Name: プログレッシブ比マウスの嗜好性は高脂肪·高砂糖食の応答 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: 学ぶ マウスを用いたプログレッシブ比オペラント条件付け課題による高脂肪・高砂糖食の報酬効果評価法。摂餌制限とレバー押し訓練を含み、肥満研究における食行動の神経生物学的基盤解明に有用です。

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このプロジェクトは、 自然科学と工学研究カナダの評議会（355881）、およびイノベーションのためのカナダの財団からの補助金によって支えられている。

*ほとんどの重要なステップ。 1。機器とソフトウェア<ol><li>トレーニングとテストは、（ 表1参照）、食品容器の両側に位置する2つの超軽量、引き込みレバー1を搭載したマウスのオペラントチャンバーで行われる。刺激光は各レバーの上にあり、ケージの上部にある家の光があります。ペレットディスペンサは、チャンバの外側に位置しています。各チャンバは、換気扇の音が減衰キュービクル内に収納されています。チェンバースは、 &quot;スマート·コントロール&quot;インターフェイスを経由して内閣MedPC IVソフトウェアを搭載したPCのコンピュータに接続されています。 </li></ol> 注：超軽量レバーが利用できない場合、それが鼻突く、マウス研究のためのオペラント応答として使用することをお勧めします。ただし、利用可能な両方のオプションで我々は、鼻突く応答ができるB与えられた動機の方が信頼性の尺度としての超軽量レバーの選択を示唆しているeは、探索スニッフィングによって引き起こされる。 <ol start="2"><li>オペラントのタスクを実行するために使用されるMedPCプログラムは、ユーザーが提供するプログラミングマニュアルの助けを借りて学ぶことができますMedstate表記のコードで書かれています。プログラミングは、既存のコードを変更したり、ユニークな実験パラメータを生成するユーザのための柔軟性を提供します。特定のコードは、地中海アソシエイツ&quot;Medstate表記リポジトリ&quot;から無料で入手できます<a href="http://www.mednr.com" target="_blank">http://www.mednr.com</a> 。追加のコードは、地中海Associatesから購入することができます。 </li></ol> 2。マウスの馴化と食事制限<ol><li>到着マウスがある時には逆に12時間の明/暗サイクルに慣れるために、少なくとも10日間グループに収容し、標準餌と水を自由に摂取へのアクセスを備えている。我々の場合には、チャールズ·リバー（セント定数、QC）から購入した大人のC57BL / 6マウスを使用しています。すべてのマウス操作や行動実験は明暗サイクルの間に実行されています。すべてのプロ動物の使用を含むceduresはCRCHUMアニマル·ケア委員会によって承認された。 </li><li>彼らはレバーを押して応答するの買収を容易にするために、90から95パーセントの自由摂食、体重に到達するまで、マウスは、その後単独で、収容されていると食べ物が制限さ（日常の食物摂取量の70％）。マウスは、セッションの終了後、ホームケージ内の食品の日常クォータを提供されていました。 5〜10％の重量損失に達すると、割り当てられた毎日の食事は、訓練期間の残りのためのより低い体重を安定させるために調整されます。一度マウス（下記参照）彼らは不断給餌スケジュールに戻され、取得基準を達成している。マウスは約3-4日で失われた体重を取り戻す。 </li><li>マウスは、最初のトレーニングセッションに先立って3日間連続して試験室で処理されます。 10-15（HFHS）高脂肪、高糖ペレットはオペラントperformanで食品新しいもの嫌いの潜在的な影響を防ぐために、ホームケージに配置されているトレーニングの開始前に日CE。我々は、20 mgのHFHS、（バイオServの、フレンチ、NJ）脂肪として48.9％キロカロリーを含む埃、精密食品ペレットを（も可能14 mg）を使用しています。 </li></ol> 3。オペラントトレーニング<ol><li>マウスは、最初に単一のレバーを押してコンセントに食料ペレットの配信を引き出すことにより固定比率（FR）-1強化スケジュールでレバーを押すように訓練されています。唯一のレバーが &quot;アクティブ&quot;として指定されている（食品の報酬の配信をトリガ）および右と左レバーの割り当ては、マウスの間で相殺されています。追加のレバー押しは食べ物ペレットの配信にはなりませんその間、それは、FR1スケジュール（FR1/TO-5）に少なくとも5秒のタイムアウト（TO）を追加することが重要です。これまでの期間は、実験者はそれが彼らのマウスモデルのために必要であると感じる場合は、食品ペレットを消費するためにマウスのための時間は、しかしより長いタイムアウトを使用することができます。各FRのトレーニングセッションは1時間以上が50ペレットが配信されています続きます。 </li><li> *習得条件：&lt;/ strong&gt;の応答食品維持オペラントの買収を決定するために使用される基準が含まれています：（1）アクティブな応答と報酬の最小数を獲得し、（2）アクティブおよび非アクティブレバーの間に差別の測定、（3）の間でセッションパフォーマンスの安定性。マウスアクティブ対アクティブでないレバーのために≥3:1の差別を展示し、3つの連続したセッションで、セッションごと≥20の報酬を得ることは、取得基準10を達成するために考えられている。我々は、C57BL6マウスの大半（〜75％）は研修の約7〜10日、買収基準を達成するために必要なことを観察した。この時点で買収の基準に達していないマウスは、追加の5〜7日のためにさらなる訓練を受ける。余分な第五研修日までには進展がない場合我々はテスト（例〜5％）からマウスを除外します。それは障害オペラント買収は、特定の薬理学的および遺伝的介入の結果かもしれないので、文書化されるべきであることに留意することが重要です。&lt;/ LI&gt; <li> ≥20ペレットを得るための3つの連続した​​セッションに続いて、スケジュールは5つのアクティブなレバーを押すとは、食品ペレットの配信をトリガーするFR5/TO-5秒に増加されています。 FR5スケジュ​​ールの訓練は3日間続きます。 </li><li> *マウスは、補強の進行比（PR）スケジュールで訓練を受けています。 PRのテスト中に応答比のスケジュールは以下の式を（最も近い整数に丸め）を使用して、リチャードソンとロバーツ（1996）11％として計算することができます。 = [5、E（R * 0.2）] - 5 Rは、食品がすでに獲得した報酬プラス1の数（すなわち、次の補強）に等しいです。 1、2、4、6、9、12、15、20、25、32、40、50、62、77、95のように：このように、食品の報酬を得るために必要な応答の数の順序に従ってください。完了し、最終的な比率は、ブレークポイントです。 </li><li> PRセッションは1時間の最大値を持続します。セッションの終了の任意の10分の期間の結果でレバーを押しに失敗しました。性能報酬の数は少なくとも3日間連続して≤10％で1時間のセッションの逸脱で稼いだ時に補強のPRスケジュールの性能が安定したと見なされます。 </li></ol> 4。プログレッシブ比のテストと検証<ol><li> PRタスクの応答食品維持オペラントを検証するためには、食品の報酬を調節することが知られている、次の操作を応答するブレークポイントを評価することができます。遂行するため、比較的簡単にテストするには、食糧のためのマウスの動機状態を向上させ、それによってブレークポイントを増加させる食品の剥奪である。安定した、ベースラインパフォーマンスが達成されるまで、マウスは、最初の不断給餌期間中のPRタスクでテストする必要があります。最後の &quot;ベースライン&quot;の日食品の翌日は、ホームケージから削除され、マウスは、24時間高速の開始後にPRタスクでテストされています。 </li><li>また、レプチン食欲抑制ホルモンの末梢投与がブレークポイントに逆効果を持っているかどうかを調べしきい値。 （AFパーロー、ナショナルホルモンおよびペプチドプログラム、NIDDK）レプチンは、滅菌したPBSに溶解した。 PRテストは一日にPBSのIP注入後、その後レプチン（5 mg / kg）を次の日の注射後に実施した。レプチンは、PRのテストに1時間前に注入した。ブレークポイントは、対応のあるt-検定（グラフパッドプリズム）を使用して比較した。 </li></ol> 5。代表的な結果補強のPRスケジュールに基づいて応答ブレークポイントを調節する食品の欠乏の能力をテストするとき、我々は図1に示すように大幅にブレークポイントを増やすことを期待しています。この実験では絶食の24時間期間は、それによって食料の欠乏は、食品の報酬効果を増大させることを示唆している自由摂食のベースラインの状態で得られたものと比較して、ブレークポイントで〜3.6倍の増加を生じた。 tに食欲抑制ホルモンのコントラストが、末梢投与レプチン（5 mg / kgで、IP）1時間前estingは、 図2に示すように応答してブレークポイントを減らすようにしてください。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3754/3754fig1.jpg" /> 図1。断食は、食品の報酬効果を向上させます。 24時間は、高速大幅マウス（n = 4）の補強の進行比（PR）のスケジュールでブレークポイントを増加した。平均値±SEM、* P &lt;0.05。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3754/3754fig2.jpg" /> 図2。レプチンは、マウスの食品の報酬を減少させます。末梢レプチン投与（5 mg / kg）をマウス（n = 4）でPRブレークポイントの応答しきい値を減少させた。平均値±SEM、* P &lt;0.05。

