Name: クロマチンの相互作用のマッピングと転写調節を理解するためのペアエンドタグシーケンシング（CHIA-PET）によるクロマチンの相互作用の解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 21 min 55 s
Description: 学ぶChIA-PET法によるクロマチン相互作用解析と転写調節機構の理解。クロマチン免疫沈降とライブラリ構築の最適化手法を解説し、ゲノム規模の長距離相互作用解析に役立つ実験プロトコルを提供します。

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著者は、シンガポールのA * STARのサポートされています。さらに、MJFは、科学国立フェローシップとリー·クアンユーポスドクフェローシップの女性のためのA * STAR、国立科学奨学金、ロレアルでサポートされています。 YRはNIH ENCODEの助成金（R01 HG004456-01、R01 HG003521-01）でサポートされています。著者はまた、ビデオ編集およびさんミシェル·テオのために氏ギャラリー一覧ラヒム、シーンを撮影するため、特定の氏ケルビンイッセイ氏、チャン·カイ翔氏とシャーウィンガンの8ピクセルプロダクション、シンガポール、ビデオ撮影チームを認めるボイスオーバー。

<ol><li>Cai, S., Lee, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SATB1+packages+densely+looped%2C+transcriptionally+active+chromatin+for+coordinated+expression+of+cytokine+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">SATB1 packages densely looped, transcriptionally active chromatin for coordinated expression of cytokine genes.</a> Nat. Genet. 38, 1278-1288 (2006).</li>
<li>Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organization+of+replication+and+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The organization of replication and transcription.</a> Science. 284, 1790-1795 (1999).</li>
<li>Das, P. M., Ramachandran, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation assay.</a> Biotechniques. 37, 961-969 (2004).</li>
<li>Deng, W., Blobel, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+chromatin+loops+provide+epigenetic+gene+expression+states%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Genet.+Dev%22%5BJournal%5D)">Do chromatin loops provide epigenetic gene expression states.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 20, 548-554 (2010).</li>
<li>Fullwood, M. J., Han, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+interaction+analysis+using+paired-end+tag+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromatin interaction analysis using paired-end tag sequencing.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 21, 21-25 (2010).</li>
<li>Fullwood, M. J., Liu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+oestrogen-receptor-alpha-bound+human+chromatin+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An oestrogen-receptor-alpha-bound human chromatin interactome.</a> Nature. 462, 58-64 (2009).</li>
<li>Jackson, D. A., Hassan, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+focal+sites+of+transcription+within+human+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Visualization of focal sites of transcription within human nuclei.</a> EMBO J. 12, 1059-1065 (1993).</li>
<li>Li, G., Fullwood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIA-PET+tool+for+comprehensive+chromatin+interaction+analysis+with+paired-end+tag+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">ChIA-PET tool for comprehensive chromatin interaction analysis with paired-end tag sequencing.</a> Genome Biol. 11, R22(2010).</li>
<li>Li, G., Ruan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+Promoter-Centered+Chromatin+Interactions+Provide+a+Topological+Basis+for+Transcription+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Extensive Promoter-Centered Chromatin Interactions Provide a Topological Basis for Transcription Regulation.</a> Cell. 148, 84-98 (2012).</li>
<li>Ng, P., Wei, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paired-end+diTagging+for+transcriptome+and+genome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Mol.+Biol.+Chapter%22%5BJournal%5D)">Paired-end diTagging for transcriptome and genome analysis.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter. Chapter 21, 12(2007).</li>
