><td> EasySepヒトCD4 + T細胞の濃縮キット</td><td>セル技術を幹</td><td> 19052 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep人間の記憶CD4 + T細胞の濃縮キット</td><td>セル技術を幹</td><td> 19157 </td><td></td></tr><tr><td> EasySepヒトナイーブCD4 + T細胞の濃縮キット</td><td>セル技術を幹</td><td> 19155 </td><td></td></tr><tr><td>ビッグイージーEasySepマグネット</td><td>セル技術を幹</td><td> 18001 </td><td>シルバー</td></tr><tr><td> 5 mLの丸底ポリスチレンチューブ</td><td> BDファルコン</td><td> 352008 </td><td></td></tr><tr><td> 15 mLのポリプロピレン遠心チューブ</td><td> VWR </td><td> 89004-368 </td><td></td></tr><tr><td> 14 mLのポリプロピレン丸底チューブ</td><td> BDファルコン</td><td> 352059 </td><td></td></tr><tr><td> 50 mLのポリプロピレン遠心チューブ</td><td> VWR </td><td> 89004-364 </td><td></td></tr><tr><td>ヒト抗CD3抗体</td><td>バイオXセル</td><td> BE0001-2 </td><td>クローン：OKT3 </td></tr><tr><td> 24ウェル細胞ポリスチレン培養プレート</td><td> BDファルコン</td><td> 353047 </td><td></td></tr><tr><td> 96ウェル丸底組織培養プレート</td><td>グルニエバイオOne </td><td> 650180 </td><td></td></tr><tr><td>グルタミン-IおよびHEPES緩衝液を含むRPMI1640 </td><td>ギブコ</td><td> 72400 </td><td></td></tr> &lt;TR&gt; <td>ウシ胎児血清（FBS） </td><td>ギブコ</td><td> 16000 </td><td></td></tr><tr><td> β-メルカプトエタノール</td><td>シグマ</td><td> M7522 </td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトTGF-β1 </td><td>ベイバイオサイエンス</td><td> 14-8348-62 </td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトIL-2 </td><td>ベイバイオサイエンス</td><td> 14-8029-63 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン（BSA） </td><td> MPバイオメディカル株式会社</td><td> 810531 </td><td></td></tr><tr><td> 0.5 M EDTA </td><td> Amresco </td><td> E177 </td><td></td></tr><tr><td>マウス抗ヒトCD25-PE </td><td>ミルテニーバイオテク</td><td> 130-091-024 </td><td>クローン：4E3 </td></tr><tr><td>マウス抗ヒトCD45RA-PE-Cy5を</td><td>ベイバイオサイエンス</td><td> 15-0458-42 </td><td>クローン：HI100 </td></tr><tr><td>マウス抗ヒトCD127-APC </td><td>ミルテニーバイオテク</td><td> 130-094-890 </td><td>クローン：MB15-18C9 </td></tr><tr><td> DNアーゼII </td><td> MPバイオメディカル株式会社</td><td> 190370 </td><td></td></tr><tr><td> MoFloフローサイトメーター</td><td>ベックマン·コールター</td><td></td><td></td></tr><tr><td> FlowJoソフトウェア</td><td>ツリースター株式会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>セルクエストProソフトウェア</td><td> BDバイオサイエンス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>新生仔ウシ血清</td><td>ギブコ</td><td> 16010 </td><td></td></tr><tr><td> L-グルタミン酸</td><td>ギブコ</td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> AIM-V </td><td>ギブコ</td><td> 0870112 </td><td></td></tr><tr><td> CellTrace CFSE細胞増殖キット</td><td>インビトロジェン</td><td> C34554 </td><td></td></tr><tr><td> Treg細胞の抑制インスペクタビーズ</td><td>ミルテニーバイオテク</td><td> 130-092-909 </td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン - ストレプトマイシン</td><td>ギブコ</td><td> 15140 </td><td></td></tr><tr><td> 40μmのナイロン細胞株えー</td><td> BDファルコン</td><td> 352340 </td><td></td></tr></table>

