Name: の簡略化手法その場切除 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 58 s
Description: 学ぶ角膜および網膜組織の摘出手法。ヒト眼窩球から高品質な組織を損傷なく採取し、移植や研究に活用する簡略化技術を解説。18年の専門知識に基づく信頼性の高い方法です。

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この作品は、Regioneヴェネト州（未公表Sanitaria Finalizzata n.292/2008と未公表Sanitaria Finalizzata 2009年）の助成金によって部分的にサポートされていました。著者らは、人間の眼の地球儀の使用に関する2010分の2009、サマリー·データに博士C. Griffoniに感謝します。

1。角膜の上皮切除における眼のグローブから<ol><li>約15分使用する前に、層流キャビネットのスイッチをオンにします。 70％イソプロピルアルコールを使用して、層流フードをきれいにします。そのような手術帽、マスクなどの個人防護服を着用します。手と前腕をスクラブし、滅菌タオルを使用して乾燥させます。無菌テクニックを使用して滅菌手袋とガウンまたはスリーブを着用してください。 </li><li>無菌的に滅菌器具トレイを配置することにより、滅菌フィールドを設定します。楽器は無菌であることを確認します。滅菌器械パックを開き、すべての汚染を回避し、滅菌フィールドに反転させます。 </li><li>彼らは、使いやすさのための滅菌フィールドの端に隣接しているように目の地球儀を含むボトル（目のjarファイル）と一緒にすべて滅菌材料、楽器（ 表2）を置きます。 </li><li> 表3に示すように、予め調製し保存/記憶媒体でボトルにラベルを付け、配置I-PVP（ポリビニルピロリドンヨウ素）、チオ硫酸ナトリウムと滅菌生理食塩水、PBS（リン酸緩衝生理食塩水）とともに、層流フードの表面上のメートル。 </li><li>彼らは4℃で冷蔵庫内に保存される眼組織およびソリューションは、通常の室温に到達できるように繰り返される地球温暖化/冷却サイクルを避けることができます。ソリューションと、それぞれの瓶の隣に上向きに直面している内側の目の瓶の蓋を保持します。 </li><li>滅菌ピンセットを使って目の瓶から、ガーゼやスポンジを取り外します。眼の地球儀を浄化するために2分間滅菌したI-PVP 0.5％世界を浸す。滅菌フィールドの外側を、滅菌トレイの蓋にある2つの鉗子を挿入します。滅菌ピンセットの別のペアを使用して1分間チオ硫酸ナトリウム0.1％、地球を転送します。同じ鉗子を使用して、滅菌生理食塩水（PBS）を含むボトルに地球儀を転送し、それが作動するまでそれを残す。 tから他の眼球に対して同じ手順を繰り返します。彼と同じドナー。 </li><li>層流フードの下で働く、明らかに角膜から角膜と約5 mmの強膜を残して滅菌ガーゼを（包帯）を使用して、地球を包む。目の電球は、単に十分な圧力を維持する手で開催することができます。組織は、全体の手術中に湿った保たれるべきです。 </li><li>鉗子は、結膜のすべての最終的な遺跡を削除するには、はさみと一緒に使用されています。他の楽器とは別に、上記の操作に使用される楽器を保持します。縁領域から3〜4ミリメートルの強膜切開を行うために外科用メスの刃を使用して、基礎となるブドウ膜組織を穿孔や角膜の正常な湾曲の変形を引き起こすことを避け、360°で切開を拡張します。硝子体の分泌を回避する4小さな隙間を残して4つの大きな切開をカットします。すべての4つのギャップは、他の組織のない除去を確実にしないカットされています。 </li><li>小さな強膜プラークの存在は、切断を阻害する可能性がありますので、試しに確認してください顕微鏡のはさみで強膜切除をlete。この操作は、脈絡膜、網膜と硝子体に損傷を与えることなく実行する必要があります。 </li><li>それは完全であることを確認し切開を点検してください。切開は、角膜との対応の時点における繊毛のボディに正しくcorneo·強膜縁付着を実行されている場合。 </li><li>滅菌野の中心付近に包まれた眼球を下に置く。定常強膜縁とcorneo·強膜ボタンから下方に離れて体脈絡膜毛様体を引っ張って切除に使用される手を保持するために鉗子を用いて角膜の除去を完了します。 </li><li>優しくcorneo-強膜ボタンから任意の残りの癒着を分離します。どちらもクロス角膜の緊張を引き起こすことも、それが前房に戻ってドロップダウンする可能性がありますようにcorneo·強膜の縁を引っ張らない。 </li><li>角膜の内皮細胞密度が低張液を使用して、細胞の死亡率は、トリップを使用してチェックされてチェックされている約1分とセルの青色染色し光学顕微鏡下でカウントし、細胞/ mm 2として測定されます。後は、ペトリ皿の底に直面している必要がありますが前房には、蓋に直面している必要があります。内皮細胞密度は100X倍率下で目的のグリッドを使用して手動でカウントすることができます。イタリアでの移植のための最小受け入れセル数は2200内皮細胞/ mm 2である。 </li><li> 表3に示すように、RT（室温）で保存先に調製した角膜の記憶媒体に角膜の爪を使用してcorneo·強膜の縁を転送します。 </li><li>天然の水晶体のために後部室を調べます。強膜が用意されている場合は、地球からブドウ膜および硝子体液の全ての残基を削除します。慎重に開けて、無菌技術を使用して、それぞれの目の瓶に残りの後部セグメントを返します。新しい楽器を使用して、他の世界のための手順を繰り返します。角膜のウィットを修正しました。H角膜の爪と31で記憶媒体（器官培養）の下で維持℃、 図1aに示すように、摘出した角膜は、角膜移植後や研究に使用することができます。 </li><li>適切な廃棄容器に不必要な材料やバイオ有害廃棄物を廃棄してください。仕事は70％イソプロピルアルコールスプレーを使用して完了したら、作業領域をきれいにします。 </li><li> 、それがその後に輸送することができます - 28日後に角膜は、すべての評価パラメータ[細菌および真菌を使用してBACTEC 9240計測器（ベクトン·ディッキンソン、ミラノ、イタリア）などの形態、細胞数、透明性、厚さ、微生物検査など]を維持した場合は、 表4に示すように輸送培地を使用して病院。角膜は、層流キャビネットの下にメディアを転送するためにストレージから削除し、配置する必要があります。 </li><li>として、貯蔵中に、角膜が移植に必要な、通常のサイズよりも厚みを増し、アイバンクは、厚さを減らすために脱膨潤剤を使用しています。我々輸送培地には通常のサイズに戻す角膜を得るために6％デキストランT500を使用しています。 4から8パーセントデキストランT500を使用することができるものの、6％が私たちのために最善を務めています。これは、すぐに彼らはそれを受信するように角膜を移植する手術のためにそれが容易になります。 </li></ol> 2。角膜を切除後、眼球から網膜の内臓全摘術<ol><li>切除後、角膜は、その形態と内皮細胞密度に基づいて、31のストレージまたは保存媒体に配置されている移植や研究用に選択され℃の眼球の残りは、その後、手術の目的のためにそのような強膜分離などのさらなる使用のために処理研究のための網膜等されてい</li><li>網膜切除する前に、眼球が無傷であると強膜の一部のみ角膜が削除されていることを確認してください。ゼラチン状の硝子体は、アウトを分泌する場合、それは網膜組織を削除することが困難となる。 </li><li>ドナーは、以下の65歳である場合は、強膜です。血清学的検査の後、外科的な目的のために滅菌したPBSの下に保持されます。このケースでは、強膜が切断されていない、唯一の硝子体が削除され、全体の強膜が保持されます。 </li><li>網膜の切除のために、滅菌ピンセットやハサミを使用して、視神経に向かって強膜角膜側から小さなカットや切開で始まります。鉗子を用いて強膜の一部を保持し、ストレート硝子体への損傷を避けるための部分で一部を切断視神経に向かってハサミでカット。 </li><li>彼らは一緒に立ち往生しているように脈絡膜プラークが強膜から分離する必要があります。脈絡膜組織を露出させる全体の強膜を切り取ります。強膜が完全に切断されると、視神経の近くにそれをカットして硝子体の残りと強膜を分離します。 図2aに示すように、脈絡膜で覆われて硝子体の全体のボールが見えるようになります。 </li><li> 2滅菌ピンセットを使用することで、1つでそれをピックアップして穏やかに脈絡膜層を除去鉗子のペアと他でそれを削除します。また、脈絡膜層は、はさみを使用して削除することができますが、それは網膜への損傷を引き起こす可能性があるので、これは理想的には避けるべきである。部分的に脈絡膜層を除去し、除去を容易にするためにそれをカット。 </li><li>脈絡膜層が除去されると、 図2bに示すように、網膜の透明な層が明確に見られます。脈絡膜層は、除去することができたインテリアブルッフの膜を持っていますが、それは肉眼でそれを識別することは困難です。 </li><li>同様に、 図2cに示すように、網膜の層を除去するために2つの鉗子を使用しています。それは視神経の近くに摘出した場合、網膜の高い量を分離することは容易である。 図2dに示すように、目のすべての層は、現在見ることができました。 </li><li>網膜組織が削除されていたら、それは異なる目的のために使用することができるため、保全のために使用される後続の手順および条件に応じて異なる場合があります。例えば、網膜組織は、（前にパラフィンまたはOCT用の組織を埋め込むためのソリューションを固定し、ディスパーゼ/トリプシン（細胞の単離のための）、（RNAまたはDNA抽出のための）RNA安定化試薬（例えば、RNAlater中など）や、溶解緩衝液を含むチューブに配置することができます免疫組織化学）。 </li><li>すべての作業領域をクリアし、70％イソプロピルアルコールスプレーを使用して領域を清掃してください。 </li></ol> 3。代表的な結果 図1aに見られるようにcorneo·強膜の縁は、強膜縁と内皮細胞形態の必要な量で適切に摘出した角膜は、角膜のこの種は、一般的に全層角膜移植に使用されます。摘出した角膜の前方ストロマが不透明の存在と損傷している場合は、角膜内皮角膜移植/後部層状角膜（角膜の一部と内皮細胞）を使用することができる。内皮層が損傷しているか、内皮細胞密度は&lt;2200細胞/ mm 2である場合（これはされている場合、一方アルヤン標準）、角膜が前方表層角膜移植（前方ストロマの一部と上皮）を使用することができる。内皮細胞数が必要なより小さい場合は、角膜は、角膜が完全に破損している場合、それは図1B、3Bおよび3Cに示すように、研究のために使用または廃棄することができ、一方、前部層状角膜移植や研究のために使用することができる。損傷等の患者の寿命の間に、間質やデスメ内皮傷跡に至る前に白内障手術、したがって、それがために光学顕微鏡下にしてスリットランプを持つすべての組織を確認し、することが必要となる物理的な損傷の開発組織を誤っの原因となる細かい傷/ひだ/剥離。角膜は通常、器官培養として2つの異なる条件下で保存されている（約31°C）は、通常のヨーロッパ諸国や低体温の条件で使用されている（約4°C）は、通常、米国で使用されます。それはダムを再生成するのに役立ちます私たちは、器官培養を使用し高齢者の上皮細胞は、高死後時間と再活性化内皮細胞のチェックに、手術を計画するための十分なウィンドウを与え、4週間の保管期間は、等角膜微生物（細菌および真菌）と血清学的検査のための十分な時間を与えるよく7日間の輸送媒体に保存することができます。 強膜は、すべての脈絡膜プラークの穏やかな除去を保証する部分で一部をカットすることができます。 図4に示すように、視神経、脈絡膜や網膜が大幅にカットされたときに硝子体の液体が排泄することができます。組織が切除され次第、RNA解析のために摘出した場合は、網膜をRNAlater中に保存されるべきである。通常°新鮮なエッペンドルフチュー​​ブ（セーフロックチューブ2ml）中のCまでの使用または出荷された乾燥した脈絡膜と網膜の層の1X1 CMが切り出されており、4℃で24時間RNAlater中でそれを維持した後°C、-80の下に保存されます氷。