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</ol>

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オペラント条件付けの作業は、食品の動機づけ特性の変化を評価するための効果的な手段を提供しています。食品の報酬のためにレバーを押すと現在の記事許可のトレーニングマウスでは、安定的に詳細な実験手順は、補強のPRスケジュールに対応しています。 消費食料の量を測定することは、食物摂取に影響を与えるすべての要因は、食品の報酬効果を調節していないので、努力ベースの応答対策と同じ読み出しを提供していません。たとえば、ラットの周辺2 -デオキシグルコースを投与することにより利用可能なグルコースを枯渇させると、消費自由に利用できる食物の量を増加させるが、食品12のPRタスクでブレークポイントを変更するには失敗します。応答PRブレークポイントは、食品の報酬の質の変化を反映することができます。たとえば、ブレークポイントは、積極的に甘味8を以下の方法で、ショ糖の増加のためにその動機を示すショ糖濃度と相関している</s&gt;アップ。ここで我々は、24時間絶食が実質的にマウスのHFHS食品のPRポイントを増加を示しています。対照的に、我々はレプチン食欲抑制ホルモンの末梢投与が有意にマウスのHFHS食品のためにブレークポイントを減少させることがわかった。これらの知見は、ラットの12月14日の食物剥奪と報酬のしきい値のレプチンの以前に報告されたアクションと一致している。 このプロトコルを使用するときには、応答オペラント食糧維持の取得が大幅に定期的なトレーニング（各1〜2日）でと食事制限療法を実装することによって、マウスの動機状態を増加させることにより強化されている。心に留めておくことが重要であるさらに、マウス（例えば、FR1にFR5）より複雑なスケジュールに移る前に1つの強化スケジュールで応答比較的安定して示すことを確認するには、テスト中に変数のパフォーマンスを最小限に抑えるための鍵となります。これらのステップのアプリケーションにもかかわらず、それはいくつかの変動を得ることが珍しいことではありません特に異なるマウス間で。このような理由から、それは非常に可能であれば対象の変動を越えて削除するには、被験者内（反復測定）の設計を使用することをお勧めします。被験者内のテストは安定した遺伝子改変（すなわち、ノックアウト対対照マウス）を調べることは不可能ですが、これは薬物、病変または急性（例えば、optogenetic）遺伝子操作の影響を調べるために使用することができます。 肥満と肥満関連の病気が関与する分子と神経経路を識別するために緊急性を増加している成長している問題である。証拠を蓄積すると、食物への渇望、増加したカロリー摂取量と体重増加で脳の報酬回路の重要な役割を強調しています。 PRタスクは、食品の報酬効果について、神経生物学的遺伝的または薬理学的操作の影響を測定するための貴重なツールです。