初代ヒトナイーブおよびメモリーt細胞から誘導した調節性t細胞の生成

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

免疫CD4 +制御性T細胞（Tregの）の開発と保守はで、人体の自己と共生抗原の膨大な量の免疫学的恒常性のままにするために必要な末梢性寛容に貢献しています。 Tregsのと炎症、従来のT細胞のバランスの乱れは、免疫病理や癌になる可能性があります。 Tregの治療注入大腸炎1、I型糖尿病2、関節リウマチ、移植片対宿主病は、ヒト対マウスTregの生物学5の4いくつかの根本的な違いのマウスモデルに有効であることが示されているが、これまでの臨床使用を排除しています。十分な数、純度、安定性と治療Tregのホーミング特異性の欠如は、彼らのex vivoでの拡張6のための条件を最適化する上で人間のTregの開発のダイナミックなプラットフォームを必要とした。 ここでは、Din vitroでの細胞培養と蛍光活性化末梢血単核細胞、CD4の磁気選択+ T細胞の分離、4つの段階に分けることができ、単一のヒト末梢血ドナーから誘導Tregsの（iTregs）の分化方法を傍接させるT細胞サブセットの細胞選別（FACS）。 Tregの署名の転写因子のフォークヘッドボックスのP3（Foxp3は）人間の7の活性化誘導転写因子および他のユニークなマーカーであるため存在しますが、マーカーの組み合わせパネルは抑制活性を有するT細胞を同定するために使用する必要があります。文化の中で6日後、私たちのシステムの細胞がナイーブT細胞は、CD25とCD45RAのそれらの相対的発現に基づいてメモリーT細胞またはiTregsに画定することができます。メモリなどとナイーブT細胞はCD45RA +およびCD45RO +サブセットができますbに初期のT細胞集団の事前選別は、別の報告偏光の要件と塑性挙動8を持っているeは、これらの不一致を調べるために使用されます。他者との一貫性のある、私たちのCD25 こんにちは CD45RA - FoxP3の9のiTregs急行高レベル、GITRおよびCTLA-4 11およびCD127 12の低レベル。各集団のFACSに続いて、得られた細胞は、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE）で標識したT細胞自家の増殖を抑制するための相対的能力を評価し、抑制アッセイで使用することができます。

我々は、単一のヒトの血液ドナーからの規制は、メモリとナイーブT細胞を生成する方法を説明します。偏Tregsのは、その後もここで詳述抑制アッセイを含む遺伝的均一性を持つ遺伝子や機能のさまざまなアプリケーション内の他のサブセットと比較することができます。