網膜組織を離れて虹彩から視神経の近くに2鉗子を用いて切除しなければならない他の色素の構造体による汚染を避けるために、網膜の取得中にRNAが不安定になるにつれて、すぐに保存するコンテナに転送されるべきか、毛様体縁。 <img src="/files/ftp_upload/3765/3765fig1.jpg" alt="図1" /> 図1は良好で、低品質の角膜の間の比較：1）が正しく切り出さ角膜。このような角膜は通常、4週間器官培養下で維持されます。微生物（BACTEC 9240機器を使用）と形態（細胞死亡率決定のためにトリパンブルーで細胞を染色し、100Xの倍率の光学顕微鏡下で細胞を観察）検査は、病院（ 図3a）にそれを輸送する前に実行されると、b）曲げ角膜、これは最終的には高いデスメひだによる移植片拒絶につながると高内皮細胞の損傷は、細隙灯顕微鏡を用いて検討した。このような角膜は、通常解像度で使用されearchまたは破棄されます。 <img src="/files/ftp_upload/3765/3765fig2.jpg" alt="図2" /> 図2の方法は、網膜組織の正確な切除を確実にするために使用されます。）95ミリメートル湾曲または平滑末端滅菌はさみと0.70ミリメートルの歯滅菌ピンセットによって支配さ100 mmの11X2と24ミリメートルの刃を用いて眼球から強膜の解剖。強膜は、はさみを使用して、視神経に向かってまっすぐに切断鉗子で片側を保持することによって削減されるべきである。脈絡膜層が簡単に見られるだろうと、b）0.70ミリメートルの歯滅菌ピンセットによって支配2 100ミリメートル11X2を使用して、脈絡膜は、基礎となる透明な網膜層を明らかにされ、それを引き裂くことによって削除されます。c）の透過的な網膜の層が近く、非常に慎重に切り出され同じ鉗子を使用して、硝子体液の排泄せずに視神経。鉗子の両方が網膜の各側面を保持しなければならないと組織が穏やかにのstartinを削除する必要があります網膜組織の良い量を取得するために、角膜に向かって視神経の近くにグラム。組織は、異なるサイズにカットし、分析実験のために使用することができること、d）、角膜を除去した後、眼のさまざまな層は、この図に表示することができます。脈絡膜本体は目の他の部分を損傷せずに最初の網膜に続いて削除されます。 <img src="/files/ftp_upload/3765/3765fig3.jpg" alt="図3" /> 図3光学顕微鏡の100倍の倍率で観察し、細胞密度および形態の異なるタイプの比較。）グッド内皮細胞密度（&gt; 2200細胞/ mm 2）、形態（以下多型、低変性症、筋ジストロフィーないと0％移植に適した角膜の死亡率）と、b）悪い内皮細胞密度（約1200から1400細胞/ mm 2）、形態（非常に高い多型とDEGEN約30〜40％の全死亡率に沿ったセルの動作中は）トリパンブルー染色後に観察されています。眼球から角膜を取得中にc）は内皮細胞の一部が原因で内皮細胞シートの剥離に破損している。これは、トリパンブルーで染色したセル範囲の死亡率を観察することによって確認されていること、d）デスメひだは、切除の時点で激しく等の楽器を使用してクロス角膜の緊張を、作成、曲げによって角膜の誤操作により形成されています。図は、角膜の周辺部と光ゾーンの間にある厚さの発達した医原性の襞を示しています。 <img src="/files/ftp_upload/3765/3765fig4.jpg" alt="図4" /> 脈絡膜および網膜組織への図4。損害賠償最終的には角膜を切除しながらでは、硝子体液の排泄につながります。網膜は、それが困難な質の良い組織のWi消費税になって硝子体に関与される汚染をthout。 <img src="/files/ftp_upload/3765/3765table1.jpg" alt="表1に" /> 表1。Fondazioneバンカで2009年と2010年の間に人間の眼の地球儀を使って実行される活動の範囲の概要Occhi（ヴェネツィア、イタリア）グリオ。組織の約60％は、このように科学と医学研究のために（約40％）、眼の地球儀の高い数値を残して、移植のために使用された。 <img src="/files/ftp_upload/3765/3765fig1sup.jpg" alt="補足図1" /> 補足図1人間の目5の解剖学。人間の目の異なる部分は、組織の正確な位置を追跡するために使う、この図に示されています。

<ol><li>Fay, A. Diseases of the visual system. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFay%2C+A+%22Cecil+Medicine%22">Cecil Medicine</a>. Goldman, L., Ausiello, D. , 23rd ed, Saunders Elsevier. Philadelphia, Pa. (2007).</li>
<li>Parekh, M., Megaw, R., Ray-Chaudhuri, A., Ahmad, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patents+in+Limbal+Stem+Cell+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Recent+patents+on+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Patents in Limbal Stem Cell Biology.</a> Recent patents on Regenerative Medicine. 1, 207-212 (2011).</li>
<li>Pharm, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Eye%3A+The+physiology+of+human+perception%5BTitle%5D)+AND+%22Britannica+educational+publishing%22%5BJournal%5D)">The Eye: The physiology of human perception.</a> Britannica educational publishing. 36, 19-27 (2011).</li>