<html><table border="1"><tbody><tr><td> アイテム </td><td> カタログ番号 </td><td> 会社 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>マウスオペラントチャンバー</td><td> ENV-009A </td><td> <a href="http://www.med-associates.com/" target="_blank">MEDアソシエイツ株式会社</a> </td><td> MEDアソシエイツ株式会社 私書箱319 セントオールバンズ、バーモント州05478、 米国 電話：（802）527-2343 </td></tr><tr><td> 8 inputs/16入力スマート コントロール接続パネル</td><td> SG-716B </td><td> <a href="http://www.med-associates.com/" target="_blank">MEDアソシエイツ株式会社</a> </td><td></td></tr><tr><td>リトラクタブル超軽量 マウスレバー</td><td> ENV-312 </td><td> <a href="http://www.med-associates.com/" target="_blank">MEDアソシエイツ株式会社</a> </td><td></td></tr><tr><td>ペレットディスペンサー</td><td> ENV-203 </td><td>MED-associates.com / &quot;ターゲット=&quot; _blank &quot;&gt;医学·アソシエイツ株式会社</td><td></td></tr><tr><td>ハウスライト</td><td> ENV-215 </td><td> <a href="http://www.med-associates.com/" target="_blank">MEDアソシエイツ株式会社</a> </td><td></td></tr><tr><td>刺激光</td><td> ENV-221 </td><td> <a href="http://www.med-associates.com/" target="_blank">MEDアソシエイツ株式会社</a> </td><td></td></tr><tr><td>無塵精密20 MG高脂肪·高糖 ペレット</td><td> F-06649 </td><td>バイオ-SERV </td><td>バイオ-SERV 一8thストリート、スイート1 フレンチ、NJ 08825、アメリカ合衆国 電話：（800）-996-9908 </td></tr></tbody></table> 表1：特定の機器と材料。

プログレッシブ比マウスの嗜好性は高脂肪·高砂糖食の応答

Progressive-ratio Responding for Palatable High-fat and High-sugar Food in Mice

脂肪と砂糖の豊富な食品が大幅に肥満の過剰な食事とエスカレート率に貢献しています。おいしい食品の消費量は、アクション結果の関連付けを強化し、これらの食品を得ることに向け将来の行動を強化する報酬効果を生成することができます。エネルギー密度の高い食品の報酬効果は過食と肥満の発展に深遠な役割を果たしていることが増加する証拠は、食品の報酬1,2を調節する遺伝子は、分子と神経回路を研究するの関心が高まっています。異なる刺激のやりがい影響はこのようなオペラント条件付けタスク3のように、それらを得るために働く意欲を測定することによって調べることができます。食品の報酬を取得尺度と食品を得ることに向けられている自発的な行動反応のオペラントモデル。報酬の強さの一般的に使用される尺度は、プログレッシブ比（PR）補強のスケジュールとして知られているオペラントの手順です。PR tの4,5頼む、被験者はそれぞれの連続した​​報酬をオペラント反応の増加を作成する必要があります。 Hodos（1961）の先駆的な研究では、最後の報酬を得るために行われた応答の数は、報酬の強度4のインデックスとして機能し、ブレークポイントと呼ばれることを実証した。一人で回答率変化を測定するパフォーマンス上の容量の変化から、報酬の強度の変化を分離することはできませんオペラント手続ながら、PRのスケジュールから派生したブレークポイントは、食品の報酬効果の十分検証さの尺度である。 PRタスク（例えば、6-8）ラットにおける虐待や食品の薬物の報酬の影響を評価するために広く使用されますが、マウス9のより少ない程度にしています。遺伝子組み換えマウスと食事誘発性肥満マウスモデルの使用の増加は、マウスの食物報酬の行動措置の要求を高めています。本論文で我々は詳細高脂肪のために（レバー押し）に対応するためにマウスを訓練するために使用される材料と手順を補強のPRスケジュールの高砂糖食のペレット。我々は、ブレークポイントの応答しきい値は、マウスでこの食品オペラントパラダイムの使用を検証することにより、レプチンと食欲抑制ホルモンの末梢投与による急性絶食と減少後に増加を示しています。

