クロマチンの相互作用のマッピングと転写調節を理解するためのペアエンドタグシーケンシング（CHIA-PET）によるクロマチンの相互作用の解析

パウダーおよびタグシーケンシングを用いたCOMIN相互作用解析は、ゲノムワイドなCOMIN長距離相互作用解析のための手法です。簡潔に、この手法をmagic share padと呼びます。本手法は多くの分子生物学的工程を含んでおり、複雑な場合があります。

したがって、以下のビデオでは、共免疫沈降およびChIA-PET解析のためのライブラリ作製に関わるいくつかの主要なステップについて説明します。ChIA-PETライブラリを構築する上で、最初の重要なステップとなるのが、クロマチン免疫沈降（ ChIP）です。ここでは、細胞培養物から得られたクロマチンサンプルを架橋し、ソニケーションを行い、免疫沈降させます。

次に、分注したチップDNAをバーコード付きハーフリンカーにライゲーションし、近接ライゲーションを行います。制限酵素消化によってPetsを遊離させ、コーティングされた磁気ビーズで精製した後、次世代シーケンシング用の adapters にライゲーションします。キメラ状のchair petsは、ABリンカーの組成とタグの隣接関係に基づいて同定されます。

セントラルリンカー配列を読み取り、ゲノムにマッピングします。このビデオでは、当研究室で乳がん細胞株MCF7を用いて日常的に使用している標準的なChIPプロトコルを紹介します。当研究室のデータでは、特異的抗体によるChIP濃縮効率が高いほど、より優れたChAIR-PETデータが得られることが示されています。したがって、ChIPプロトコルの最適化およびqPCRによる濃縮のバリデーションを行うことを強く推奨します。

ChIP-seqライブラリ作製に進む前に、CF7細胞を500 cm²の組織培養ディッシュでコンフルエンシーが約75%になるまで培養します。架橋前の細胞数は約2000万個です。増殖培地を除去し、温めたPBSで細胞を2回洗浄します。室温でローテーターを用い、新鮮に調製した1.5 mM EGSで45分間細胞を固定します。その後、ホルムアルデヒドを最終濃度1%になるように加え、20分間インキュベートします。

架橋効率は極めて重要であり、細胞株や目的タンパク質によって異なります。架橋剤の濃度、インキュベーション時間、および温度を最適化する必要があります。最終濃度 200 millimolar のグリシンを用いて、10 分間架橋剤をクエンチしてください。

クエンチした架橋剤を廃棄し、冷PBSで2回洗浄します。冷蔵卓上遠心機を用いて細胞ペレットをスクレイピングし、回収します。これで細胞溶解の準備が整いました。あるいは、ペレットを-80 °Cで冷凍保存してください。細胞ペレットを冷凍した場合は、細胞溶解に進む前に氷上で融解させ、0.1% SDS溶解バッファーでペレットを再懸濁します。

冷却遠心機を用いて4°Cでチューブを回転させ、上清を廃棄し、細胞溶解を繰り返します。クロマチンの断片化を行う前に、架橋されたクロマチンを放出させるため、核溶解を行います。核膜が存在しないことで、より穏やかな条件下で架橋クロマチンのソニケーションを行うことが可能になります。

1% SDS溶解バッファーで核ペレットを再懸濁します。懸濁液を高速遠心管に移します。4°Cでチューブを回転させます。

遠心分離により核デブリを除去します。クロマチンペレットはこのようになります。P 1000 ピペットチップを使用してペレットを細かく砕き、0.1% SDS溶解バッファーで2回洗浄します。

冷却遠心機を用いて、4 °Cでチューブを回転させます。これで核ペレットの超音波処理の準備が整いました。あるいは、-80 °Cでペレットを凍結させても構いません。

ペレットを透明なチューブに移します。0.1% SDS溶解バッファーをペレットに加え、すべての気泡を取り除きます。過熱を防ぐため、ソニケーションの間、サンプルは常に低温に保ってください。バッファー量、プローブの深さ、ソニケーション強度、サイクル数、および架橋の程度などの異なる条件が、ソニケーション効率に影響を及ぼす可能性があります。