<li>Lang, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLang%2C+G+%22Ophthalmology%3A+A+pocket+textbook+atlas%22">Ophthalmology: A pocket textbook atlas</a>. , 2nd Edition, 115-117 Forthcoming.</li>
<li>Liesbeth, P. els <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+Culture%3A+The+method+of+choice+for+preservation+of+human+donor+corneas%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Organ Culture: The method of choice for preservation of human donor corneas.</a> Br. J. Ophthalmol. 81, 523-525 (1997).</li>
<li>Meyer, J. S., Howden, S. E., Wallace, K. A., Verhoeven, A. D., Wright, L. S., Capowski, E. E., Pinilla, I., Martin, J. M., Tian, S., Stewart, R., Pattnaik, B., Thomson, J., Gamm, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optic+vesicle-like+structures+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+facilitate+a+customized+approach+to+retinal+disease+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Optic vesicle-like structures derived from human pluripotent stem cells facilitate a customized approach to retinal disease treatment.</a> Stem Cells. , (2011).</li>
<li>Trifunovic, D., Karali, M., Camposampiero, D., Ponzin, D., Banfi, S., Marigo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-resolution+RNA+expression+atlas+of+retinitis+pigmentosa+genes+in+human+and+mouse+retinas%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">A high-resolution RNA expression atlas of retinitis pigmentosa genes in human and mouse retinas.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 49, 2330-2336 (2008).</li>
<li>Mora, P., Montanini, L., Ferrari, S. Retina. 30, 1555(2010).</li>
<li>Claybon, A., Bishop, A. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+a+Mouse+Eye+for+a+Whole+Mount+of+the+Retinal+Pigment+Epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium.</a> J. Vis. Exp. (48), e2563(2011).</li>
<li>Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evisceration+of+Mouse+Vitreous+and+Retina+for+Proteomic+Analyses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses.</a> J. Vis. Exp. (50), e2795(2011).</li>
</ol>

著者らは、利害の衝突はありません。

温度変化や誤操作は、網膜組織の整合性が損なわれる可能性があり、一方そのようなデスメ襞の内皮損傷または高数としてマイナー欠陥が角膜の移植失敗につながることができますので、正しい切除と角膜と網膜組織の適切な保全の両方が重要です。本稿の目的は、角膜と網膜の組織が移植や研究目的の使用を危険にさらす可能性が損害の変化を誘発することなく、最適に分離することができる方法を示すことです。最低限必要な細胞密度（&gt; 2200細胞/ mm 2）、そのような細胞の大きさとしてよい形態、構造、角膜の優れた透明性と適切な厚さと一緒に細胞間の境界線や筋ジストロフィーの不在の低変性のために組織が ​​適しています特徴です移植。手術用メスの刃が使用されている場合は大体、または他の楽器が激しく使用されている、それだけで角膜だけでなく、furtを作る硝子体に損傷を与えません。他の組織の彼女の切除が困難（ 図4）。網膜は透明な組織や硝子体の液体がそれにリリースされた場合、これは通常、より複雑な網膜組織の切除を行い識別することは困難である。硝子体を切除した場合は、網膜組織または抽出したRNAの品質は他の眼の部分と汚染...

