の簡略化手法

本日は、献体ドナーのヒト眼球から、角膜および網膜組織を採取するための簡略化された手法を実演します。本年解説するこの手法は、眼球の他の組織を損傷させることなく、移植、手術、または研究目的で使用するための高品質な組織を採取するのに役立ちます。18年の専門的経験と、毎年行われる多数の角膜移植の実績に基づき、私たちは日々新しい技術を開発しスキルを向上させることで、業務の高い水準を維持してきました。

これを達成するために、まず角膜を摘出し、続いて網膜を摘出します。角膜は無血管組織であり、網膜への光の透過を可能にするため、常に良好な透明度を維持している必要があります。角膜は、上皮、ボウマン層、実質、デスクメ膜、および内皮の5つの層で構成されています。

角膜が損傷した場合、適切なドナー角膜を用いて置換することが可能です。脈絡膜は強膜と網膜の中間に位置する中間層であり、内側はブルース膜で境界づけられ、眼球内の血流を担っています。網膜の除去と同様に、脈絡膜を適切に摘出することが重要です。

網膜は、角膜と水晶体から入った光を受け取り、最終的に脳に伝達される化学エネルギーに変換する役割を担っています。視神経は透明で繊細であるため、高品質な組織を得るためには、系統的に摘出する必要があります。層流クリーンベンチのスイッチを入れてください。

70%イソプロパノールを用いてラミナーフロークリーンベンチを清掃します。サージカルキャップ、マスク、滅菌手袋、およびアームカバーなどの個人用保護具を着用してください。無菌操作を用いて、滅菌済みのタオルと滅菌済みの器具トレイを配置し、無菌領域を構築します。

滅菌器具セットを無菌的に開封し、汚染を避けて滅菌野の上に展開します。すべての滅菌材料と器具を滅菌野内に配置し、眼球が入った眼球保存瓶を滅菌野の端から離れた位置に置きます。利便性を高めるため、あらかじめ準備した保存液のボトルにラベルを貼り、ヨードポリオール、ピロリド、硫酸ナトリウム、および滅菌リン酸緩衝生理食塩水を用意します。

滅菌供給済みの容器の外で、4 °Cの冷蔵庫で保存されていた眼組織および溶液を室温に戻します。繰り返し加温または冷却することを避けてください。滅菌鉗子を使用して、眼保存容器からガーゼとスポンジを取り出します。

眼球を蓋の上に置き、追加の包帯を取り除きます。視神経とともに眼球を慎重に拾い上げ、滅菌したIPVPに浸します。眼球を滅菌IPVP中で2分間除染します。

眼球を滅菌済みのチオ硫酸ナトリウム溶液に移し、1分間置きます。その後、眼球を滅菌済みのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）細胞ライン溶液に移し、操作開始まで保持します。層流クリーンベンチ内で、PBSから眼球を取り出して洗浄し、滅菌野に配置します。

ステロイドで眼球を包みますが、角膜と角膜から約5 mmの強膜は覆わないようにしてください。眼球は単に手で保持することができます。滅菌ハサミを用いて適切な圧力を維持しながら、角膜を傷つけないように、結膜の残存組織をすべて除去します。

使い捨てのメスを用いて、角膜縁から3～4 mmの位置で強膜切開を行います。次に、下層のぶどう膜組織を穿孔させたり、角膜の正常な曲率を変形させたりしないように注意しながら、切開線を360度に広げます。硝子体の流出を防ぐため、4箇所の小さな隙間を残しつつ、4つの大きな切開を加えます。

4か所すべての切開を行い、他の組織が除去されないようにします。小さな強膜プラークが存在すると切開の妨げになる可能性があるため、マイクロサージェリー用鋏を用いて強膜の切除を完全に行います。この操作は、脈絡膜、網膜、および硝子体に損傷を与えないように的に実施する必要があります。

切開が完全に行われているか確認します。正しく切開されていれば、角膜強膜リムは角膜に対応する点でのみ毛様体と接着しています。眼球を滅菌したフィルターの中央付近に置きます。滅菌鉗子を用いて、角膜の摘出を完了させます。

強膜縁を固定し、眼球の光沢部分から角膜強膜縁を切り出します。角膜強膜ボタンに残っている隣接組織を、慎重に分離してください。角膜強膜縁を牽引して角膜に張力がかかるようにしたり、前房に落下させたりしないように注意してください。

低張溶液を用いて角膜の内皮細胞密度を、トリパンブルー染色を用いて約1分間細胞死を確認します。滅菌済みワイヤーガーゼでトリパンブルー染色液を除去し、角膜を滅菌PBSで洗浄します。その後、ショ糖溶液を満たした滅菌ペトリ皿に移します。

この溶液は低張環境を形成し、細胞を視覚的に識別するのに役立ちます。その後、光学顕微鏡を用いて100倍の倍率で細胞数をカウントし、1mm²あたりの細胞数として測定します。通常、細胞密度や、細胞間境界、多形性変性、ジストロフィー、細胞死などの形態学的特徴を確認します。

角膜の厚さは、切除した角膜の良好な透明度とともに、移植における重要な特徴です。滅菌済み角膜CLOを使用して、角膜を強膜縁に固定します。角膜CLOを曲げ、強膜縁を固定するのに十分な穴の開きを確保し、角膜クローブを用いて角膜強膜縁を、室温で調製し、あらかじめ準備した角膜保存液に移します。その後、4週間の角膜保存期間中、角膜は31 degree SIUsで保存される必要があります。