Proteinase Kを用いてクロマチンの逆架橋および分注を行い、アガロースゲル電気泳動を実施します。断片化効率を確認し、目的とする200から600 bpのDNAサイズ範囲を得るために、最適化を行うことが推奨されます。遠心分離によりセルデブリを除去します。

クロマチンの磁気ビーズによるプレクリア準備が整いました。あるいは、十分な量のクロマチンが回収されるまで-80 °Cで保存します。ChIPを開始するには、ビーズをビーズ洗浄バッファーで3回洗浄します。今回および今後の磁気タンパク質ビーズを用いた洗浄は、以下の手順で行います。

ソニケーション後のクロマチンをあらかじめ洗浄したビーズに加え、別のチューブを用いて4°Cで一晩インキュベートする。あらかじめ洗浄したビーズに抗体をコートし、4°Cで一晩インキュベートする。抗体コート済みビーズをビーズ洗浄バッファーで2回洗浄する。

近接ライゲーションに用いる基質の複雑性が高いと、不可避的に相当量の非特異的なノイズが生じ、その結果、シーケンシングのコストが増大します。複雑性とバックグラウンドノイズのレベルを低減することに加え、我々はマウスRNAポリメラーゼIIモノクローナル抗体を用いて、転写調節に関与するクロマチン相互作用を同定しました。

これにより、活性プロモーターおよび対応する調節領域の調査が可能となり、効率的かつ協調的な転写の理解につながります。抗体コートビーズから洗浄緩衝液を取り除きます。プレクリア済みクロマチンと抗体コートビーズを混合し、4 °Cで一晩インキュベートします。一晩のインキュベーション後、ビーズを回数分洗浄し、未結合のクロマチンを除去します。その後、ビーズをTE緩衝液で再懸濁し、定量および濃縮確認用に分注します。PaR-C taggingシーケンシングを用いたクロマチン相互作用解析は、高次クロマチン構造の相互作用を大規模にde novo解析するために開発された手法です。

クロマチン免疫沈降によって濃縮されたDNA断片を、近接ライゲーションによって捕捉します。CHI-PETライブラリの構築にはパッドおよびタグ戦略が適用され、ハイスループット次世代シーケンシング技術によってシーケンスされます。このビデオでは、CHI-PETライブラリ構築における重要な実験的側面について説明します。

ライブラリ構築の前半では、DNA断片が結合しているProtein AまたはGビーズを操作し、酵素と緩衝塩を除去します。各酵素反応後、各洗浄ステップにおいて、緩やかな遠心分離と弾く動作を行ってください。磁性粒子に配置した際にビーズの回収率を最大化するため、上清を数回ピペッティングしてください。

反応混合液にビーズを含むすべてのインキュベーションステップでは、コンセントレーターを使用します。あらかじめマスターミックスを調製し、ビーズを均一に再懸濁させた後、最後に酵素を添加してください。インキュベーションの間、ビーズが十分に混合されていることを確認してください。ハーフリンカーオリゴヌクレオチドは、4つのヌクレオチドからなる内部バーコードと、タイプIIS制限酵素MME Iの認識サイトを備えるように設計されています。

Cクロマチン複合体中のテザー付きDNA断片にハーフリンカーをライゲーションさせた後、相互作用しているDNA断片は完全なリンカー配列によって連結されます。これらのハーフリンカーは、非特異的なライゲーション産物由来のヘテロ二量体abリンカーを持つ配列、または特異的なライゲーション産物由来のホモ二量体AAまたはBBリンカーを持つ配列を生成します。したがって、異なるヌクレオチドバーコードを持つ2種類のハーフリンカーを使用することで、異なる実験やレプリケートの特定が可能になるとともに、異なるチップ複合体間における非特異的なキメラライゲーション率のモニタリングが可能になります。