プロトコルはプログレッシブ比オペラント条件付けタスクを使用してマウスに高脂肪食品の報酬効果を測定するために用いられる本レポートの詳細。

脂肪分と糖分を多く含む食品は、過食や肥満率の上昇に大きく寄与しています。嗜好性の高い食品の摂取は……

本実験の目的は、漸増比率（プログレッシブレシオ）スケジュールによる強化を用い、食欲に基づくタスクにおいてマウスの訓練およびテストを行うことです。まず、マウスの体重が5～10%安定して減少するまで、摂食量を Ad Libitum 時の60～70%に制限します。次に、食欲に基づくレバー押し行動の習得を促進するため、オートシェイピング法を用いて、固定比率1（FR1）で高脂肪・高糖質の食物報酬を得るためのレバー押し訓練を行います。その後、マウスは固定比率5を含むより複雑な強化スケジュールで餌に反応するように訓練され、最終的に、餌の報酬効果を信頼性高く測定できる漸増比率タスクで訓練されました。次に、漸増比率スケジュールで安定したパフォーマンスを示した後、これらのマウスを12〜24時間絶食させるか、あるいは腹腔内投与によりレプチン製剤を投与し、漸増比率強化スケジュールにおける食欲誘発行動の変化を検証しました。この実験の結果、絶食は食欲誘発行動を増加させる一方で、食欲抑制ホルモンであるleptinの投与は、高脂肪・高糖質の餌報酬に対する食欲誘発行動を減少させることが示されました。オペラント条件付けタスクは、さまざまな刺激や行動の報酬効果および動機付け効果を評価するための有用な手段となります。漸増比率（プログレッシブレシオ）タスクは、薬物乱用や食物などの自然報酬の報酬効果を評価するために広く用いられてきた、検証済みの強化スケジュールです。ラットの研究でより一般的に使用されてきましたが、遺伝子組み換えマウスモデルの構築が進むにつれ、マウスへの漸増比率オペラントタスクの適用がますます重要になっています。特に、肥満研究におけるマウスモデルの利用や、カロリーの高い嗜好性食品による報酬効果が過食や肥満に大きく寄与しているという認識から、マウスにおける食物報酬を測定する必要性が強調されています。ここでは、漸増比率強化スケジュールを用いて、嗜好性の高い高脂肪・高糖質食品を得るためにレバープレスを行うようマウスを訓練およびテストする方法について解説し、考察します。プロトコルを開始する前に、動物を使用するすべての手順が施設動物ケアおよび使用委員会によって承認されていることを確認してください。必要に応じて、明暗サイクルの暗期にテストを行うことを推奨します。マウスを7～10日間、逆転明暗サイクルに馴化させます。この期間中、マウスには標準飼料と水を自由摂取させます。この10日間の馴化期間の後、マウスを個別に飼育し、自由摂取量の60～70%の飼料制限を行い、体重が自由摂取時の90～95%になるまで継続します。これにより、レバープレス反応の習得を促進します。マウスを毎日計量し、体重が5〜10%減少した時点で、トレーニング期間の残りの期間中、低くなった体重を維持するように1日の給餌量を調整します。最初のトレーニングセッションの3日前から、マウスをホームケージに入れたままテスト室に運び、1匹ずつケージから出して2〜3分間ハンドリングします。ハンドリング後、マウスをホームケージに戻します。トレーニング開始の前日まで、3日間連続で室内の環境およびハンドリングに慣れさせます。餌による影響、特にオペラント学習のパフォーマンスに対するネオフォビア（新奇恐怖症）の潜在的な影響を防ぐため、高脂肪・高糖質のペレットを10〜15個、ホームケージ内に配置します。ここでは、脂肪分として49%のkiller cowを含む20 mgの高脂肪・高糖質・低粉塵精密飼料ペレットを使用します。各マウス用オペラントチャンバーは、換気ファンを備えた遮音キュービクル内に設置されています。マウス用オペラントチャンバーには、餌受皿の両側に配置された2本の超軽量格納式レバーが備わっています。各レバーの上方には刺激灯が配置され、ケージの上部にはハウスライトが設置されています。アペラティブディスペンサーはチャンバーの外側に配置されています。チャンバーは、スマートコントロールインターフェースキャビネットを介して、Med PC fourソフトウェアを搭載したPCコンピュータに接続されています。マウスをオペラントチャンバーに導入します。初期のトレーニングパラダイムは固定比率強化スケジュールで構成されており、レバーを1回押すと、レセプタクルにフードペレットが1つ供給されます。1本のレバーのみが有効として指定され、それを押すと報酬として餌が提供されます。右レバーと左レバーの割り当ては、マウス間でカウンターバランスされています。トレーニングにはシェイピングの手順も必要であり、レバー押し行動を促進させるために、粉砕した餌ペレットをレバー上に配置します。