角膜と網膜の切除のための材料。 <table border="1"><tbody><tr><td> 製品記述 </td><td> 大きさ </td><td> 企業/研究所 </td></tr><tr><td>保護された使い捨てメス</td><td>ブレードサイズ15 </td><td>スワン·モートン</td></tr><tr><td>滅菌包帯</td><td>は5cm x 5cm、8階層、5個</td><td> Artsana </td></tr><tr><td>滅菌済みディスポーザブル医療タオル</td><td> 35 X 50センチメートル</td><td> U.Jet </td></tr><tr><td>滅菌はさみ</td><td>ブレード24ミリメートル/全体の長さ。無愛想な湾曲した95ミリメートル、 </td><td> e.janach </td></tr><tr><td>滅菌ピンセット</td><td>ステンレス鋼-100ミリメートル11 X 2は、0.70ミリメートルの歯によって支配さ</td><td> e.janach </td></tr><tr><td>角膜の爪 - 使い捨て医療機器</td><td></td><td> NIIOS（Hippocratech） </td></tr&gt; <tr><td></td><td> 準備 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> [10倍] 900ミリリットルD / W（蒸留水）100 mlのPBS </td><td> Sigma-Aldrich社</td></tr><tr><td> NA-チオ</td><td> PBS [1X]の1リットルの1 GMのNa-チオ</td><td> Sigma-Aldrich社</td></tr><tr><td> I-PVP </td><td> 1リットルD / Wの5、GM I-PVP </td><td> Sigma-Aldrich社</td></tr></tbody></table> 表2の表では、角膜と網膜の切除、それらがから受信されている会社のために使用される材料について説明します。 記憶媒体のための材料（2000ミリリットル）。 <table border="1"><tbody><tr><td> コンポーネント </td><td> サプライヤー </td><td> カタログ番号 </td><td> 濃度 </td><td> 量 </td></tr><tr><td> MEM（1X）液体</td><td>インビトロジェン</td><td> 32360-034 </td><td></td><td> 1900ミリリットル</td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>インビトロジェン</td><td> 11360-039 </td><td> 1mMの（10ミリリットル/リットル） </td><td> 20ミリリットル</td></tr><tr><td> L-グルタミン酸</td><td>インビトロジェン</td><td> 25030-032 </td><td> 2mMの（10ミリリットル/リットル） </td><td> 20ミリリットル</td></tr><tr><td>抗生物質/抗真菌剤</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> A5955-20mlの</td><td> 10ミリリットル/リットル</td><td> 20ミリリットル</td></tr><tr><td>新生仔ウシ血清</td><td>インビトロジェン</td><td> 26010から74 </td><td> 2％（20ミリリットル/リットル） </td><td> 40ミリリットル</td></tr></tbody></table> 表3。記憶媒体のための材料。 記憶媒体の準備 瓶の上に与えられたとして、特定の濃度を用いてすべての材料を加え、よく混ぜる。それらをフィルタリングする蠕動ポンプの助けを借りて、0.2ミクロンのフィルター（ミリポア、ミラノ、イタリア）の細孔径を使用します。室温でボトルに培地を保持します。 輸送培地（2000 ml）のための材料。 <table border="1"><tbody><tr><td> コンポーネント </td><td> サプライヤー </td><td> カタログ番号 </td><td> 濃度 </td><td> 量 </td></tr><tr><td> MEM（1X）液体</td><td>インビトロジェン</td><td> 32360-034 </td><td></td><td> 1800ミリリットル</td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>インビトロジェン</td><td> 11360-039 </td><td> 1mMの（10ミリリットル/リットル） </td><td> 20ミリリットル</td></tr><tr><td> L-グルタミン酸</td><td>インビトロジェン</td><td> 25030-032 </td><td> 2mMの（10ミリリットル/リットル） </td><td> 20ミリリットル</td></tr><tr><td>新生仔ウシ血清</td><td>インビトロジェン</td><td> 26010から74 </td><td> 2％（20ミリリットル/リットル） </tD&gt; <td> 40ミリリットル</td></tr><tr><td>デキストランT500 </td><td> Pharmacosmos </td><td> 551005004007 </td><td> 6％（60グラム/リットル） </td><td> 120グラム/リットル</td></tr></tbody></table> 表4。