<li>Nowak, D. E., Tian, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-step+cross-linking+method+for+identification+of+NF-kappaB+gene+network+by+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation.</a> Biotechniques. 39, 715-725 (2005).</li>
<li>Osborne, C. S., Chakalova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+genes+dynamically+colocalize+to+shared+sites+of+ongoing+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Active genes dynamically colocalize to shared sites of ongoing transcription.</a> Nat. Genet. 36, 1065-1071 (2004).</li>
<li>Rippe, K., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+at+a+distance%3A+DNA-looping+and+initiation+of+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Action at a distance: DNA-looping and initiation of transcription.</a> Trends Biochem. Sci. 20, 500-506 (1995).</li>
<li>Schoenfelder, S., Sexton, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+associations+between+co-regulated+genes+reveal+a+transcriptional+interactome+in+erythroid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Preferential associations between co-regulated genes reveal a transcriptional interactome in erythroid cells.</a> Nat. Genet. 42, 53-61 (2010).</li>
<li>Zeng, P. Y., Vakoc, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dual+cross-linking+for+identification+of+indirect+DNA-associated+proteins+by+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation.</a> Biotechniques. 41, 694-698 (2006).</li>
</ol>

利害の衝突が宣言されません。

CHIA-PETは、転写調節における長距離相互作用を識別するために開発した方法です。 CHIA-PETライブラリの品質を決定する重要な要因の一つはChIP材料の品質です。 ビデオに示すように、プロトコルは、セルをクロスリンクするEGSとホルムアルデヒドの使用が組み込まれています。より長いスペーサーアームを有する第二架橋試薬と組み合わせて、ホルムアルデヒドの使用は、単独で3,11,15ホルムアルデヒドによってバインドできませんでしたタンパク質の結合に役立つ可能性があります。我々は、堅牢な結合部位との長距離相互作用9を示しているこの方法でライブラリを構築した。しかし、架橋やチップの条件は、関心のある各要因のために最適化し、あまりにも多くの架橋は、超音波処理により断片化が困難になり、おそらく偽のクロマチンの相互作用が生じる可能性があるので、それは過剰架橋に重要ではありませんする必要があります。クロマチンの相互作用CHIA-PETによって識別されるこのような蛍光in situハイブリダイゼーション4などの別の方法によって検証する必要があります。 我々はクロマチン材料の100 ngの最小をお勧めします。我々はクロマチン材料の50 ngから質の良いライブラリを構築しているが、我々は、出発物質の大量の、それにより、各ライブラリのアンプリコンと冗長性を最小限に抑え、16未満のPCRサイクルでCHIA-PETライブラリーの構築を許可することを観察した。この下の冗長性は、それによってシーケンスの少ない車線の、より包括的なクロマチンの相互作用マップを有効にすると、より高いユニークなマップされたタグも使用可能なデータの割合が高いと相関していた。各チューブのビーズの最終的な詰め量はそれぞれ磁気およびセファロースビーズに50μlと100μlのでなければなりません。パックされたビーズのボリュームが述べたよりも小さい場合、DNA有利子ビーズの損失を最小化するために同様に事前にクリアブランク磁気またはセファロースビーズを用いた最小のパックボリュームにもたらす以降のステップでの。ちびのヒントや大規模なコアチップは、セファロースビーズをピペッティングするために使用されるべきです。 次の変更は、以前公開されCHIA-PETプロトコル5次の組み込まれた。まず、磁気Gビーズを洗浄中に、サンプルの損失を最小限に抑えるために使用された。また、セルフライゲーションハーフリンカーまたは/およびアダプタのアンプリコンであることが100 bpおよび138 bpのおおよそのサイズの非特異的なバンドを同定した。したがって、我々は、PCR増幅の間に非特異的バンドを最小限に抑えるために、ビオチン化半リンカーと454 GS20アダプタの濃度を減少させた。近接ライゲーションボリュームは、その後の精製工程中のサンプルの損失を最小限に抑え、また、試薬コストを節約するために50ミリリットルから10ミリリットルに減少した。また、ストレプトアビジンビーズにCHIA-PET DNAの最大のキャプチャを確保するためにビーズにCHIA-PETのDNAを固定するためにインキュベーション時間の増加となりました。 近接ライゲーションステップの間、キメラライゲーションTHAtは、必然的に非特異的とランダムに生成されたin vivoでクロマチンの相互作用で真を表すものではありません。したがって、任意のCHIA-PET実験からのデータの品質を評価するために、キメラ率が特定の塩基バーコードTAAGとATGT 5を持つ2つの異なる半リンカーの使用から推定される。ハイスループットシーケンシングした後、CHIA-PETシーケンスは、最初の8を区別することができる特定のライゲーション産物と非特異的ライゲーション産物から派生したリンカバーの組成と配列について分析されます。知られているキメラの割合（すなわち、ヘテロABリンカー）は、社内でMCF-7 RNAポリメラーゼII CHIA-PETのライブラリが15％未満である本。 CHIA-PETのシーケンスは、その後、すなわち2つのカテゴリ、セルフライゲーションペットと間ライゲーションのペットに分類されます。間ライゲーションのペットがiから派生している間にセルフライゲーションのペットは、クロマチンの断片の自己環状化ライゲーションから得られる2つの異なるDNA断片の間NTER-ライゲーション。