この初期トレーニングでは、レバーへの能動的な反応によって食物報酬が提供され、レバー押しから食物提供までの間に遅延はありません。マウスがレバーを5回押すことを学習すると、タイムアウトが開始され、その間はレバーをさらに押してもペレットは提供されません。このタイムアウト期間により、マウスはペレットを消費することができます。必要に応じて、アクティブレバーが押された後のタイムアウト時間を長く設定することができます。これにより、固定比率1回ごとに5秒後にフードペレットが放出されます。タイムアウト訓練セッションは、1時間経過するか、または50個のペレットが提供されるまで継続します。オペラント訓練を7〜10日間継続し、餌で維持されたマウスが、不活性レバーに対する活性レバーの反応比が3:1以上となり、かつ1セッションあたり20回以上の報酬を得るという弁別獲得基準を満たすまで行う。3セッション連続でこの基準を満たした場合に獲得したとみなす。7〜10日の期間内に獲得基準に達しなかったマウスについては、さらに5〜7日間の追加訓練を行う。5回目のトレーニング日までに進展が見られないマウスは、試験から除外します。オペラント学習の障害が、特定の薬理学的または遺伝学的介入の結果である可能性があるため、これを記録しておくことが重要です。20個以上のペレットを3セッション連続で獲得した後、スケジュールをFR 5（5秒）プロトコルに移行し、アクティブレバーを5回押すとフードペレットが提供されるようにします。FR 5 5秒スケジュールでのトレーニングは、反応が安定するまで約3〜5日かかります。その後、マウスを漸増比率（PR）強化スケジュールでトレーニングします。PRテスト中の反応比率は、RichardsonおよびRobertsの手法に従って計算でき、Rは既に獲得した餌の報酬数に1を加えた値となります。したがって、食物報酬を得るために必要な反応数は、1、2、4、6、9、12、15、20、25、32、40、50、62、77、95という順序に従います。最後に完了した比率がブレイクポイントとなります。PRセッションは最大1時間継続しますが、いかなる10分間においてもレバー押しが行われなかった場合は終了となります。これによりセッションが終了します。PR強化スケジュールにおけるパフォーマンスは、1時間のセッションで得られた報酬数が少なくとも3日間連続して20%以内の変動に収まった場合に安定したとみなされます。PRタスクにおける食物維持オペラント反応を検証するため、食物報酬を調節することが知られている操作後のブレークポイント反応を評価します。実施が比較的容易な試験として食物制限があり、これによりマウスの食物に対する動機付け状態が高まり、その結果ブレークポイントが上昇します。まず、安定したベースライン性能が最終ベースライン日の翌日に得られるまで、自由摂食期間中にマウスをPRタスクでテストします。その後、ホームケージから餌を取り除き、絶食開始から12〜24時間後にPRタスクでマウスをテストします。あるいは、ブレイクポイント閾値への逆の効果を調べる場合は、抗ホルモンの末梢投与をテストすることも可能です。レプチンのPRテストは、ある日にPBSを腹腔内投与（IP injection）し、翌日にレプチンを5 mg/kg投与した後に実施します。ここでは、PR試験の1時間前にレプチンを投与しています。絶食は食物の報酬効果を高めます。例えば、24時間の絶食は、マウスにおける漸増比率（progressive ratio）強化スケジュールのブレイクポイントを有意に上昇させました。末梢へのレプチン投与はブレイクポイントの反応閾値を低下させたため、レプチンはマウスにおける食物報酬を減少させます。この手順を行う際は、食物の獲得によるオペラント反応の維持が、定期的なトレーニングや、食事制限レジメンの導入によるマウスの動機付け状態の向上によって著しく促進されることを念頭に置くことが重要です。さらに、より複雑なスケジュールに移行する前に、マウスが1つの強化スケジュールに対して比較的安定した反応を示すことを確認することが、テスト中のパフォーマンスのばらつきを最小限に抑えるための鍵となります。肥満および肥満に関連する疾患は深刻な問題となっており、関与する分子や神経経路を特定することの緊急性が高まっています。漸増比スケジュールは、神経生物学的、遺伝学的、または薬理学的な操作が食物の報酬効果に与える影響を測定するための有用なツールです。

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Research

JoVE Journal

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神経科学

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