輸送媒体のための材料。 輸送培地の調製 MEMの〜1.5リットルのデキストラン6％を追加し、一晩そのままにしておきます。真空ポンプを用いて0.2ミクロンのフィルター（ミリポア、ミラノ、イタリア）を使用して、メディアやフィルターの成分の残りの部分を追加します。室温でボトルに培地を保持します。

の簡略化手法<em&gt;その場</em人間の眼球から角膜と網膜組織の空洞化の&gt;切除

A Simplified Technique for In situ Excision of Cornea and Evisceration of Retinal Tissue from Human Ocular Globe

摘出は世界の残りの部分が邪魔されずに残して死体ドナーから眼球を取得するプロセスです。切除は眼球からそれは別カットし、眼組織、特に角膜の取得を指します。内臓全摘術は、網膜としてここに呼ばれる内臓を除去するプロセスです。眼球、角膜、強膜、硝子体、レンズ、虹彩、網膜、脈絡膜、筋肉など（補遺図1）で構成されています。患者が角膜損傷に苦しんでいるときに、角膜を削除する必要があり、健全なものがkeratoplastic手術で移植しなければなりません。遺伝性疾患または網膜機能の欠陥は、視力を損なう可能性があります。人間の眼の地球儀は、眼組織にそのような目の銀行、人間の角膜または強膜の移植や研究など様々な外科手術に使用することができます。しかし、人間の角膜と網膜切除で利用可能な情報はほとんどおそらく、Lのためにありますヒトの組織にimitedアクセシビリティ。同様の手順を説明する研究のほとんどは、動物モデルで実行されます。研究者達は、​​人間の目の開発、恒常性と機能に関する知識を拡張するために適切に解剖し、よく保存された眼組織の可用性に依存しています。我々は彼らの約40％（ 表1）研究目的のために使用されているのうち眼地球儀の高い金額を受け取るように、我々は消費税に技術を定義し、これらの組織の実験の膨大な量を実行し、定期的にそれらを保存することができます。 角膜は網膜上に光の透過を可能にし、この目的のために、常に透明性の良好な程度を維持する必要があります血管組織である。角膜内に、幹細胞の貯水池である縁領域は、上皮細胞の再建を助け、角膜の透明性と明確性を維持する結膜の異常増殖を制限します。大きさや目<html>それらのいずれかの変化が気を取られ、不明瞭なビジョンにつながるとして、角膜のicknessは、明確なビジョンのために重要である。角膜は5層から成り、内皮細胞）上皮、b）のボーマン層、c）の間質、d）はデスメ膜と、e）。すべての層は、明確なビジョン4,5,6を確保するため適切に機能する必要があります。脈絡膜は、ブルッフの膜でインテリアに囲まれた強膜と網膜の間の中間的なチュニックであり、そして目の血流を担当しています。脈絡膜はまた、網膜5,6の外側の層に温度と供給栄養を調整するのに役立ちます。受光部と非受容部：網膜は眼球（補遺図1）の背面をカバーし、2つの部分から構成され神経組織の層である。網膜は角膜とレンズからの光を受け取るために役立ち、最終的には視神経5,6の助けを借りて脳に伝達化学エネルギーに変換します。 ove_contentは、 &quot;&gt;この論文の目的は、人間の眼の地球儀から角膜と網膜組織の解剖のプロトコルを提供することです。隣接組織との交差汚染を回避し、RNAの完全性を維持するような組織が目的とした研究目的のために不可欠であるとして、基本的に重要である（i）で、再生医療プロジェクトのための幹細胞を単離、及び（iii）影響を受ける/健常者から組織間の組織の違いを評価する（II）、眼組織のトランスクリプトームを特徴づける。本論文で我々は現在、削除するために使用するテクニックについて説明します。角膜、眼球から脈絡膜と網膜組織。ここでは、人間の眼球の解剖と角膜と網膜組織の切除のための詳細なプロトコルを提供しています。付属のビデオは、研究者は、取得のために適切なテクニックを学ぶのに役立ちます定期的に見つけることが困難な貴重なヒト組織の。

本稿では、消費税角膜に単純化した技術を説明し、人間の死体ドナーの眼の世界から網膜組織を骨抜きにする。ここで説明する手法は眼球の他の組織を損なうことなく移植、外科的または研究目的のために使用されて消費税質の良い組織に役立ちます。

眼球摘出（Enucleation）とは、死後ドナーから眼球を取り出すプロセスのことであり、眼球のその他の部分は損なわれないようにします。切除（Excision）とは、...