反応系を氷上でセットアップし、ハーフリンカーを氷上で緩やかに解凍することが重要です。ハーフリンカーを水で十分に混合した後、リガーゼバッファーを含むPEGと混合します。再懸濁させる前に、マスターミックスが十分に混ざっていることを確認してください。

ハーフリンカーとチップDNA断片が十分に混合され、ハーフリンカーの連結（コンカテマー化）を防いだ後で、T4 DNAリガーゼを添加してチップDNAを懸濁させます。チューブをパラフィルムで密閉し、16 °Cで回転させながら一晩インキュベートします。その後、SDSを含むバッファーEBを添加して、ビーズから完全なクロマチン複合体を溶出させます。溶出DNAにTriton X-100を加え、SDS濃度を下げてSDSをクエンチします。クロマチン複合体の環状化は、2つのハーフリンカーが相互作用接合部でライゲートされ、完全なリンカー配列が形成されることで促進されます。異なるDNAタンパク質複合体間のライゲーションを最小限に抑えるため、溶出したクロマチン複合体を極めて希釈した条件下でライゲートします。溶出したクロマチン複合体が反応混合液中で十分に希釈された後で、T4 DNAリガーゼを添加してください。逆架橋後、DNA結合タンパク質を除去し、フェノール・クロロホルム抽出を用いて環状化DNA断片を精製します。簡単な分離には、Qiagen PhaseLockゲルシステムを使用してください。

フェノール抽出後、ペレットの質量と視認性を高めるためにGlycoBlue A DNAキャリアを使用します。ハーフリンカーオリゴヌクレオチドには、隣接するMmeI認識部位が含まれています。MmeIはタイプIIS制限酵素であり、標的結合部位から18および20塩基対下流を切断することで、クロマチン断片の短いタグを生成し、petsと略されるPETタグリンカータグ構築物を産生します。

さらに、各ハーフリンカーは、ストレプトアビジンコート磁気ビーズによるpet構築物の精製を可能にするためにビオチンで修飾されています。MMEによる1回目の消化を行い、タグ付きリンカー構築物を遊離させます。ストレプトアビジンビーズへの選択的結合によりpetを精製し、ハイスループットシーケンシング用のアダプターを用いてpet構築物をライゲーションします。

CHI PETライブラリーフュージョンを増幅させるために、fusion DNAポリメラーゼを使用します。DNAポリメラーゼは、高い精度と効率でテンプレートを生成するために使用されます。PCR反応は冷却状態で準備し、最後にfusion DNAポリメラーゼを添加してください。

この酵素は3'から5'方向のエキソヌクレアーゼ活性を有しているため、dNTPsが存在しない条件下ではプライマーを分解する可能性があります。charsetライブラリーが正常に構築されていれば、約223 bpの明瞭でくっきりとしたバンドが認められます。ゲルから223 bpのバンドを切り出す際は非特異的バンドを避けるようにし、切り出したバンドをGel Crush Protocolに従って精製してください。

ハイスループットシーケンシングの前に、Agilent 2100 bioanalyzerとDNA 1000キットを用いてクオリティチェックを行います。ここでは、ゲノム全域にわたるクロマチン相互作用を非バイアスに検出するためのCHI-PETの手順を実演しました。CHI-PETデータの品質は、使用したチップ抗体の有効性とシーケンシング深度に依存します。

ここでは、相互作用マッピングに1800万から2000万リードを使用します。この特定のプロトコルは、ヒトゲノムにおけるエストロゲン受容体およびRNAポリメラーゼによって結合されるクロマチン相互作用ネットワークの特性評価に成功しています。本アッセイは、全ゲノムコンテキストにおける転写生物学の三次元構造に関する今後の研究において、強力なツールになると期待されます。

このビデオがお役に立てれば幸いです。ご視聴ありがとうございました。