初代ヒトナイーブおよびメモリーT細胞から誘導した調節性T細胞の生成

免疫抑制性のCD4+調節性T細胞（Treg）の発達と維持は、…に留まるために必要な末梢性寛容に寄与している。

この手順の全般的な目的は、一次T細胞からヒト制御性T細胞を生成することです。まず、ヒト血液サンプルから末梢血単核細胞を単離します。次に、PBMC混合液からCD4陽性T細胞を精製し、培養します。6日後、フローサイトメーターを用いて細胞をナイーブT細胞、メモリーT細胞、エフェクターT細胞、および誘導調節性T細胞のサブセットに分画し、サプレッサーアッセイを実施します。これらの細胞を用いて、本手法によってサプレッサー活性を持つヒト調節性T細胞が生成されることを実証します。マウス細胞を用いた手法に対する本手法の主な利点は、ヒトを用いた手法であるため生理学的および臨床的な関連性がより高く、単一のドナー内でtregsを他の細胞集団と比較することが可能である点にあります。個体内のばらつきを排除します。この手法により、従来型T細胞から調節性T細胞への移行を制御するイベントは何か、あるいは調節性T細胞に特異的なシグナル伝達および転写イベントは何かといった、調節性細胞分野における重要な疑問に答えることができます。調節性T細胞が免疫恒常性において極めて重要な役割を担っているため、この技術の意義は、自己免疫疾患、炎症性疾患、およびがんの治療へと広がります。一般的に、使用される手法が多岐にわたり、一部のステップにおいて最適な細胞培養条件の許容範囲が非常に狭いため、この技術に慣れていない個人にとっては困難を伴います。この手法は、Tregの発達に関する知見を提供できるだけでなく、T細胞系譜分化の可塑性のモニタリングや、T細胞ミリューがTregの発達を誘導または抑制する能力の解析にも利用可能です。Tregの発達に関する手順のデモンストレーションを行うのは、Andrea McCoolと、大学院生のMarie Catherine Ranier、Gavin Ellis、Catalina Vale Ortegaです。まず、40～60 mLのBバフィーコートからヒト末梢血単核細胞を分離します。バフィーコートを希釈するため、150 mLの滅菌PBSを含むオートクレーブ済み500 mLガラス瓶に転送します。その後、さらに滅菌PBSを加え、最終容量を250 mLにします。次に、10本の50 mLコニカルチューブに、それぞれ20 mLのLymphoPrep溶液を満たします。次に、希釈したバフィーコート25 millilitersを、Lympho prep溶液の上に静かに重層させます。この際、Lympho prep溶液を乱さないように注意してください。チューブを室温、500 times Gで30分間遠心分離します。リンパ球画分を乱さないよう、遠心分離機のブレーキを必ずオフにしてください。遠心後、PBM CSはリンパ球調製層と血漿培地層の界面に位置し、回収可能な状態になります。PBMCを含むバフィーコート層を約1 mLの血漿培地が覆うまで、上澄みの血漿培地を吸引して除去します。10 mLピペットを使用して、PBMCを新しい50 mLチューブに移します。細胞をPBSで2回洗浄した後、冷たいRPMI 50 mLで再懸濁し、血球計数計を用いて細胞数をカウントします。濃度を決定した後、通常、8 × 10⁸から1 × 10⁹個のpBMCが回収されます。pBMCを、2% FBSおよび1 mM EDTAを含むPBS中で、最終濃度5 × 10⁷/mLとなるように再懸濁します。その後、細胞を新しい14 mLポリプロピレン製ラウンドボトムチューブに移します。次に、EAsキットを用いて、目的の細胞をネガティブセレクションします。キットに付属しているT細胞濃縮用カクテルには、一方に抗デキストリン抗体を、もう一方に不要な細胞表面抗原に対する抗体を持つテトラマー抗体複合体が含まれています。このカクテルを細胞に添加すると、テトラマー抗体複合体が不要な細胞を結合させます。次にデキストランコーティング磁性粒子を添加し、これを四量体抗体複合体に結合させることで、不要な細胞を磁性粒子に連結させます。その後、磁石を用いて不要な細胞を目的の細胞から分離し、CD4陽性T細胞を単離するために回収します。1 × 10⁸から4.25 × 10⁸個のPBMCを15 mLコニカルチューブに分注します。次に、PBMC 1 mLあたり50 µLのヒトCD4陽性T細胞濃縮用抗体カクテルを添加します。室温で10分間混合し、インキュベートします。磁性粒子を混合し、溶液全体に均一に分散させます。pbmc 1 mLあたり100 µLの磁性粒子を添加します。ピペッティングで2〜3回穏やかに混ぜた後、室温で10分間インキュベートします。FBSとEDTAを含むPBSを加え、1本あたりの容量を10 millilitersにし、ピペッティングで2〜3回穏やかに混ぜます。次に、キャップを外したチューブをceptマグネットに入れ、チューブを入れたまま5分間静置します。回収率を高めるため、目的の細胞を分離して新しい50 milliliterチューブに液体を移します。チューブにPBS-FBS-EDTAを追加して混合し、サンプルを再びマグネットに配置して、この工程を繰り返します。細胞の分離が完了したら、細胞数をカウントし、室温で500 ×gで5分間遠心分離します。細胞ペレットを分極化培地で再懸濁し、濃度を2 × 10⁶ cells/mLにします。その後、ビデオの次のセクションに記載されている通り、調節性T細胞を誘導するための培養に進みます。anti-CD3コート済みの6ウェル組織培養プレートを37 °Cで予熱しておきます。プレートが温まったら、ウェルからPBSを吸引します。次に、CD four陽性濃縮細胞懸濁液を各ウェルに4 mLずつ加えます。培地の蒸発を抑えるため、空のウェルにはPBSを満たします。その後、3日間インキュベートします。プレートを500 ×gで5分間遠心分離します。次に、プレート底面の細胞を乱さないように培地を半分取り除き、新しい培地と交換してさらに2〜3日間インキュベートします。これで細胞を、次節で述べるフローサイトメトリー（FACS）でソートするか、後述する抑制アッセイのターゲット細胞として使用することができます。2〜3日経過後、細胞およびフローサイトメトリー用の適切なコンペンセーションコントロールを調製します。