本日は、献体ドナーのヒト眼球から、角膜および網膜組織を採取するための簡略化された手法を実演します。本年解説するこの手法は、眼球の他の組織を損傷させることなく、移植、手術、または研究目的で使用するための高品質な組織を採取するのに役立ちます。18年の専門的経験と、毎年行われる多数の角膜移植の実績に基づき、私たちは日々新しい技術を開発しスキルを向上させることで、業務の高い水準を維持してきました。これを達成するために、まず角膜を摘出し、続いて網膜を摘出します。角膜は無血管組織であり、網膜への光の透過を可能にするため、常に良好な透明度を維持している必要があります。角膜は、上皮、ボウマン層、実質、デスクメ膜、および内皮の5つの層で構成されています。角膜が損傷した場合、適切なドナー角膜を用いて置換することが可能です。脈絡膜は強膜と網膜の中間に位置する中間層であり、内側はブルース膜で境界づけられ、眼球内の血流を担っています。網膜の除去と同様に、脈絡膜を適切に摘出することが重要です。網膜は、角膜と水晶体から入った光を受け取り、最終的に脳に伝達される化学エネルギーに変換する役割を担っています。視神経は透明で繊細であるため、高品質な組織を得るためには、系統的に摘出する必要があります。層流クリーンベンチのスイッチを入れてください。70%イソプロパノールを用いてラミナーフロークリーンベンチを清掃します。サージカルキャップ、マスク、滅菌手袋、およびアームカバーなどの個人用保護具を着用してください。無菌操作を用いて、滅菌済みのタオルと滅菌済みの器具トレイを配置し、無菌領域を構築します。滅菌器具セットを無菌的に開封し、汚染を避けて滅菌野の上に展開します。すべての滅菌材料と器具を滅菌野内に配置し、眼球が入った眼球保存瓶を滅菌野の端から離れた位置に置きます。利便性を高めるため、あらかじめ準備した保存液のボトルにラベルを貼り、ヨードポリオール、ピロリド、硫酸ナトリウム、および滅菌リン酸緩衝生理食塩水を用意します。滅菌供給済みの容器の外で、4 °Cの冷蔵庫で保存されていた眼組織および溶液を室温に戻します。繰り返し加温または冷却することを避けてください。滅菌鉗子を使用して、眼保存容器からガーゼとスポンジを取り出します。眼球を蓋の上に置き、追加の包帯を取り除きます。視神経とともに眼球を慎重に拾い上げ、滅菌したIPVPに浸します。眼球を滅菌IPVP中で2分間除染します。眼球を滅菌済みのチオ硫酸ナトリウム溶液に移し、1分間置きます。その後、眼球を滅菌済みのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）細胞ライン溶液に移し、操作開始まで保持します。層流クリーンベンチ内で、PBSから眼球を取り出して洗浄し、滅菌野に配置します。ステロイドで眼球を包みますが、角膜と角膜から約5 mmの強膜は覆わないようにしてください。眼球は単に手で保持することができます。滅菌ハサミを用いて適切な圧力を維持しながら、角膜を傷つけないように、結膜の残存組織をすべて除去します。使い捨てのメスを用いて、角膜縁から3～4 mmの位置で強膜切開を行います。次に、下層のぶどう膜組織を穿孔させたり、角膜の正常な曲率を変形させたりしないように注意しながら、切開線を360度に広げます。硝子体の流出を防ぐため、4箇所の小さな隙間を残しつつ、4つの大きな切開を加えます。4か所すべての切開を行い、他の組織が除去されないようにします。小さな強膜プラークが存在すると切開の妨げになる可能性があるため、マイクロサージェリー用鋏を用いて強膜の切除を完全に行います。この操作は、脈絡膜、網膜、および硝子体に損傷を与えないように的に実施する必要があります。切開が完全に行われているか確認します。正しく切開されていれば、角膜強膜リムは角膜に対応する点でのみ毛様体と接着しています。眼球を滅菌したフィルターの中央付近に置きます。滅菌鉗子を用いて、角膜の摘出を完了させます。強膜縁を固定し、眼球の光沢部分から角膜強膜縁を切り出します。角膜強膜ボタンに残っている隣接組織を、慎重に分離してください。角膜強膜縁を牽引して角膜に張力がかかるようにしたり、前房に落下させたりしないように注意してください。低張溶液を用いて角膜の内皮細胞密度を、トリパンブルー染色を用いて約1分間細胞死を確認します。滅菌済みワイヤーガーゼでトリパンブルー染色液を除去し、角膜を滅菌PBSで洗浄します。その後、ショ糖溶液を満たした滅菌ペトリ皿に移します。この溶液は低張環境を形成し、細胞を視覚的に識別するのに役立ちます。その後、光学顕微鏡を用いて100倍の倍率で細胞数をカウントし、1mm²あたりの細胞数として測定します。通常、細胞密度や、細胞間境界、多形性変性、ジストロフィー、細胞死などの形態学的特徴を確認します。角膜の厚さは、切除した角膜の良好な透明度とともに、移植における重要な特徴です。滅菌済み角膜CLOを使用して、角膜を強膜縁に固定します。角膜CLOを曲げ、強膜縁を固定するのに十分な穴の開きを確保し、角膜クローブを用いて角膜強膜縁を、室温で調製し、あらかじめ準備した角膜保存液に移します。その後、4週間の角膜保存期間中、角膜は31 degree SIUsで保存される必要があります。保存媒体は、B 9 2 4 0 装置を用いていくつかの微生物学的検査にかけられます。