保存媒体は、B 9 2 4 0 装置を用いていくつかの微生物学的検査にかけられます。保存中、角膜は移植に必要な通常のサイズよりも厚くなるため、眼銀行では厚みを減少させるために膨潤剤を使用します。角膜を正常なサイズに戻し、輸送媒体に適合させるために 6%Dextron T 500 が使用されます。

網膜摘出に先立ち、RNA-off（RNA app）を用いて滅菌器具を洗浄し、RNaseフリーの環境を構築します。滅菌野を準備し、眼球が損なわれていないこと、および角膜と強膜縁のみが除去されていることを確認してください。硝子体液が流出している場合、網膜組織の除去が困難になります。

ドナーが65歳未満の場合、血清学的検査の後、外科的目的のために強膜を70% alcoholで保存します。このような場合、強膜は切除せず、硝子体のみを除去し、網膜切除のために強膜全体を保存します。強膜の角膜側に近い位置に小さな切開を加え、滅菌済みのピンセットと鋏を用いて視神経に向かって切開を進めます。

滅菌鉗子で強膜の一部を保持し、硝子体への損傷を避けながら、視神経方向に向かって部分的にハサミで切断します。脈絡膜プラグは強膜と癒着しているため、剥離させてください。強膜全体を切断し、脈絡膜組織を露出させます。どうすればよいでしょうか？

強膜を完全に切断したら、視神経付近で切断して強膜を他の組織から分離します。これにより、硝子体を覆う脈絡膜の全層が露出します。2本の滅菌ピンセットを使用して、これらのRNaseフリーの滅菌アプリコチューブに2 mlのRLバッファーを満たします。一方のピンセットで視神経をつかみ、もう一方のピンセットで脈絡膜を除去することで、脈絡膜層を慎重に剥離します。

脈絡膜を部分的に剥離し、除去しやすくするために切断します。網膜に損傷を与えないよう注意しながら、脈絡膜層をはさみで切断します。切り出した脈絡膜層をRNA later溶液に入れ、4 °Cで24時間保存します。

網膜組織を露出させるために、余分な脈絡膜をすべて取り除きます。脈絡膜層全体が除去されると、透明な網膜層が見えてきます。脈絡膜層には内側にブルッフ膜が存在し、これも除去可能ですが、肉眼で識別するのは困難です。

同様に、2本のピンセットを使用して網膜層を取り除きます。視神経の近くで切除すると、多量の網膜を容易に単離できます。これで、眼のすべての層が確認できる状態になります。

摘出した網膜をRNAlater溶液に入れ、4 °Cで24時間保存します。作業エリアを70%イソプロパノールで清浄します。トリパンブルーで染色した内皮細胞は、倒立顕微鏡の100倍の倍率で観察できます。

通常、1平方ミリメートルあたり200個以上の細胞を持つ適切な角膜が、今後の使用のために保存されます。品質を「可」から「優」まで格付けすることで、比較研究に役立ちます。通常、角膜が移植可能な状態になると、厚さと透明度が記録され、全層角膜移植において適切な角膜が使用されます。

細胞死は、青く染色された細胞を観察することで確認し、死細胞の割合（％）で評価します。保存中の全体の細胞死率が2%を超えた場合は、不適切とみなされます。細胞密度が1mm²あたり2200個未満であるか、あるいは細胞死による損傷がある場合、その角膜は前層板層状角膜移植に使用される可能性があります。

前眼部の外傷により損傷しており、角膜の内皮細胞密度が良好である場合、その角膜を後層板移植に利用できる可能性があります。器官培養中に角膜の厚みは通常増加します。輸送培地は、正常な形状と構造への回復を助けます。

また、器官培養は角膜の再上皮化を促進し、保存期間が長いため、適切なドナー選択に寄与します。微生物学的および血清学的検査についても同様です。これにより、手術の手配に必要な時間を十分に確保でき、死後経過時間が長く、通常では困難な内皮細胞密度や形態の確認が可能になります。

したがって、記載された手順に従えば、他の組織に損傷を与えることなく角膜を摘出することができます。移植に適さない角膜は、眼表面疾患の研究のための新しい培地や保存条件の開発、輪部幹細胞の単離、および角膜に対する薬剤の効果の研究などの研究目的に利用することが可能です。網膜については、RNAサンプルの他組織との交差汚染を回避し、極めて重要であるRNAの完全性を維持することができます。

研究目的に不可欠なこれらの組織は、眼組織のトランスクリプトームの特性評価、再生医療プロジェクトのための幹細胞の単離、および正常被験者と罹患被験者の組織間の組織学的相違の評価を目的としています。網膜組織を摘出した後、さまざまな目的に使用できるため、その後の保存手順および条件は適宜異なります。例えば、網膜組織は、RNAまたはDNA抽出のためのr natorやthisisバッファーなどのRNA安定化試薬を含むチューブに、あるいは細胞単離のためのdisplacedやトリプシンに浸漬することができます。

免疫組織化学染色に向けて、組織をパラフィンまたはOCTで包埋する前の固定処理について説明します。このビデオをご覧いただきありがとうございました。皆様の研究の成功をお祈りいたします。