誘導された調節性ナイーブT細胞およびメモリーT細胞を分離するためのソートでは、付属文書に従い、ソート対象の細胞をanti-CD25 PE、anti-CD45RA PE-Cy5、およびanti-CD127 APCで染色します。また、FACS解析用に、適切なコンペンセーションコントロールに抗体を必ず添加してください。染色後、細胞を洗浄バッファーを用いて1×10⁷ cells/mLの濃度で再懸濁し、1.5 µL/mLのDNase Iを添加して、40 µmのナイロンセルストレーナーでろ過します。細胞を5 mLのラウンドボトムポリプロピレンチューブに移し、1本あたり3.5 mLを超えないようにしてください。補正コントロール細胞を300 µLの洗浄バッファーで再懸濁します。フローサイトメーターの補正を行い、PE A PCおよびPE sci-fiフィルターによるクロス検出を最小限に抑えます。ソート後の制御性T細胞がT細胞の増殖を抑制できるか評価するため、tregs、ナイーブT細胞、およびメモリーT細胞を、1 mLの新生仔牛血清を含む5 mLポリスチレン製ラウンドボトムチューブにソートするようにゲートを設定します。ここでは抑制アッセイを行います。ソートされていないCD4陽性濃縮細胞をターゲット細胞として使用します。これらの細胞には、CD25陽性誘導調節性T細胞が含まれていない必要があります。まず、細胞トレースキットを用い、メーカーの指示に従ってターゲット細胞をCFSEでラベルします。その際、細胞1mLあたり2µLではなく、5Mストック溶液を1µL使用してください。次に、マイクロ遠心チューブ内で、総細胞数と同数のtreg抑制検査ビーズを迅速遠心によりペレット化します。ビーズをRPMIで1回洗浄し、遠心後に再度ペレット化してください。RPMIを吸引し、96ウェル丸底組織培養プレートの各ウェルに、適切な濃度の抑制アッセイ培地8 µLで再懸濁します。CFSE染色した標的細胞を8 µL添加します。ビーズと分極ソートされた細胞を確認し、新鮮な抑制アッセイ培地で最終容量まで調整します。200 µLの培地を用います。すべての条件は3連でプレートに播種します。コントロールを準備するには、100 µLのCFSE染色細胞、8 µLのインスペクタービーズ、および1×10⁵個の新鮮な未染色細胞を、92 µLのサプレッサーアッセイ培地に加えます。最初の2つのコントロールウェルに、1ウェルあたりの培地を分注します。次に、CFSE染色細胞100 µLと、92 µLのサプレッサーアッセイ培地に懸濁した未染色の新鮮な細胞1 × 10⁵個を添加します。続く2つのコントロールウェルに、1ウェルあたりの培地を分注します。プレートをアルミホイルで覆い、暗所としてインキュベーター内に5日間静置します。ピペッティングによって各ウェルから細胞を回収し、5 mLのポリスチレン製ラウンドボトムチューブに入れます。細胞を4 °Cで500 ×g、5分間遠心分離します。培地を吸引し、300 µLの冷たいFox washing bufferで再懸濁します。誘導調節性T細胞分化の進行をモニターするため、精製したヒト一次CD4陽性CD25陰性T細胞をiTreg培地で培養し、0、1、3、5日目に分注して回収し、フローサイトメトリーによりCD45RA、FoxP3、CTLA4、およびCD25マーカーの発現を解析しました。これらの疑似カラードットプロットに見られるように、5日間のタイムコースにおいて、TGF-βおよびIL-2存在下でのCD3架橋に応答して細胞がin vitroで増殖および分化し、最終的にCD45RA陰性、FoxP3高発現、CTLA4高発現、およびCD25高発現のプロファイルに至ります。これは、従来のT細胞前駆細胞から誘導tregが分化したことを示しています。次に、生成されたtregのT細胞増殖抑制能を相対的に評価します。CFSEで標識した細胞を、ソートしたナイーブメモリーT細胞およびiTreg細胞と共に、Tregサプレッションインスペクタービーズ存在下で培養し、その結果をこのヒストグラムに示します。CD25高発現、CD45RA陰性、CD127低発現の誘導性制御性T細胞のみが、5日間の培養後に抑制能を獲得したサブセットとなっています。これは、本システムで生成された細胞が、表現型および機能の両面において抑制性調節性T細胞であり、FOX P3およびCD25を一過性に発現するものの免疫抑制能を持たない活性化従来型T細胞ではないことを示しています。誘導調節性T細胞の存在により、CD4陽性T細胞の増殖は完全に消失します。数値は、T細胞精製サブセットにおいても同様の結果となることを確認するために、分裂したCFSE標識細胞の割合を示しています。ヒト末梢血由来のナイーブT細胞およびメモリーT細胞をCFSEで染色し、Treg培地で培養した。5日後、細胞のフェノタイプ解析を行い、図に示すように細胞分裂率を算出した。ここでは、ナイーブT細胞プールおよびメモリーT細胞プールから、5日間の培養を経てTregを誘導した。標準的なIT reg培地において、CFSEで染色しました。初期細胞の染色結果から、ナイーブT細胞およびメモリーT細胞のいずれも、数回の細胞分裂を経て初めて制御性T細胞へと分化することが示されています。CFSE染色のプロファイルを比較すると、5日間の培養期間において、誘導制御性T細胞が最も増殖能の高い細胞であることが分かります。このビデオを視聴することで、単一のドナーから得られたナイーブT細胞、メモリーT細胞、または全T細胞の集団から、誘導Tregを得る方法について十分に理解できるはずです。この手順を試みる際は、以下の点に留意してください。全工程を通じて無菌操作を維持し、本手順に従ってCFSEが光にさらされないようにすることが重要です。細胞分裂速度の違い、特定のサイトカイン合成、および調節性T細胞と従来型T細胞の間でのイオンチャネルの使用状況といった他の疑問を明らかにするために、機能解析などの他の手法を、開発後に実施することができます。この手法は、免疫学分野の研究者が、ヒト患者における自己免疫疾患やその他のtreg関連の病理を探索する道を開きました。ヒト血液の取り扱いは極めて危険であるため、本手順の実施にあたっては、適切な血液銀行での検査や適切な廃棄処理などの予防措置を必ず講じてください。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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