保存中、角膜は移植に必要な通常のサイズよりも厚くなるため、眼銀行では厚みを減少させるために膨潤剤を使用します。角膜を正常なサイズに戻し、輸送媒体に適合させるために 6%Dextron T 500 が使用されます。網膜摘出に先立ち、RNA-off（RNA app）を用いて滅菌器具を洗浄し、RNaseフリーの環境を構築します。滅菌野を準備し、眼球が損なわれていないこと、および角膜と強膜縁のみが除去されていることを確認してください。硝子体液が流出している場合、網膜組織の除去が困難になります。ドナーが65歳未満の場合、血清学的検査の後、外科的目的のために強膜を70% alcoholで保存します。このような場合、強膜は切除せず、硝子体のみを除去し、網膜切除のために強膜全体を保存します。強膜の角膜側に近い位置に小さな切開を加え、滅菌済みのピンセットと鋏を用いて視神経に向かって切開を進めます。滅菌鉗子で強膜の一部を保持し、硝子体への損傷を避けながら、視神経方向に向かって部分的にハサミで切断します。脈絡膜プラグは強膜と癒着しているため、剥離させてください。強膜全体を切断し、脈絡膜組織を露出させます。どうすればよいでしょうか？強膜を完全に切断したら、視神経付近で切断して強膜を他の組織から分離します。これにより、硝子体を覆う脈絡膜の全層が露出します。2本の滅菌ピンセットを使用して、これらのRNaseフリーの滅菌アプリコチューブに2 mlのRLバッファーを満たします。一方のピンセットで視神経をつかみ、もう一方のピンセットで脈絡膜を除去することで、脈絡膜層を慎重に剥離します。脈絡膜を部分的に剥離し、除去しやすくするために切断します。網膜に損傷を与えないよう注意しながら、脈絡膜層をはさみで切断します。切り出した脈絡膜層をRNA later溶液に入れ、4 °Cで24時間保存します。網膜組織を露出させるために、余分な脈絡膜をすべて取り除きます。脈絡膜層全体が除去されると、透明な網膜層が見えてきます。脈絡膜層には内側にブルッフ膜が存在し、これも除去可能ですが、肉眼で識別するのは困難です。同様に、2本のピンセットを使用して網膜層を取り除きます。視神経の近くで切除すると、多量の網膜を容易に単離できます。これで、眼のすべての層が確認できる状態になります。摘出した網膜をRNAlater溶液に入れ、4 °Cで24時間保存します。作業エリアを70%イソプロパノールで清浄します。トリパンブルーで染色した内皮細胞は、倒立顕微鏡の100倍の倍率で観察できます。通常、1平方ミリメートルあたり200個以上の細胞を持つ適切な角膜が、今後の使用のために保存されます。品質を「可」から「優」まで格付けすることで、比較研究に役立ちます。通常、角膜が移植可能な状態になると、厚さと透明度が記録され、全層角膜移植において適切な角膜が使用されます。細胞死は、青く染色された細胞を観察することで確認し、死細胞の割合（％）で評価します。保存中の全体の細胞死率が2%を超えた場合は、不適切とみなされます。細胞密度が1mm²あたり2200個未満であるか、あるいは細胞死による損傷がある場合、その角膜は前層板層状角膜移植に使用される可能性があります。前眼部の外傷により損傷しており、角膜の内皮細胞密度が良好である場合、その角膜を後層板移植に利用できる可能性があります。器官培養中に角膜の厚みは通常増加します。輸送培地は、正常な形状と構造への回復を助けます。また、器官培養は角膜の再上皮化を促進し、保存期間が長いため、適切なドナー選択に寄与します。微生物学的および血清学的検査についても同様です。これにより、手術の手配に必要な時間を十分に確保でき、死後経過時間が長く、通常では困難な内皮細胞密度や形態の確認が可能になります。したがって、記載された手順に従えば、他の組織に損傷を与えることなく角膜を摘出することができます。移植に適さない角膜は、眼表面疾患の研究のための新しい培地や保存条件の開発、輪部幹細胞の単離、および角膜に対する薬剤の効果の研究などの研究目的に利用することが可能です。網膜については、RNAサンプルの他組織との交差汚染を回避し、極めて重要であるRNAの完全性を維持することができます。研究目的に不可欠なこれらの組織は、眼組織のトランスクリプトームの特性評価、再生医療プロジェクトのための幹細胞の単離、および正常被験者と罹患被験者の組織間の組織学的相違の評価を目的としています。網膜組織を摘出した後、さまざまな目的に使用できるため、その後の保存手順および条件は適宜異なります。例えば、網膜組織は、RNAまたはDNA抽出のためのr natorやthisisバッファーなどのRNA安定化試薬を含むチューブに、あるいは細胞単離のためのdisplacedやトリプシンに浸漬することができます。免疫組織化学染色に向けて、組織をパラフィンまたはOCTで包埋する前の固定処理について説明します。このビデオをご覧いただきありがとうございました。皆様の研究の成功をお祈りいたします。

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の簡略化手法

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