後者は、同じ染色体（染色体内間ライゲーションペット）、あるいは両方のタグが2つの異なる染色体（染色体間の相互連結PETS）にマッピングされ、各タグのゲノム距離に基づいて3つのカテゴリに分割さです。我々は、異なるカテゴリ8を整理するCHIA-PETツールのソフトウェアパッケージを開発しました。これは、ライブラリ内にあるDNA断片に基づいて行われます。一般的には、小さなチップの断片は、より高い解像度を提供し、4キロバイト程度であるこれらのRNAポリメラーゼII CHIA-PETライブラリをカットオフします。 さらに、実際のクロマチンの相互作用は相互作用クラスタ内の間ライゲーションのペットの数をカウントすることによって、ランダムノイズと区別することができます。言い換えれば、高いPETカウントのクラスタは、実際のクロマチンの相互作用8であることの確率が高いと言われています。 私たちの偽陽性をフ​​ィルタリングするには偶然によって間ライゲーションのペットを形成することができる高濃縮アンカーからの上昇は、統計分析のフレームワークは、2つのアンカー8の任意の間ライゲーションのペットのランダムな形成を考慮して策定されています。 結論として、CHIA-PET技術は、地球規模でのクロマチンの相互作用ネットワークをマッピングすることができます。 CHIA-PETでのチップの実装では、ライブラリの複雑さとバックグラウンドノイズの低減を可能にします。さらに、チップは、特定の転写因子5に関連付けられた特定のクロマチンの相互作用の検討を可能にし、クロマチンの相互作用に特異性を追加します。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> 4から20パーセント勾配TBEゲル</td><td>インビトロジェン</td><td> EC6225BOX </td><td>ステップB、6.3 </td></tr><tr><td> PEGを用いた5×T4 DNAリガーゼバッファー</td><td>インビトロジェン</td><td> 46300018 </td><td>ステップB、2.2 </td></tr><tr><td> 6パーセントTBEゲル</td><td>インビトロジェン</td><td> EC6263BOX </td><td>ステップB、6.8 </td></tr><tr><td> AgilentのDNA 100アッセイ</td><td>アジレント·テクノロジー</td><td> 5067-1504 </td><td rowspan="3">ステップB、7.1 </td></tr><tr><td> Agilentの高感度DNAアッセイ</td><td>アジレント·テクノロジー</td><td> 5067-4626 </td></tr><tr><td>アジレントバイオアナライザ2100 </td><td>アジレント·テクノロジー</td><td> G2940CA </td></tr><tr><td> （スピン-X）管フィルタを遠心</td><td>コー​​ニング&lt;/ TD&gt; <td> CLS8160 </td><td>ステップB、3.7と6.9 </td></tr><tr><td>ダークリーダーネーター</td><td>クレア化学研究所</td><td> DR46B </td><td>ステップB、6.8 </td></tr><tr><td>デジタル超音波処理細胞攪乱</td><td>ブランソン</td><td> 450D-0101063591 </td><td> 、4.3ステップ</td></tr><tr><td> DynaMag-2磁石（磁性粒子コンセントレータ） </td><td>インビトロジェン</td><td> 123-21D </td><td>洗浄工程のすべての磁気ビーズのために、7.5.1ステップBステップ</td></tr><tr><td> DynaMag-15マグネット（磁気粒子コンセントレータ） </td><td>インビトロジェン</td><td> 123.01D </td><td> 、5とステップ6 </td></tr><tr><td> DynaMag-PCR（磁性粒子コンセントレータ） </td><td>インビトロジェン</td><td> 49から2025 </td><td>ステップB、6.5 </td></tr><tr><td> 大腸菌DNAポリメラーゼI </td><td> NEB </td><td> M0209 </td><td>ステップB、5.6 </td></tr><tr><td> GlycoBlue </td><td> Ambionの</td><td> AM9516 </TD&gt; <td> 、7.5.1ステップB、4.3および6.5のステップ</td></tr><tr><td>イルミナCBOTクラスタ生成システム</td><td>イルミナ</td><td> SY-301-2002 </td><td>ステップB、7.4 </td></tr><tr><td>イルミナGenome AnalyzerのIIxは</td><td>イルミナ</td><td> SY-301-1301 </td><td>ステップB、7.5 </td></tr><tr><td>イルミナPEプライマー</td><td>イルミナ</td><td> PE-102-1004 </td><td>ステップB、5.4（必要に応じて） </td></tr><tr><td>インテリミキサー</td><td> Palicoバイオ</td><td> RM-2L </td><td>ステップB、回転を持つ任意のインキュベーション</td></tr><tr><td>ライトサイクラー480リアルタイムPCRシステム</td><td>ロシュ社</td><td> 04 640 268 001 </td><td> 、7.5.3ステップBステップ、7.3 </td></tr><tr><td> LightCycler480 DNAのSYBR Green Iマスターミックス</td><td>ロシュ社</td><td> 03 752 186 001 </td><td>ステップB、7.5.3 </td></tr><tr><td> M-280ストレプトアビジンDynabeads®を</td><td>インビトロジェン</td><td> 11206D </td><td>ステップB、5.2 </td></tr> &lt;TR&gt; <td>磁気（ダイナ）プロテインG </td><td>インビトロジェン</td><td> 100.03D </td><td> 、5.1.1および5.2.1のステップ</td></tr><tr><td>高密度（2ミリリットル）をMaXtract </td><td>キアゲン</td><td> 129056 </td><td> 、7.5.1ステップ</td></tr><tr><td>高密度（50ミリリットル）をMaXtract </td><td>キアゲン</td><td> 129073 </td><td>ステップB、4.2 </td></tr><tr><td> MmeI </td><td> NEB </td><td> R0637 </td><td> R0637 </td></tr><tr><td>アーゼONEリボヌクレアーゼ</td><td>プロメガ</td><td> M426C </td><td>ステップB、4.8 </td></tr><tr><td> RNAポリメラーゼII（8WG16）モノクローナル抗体</td><td> Covance </td><td> MMS-126R </td><td>ステップ5.2.4 </td></tr><tr><td>オークリッジ遠心管（ポリプロピレン） </td><td>ナルゲン</td><td> 3119-0050 </td><td>ステップ3.1 </td></tr><tr><td>オークリッジ遠心チューブ（テフロンFEP） </td><td>ナルゲン</td><td> 3114-0050 </td><td>ステップB、4.3 </td></tr><tr><td> Phusイオンハイ·フィデリティマスターミックス</td><td> Finnzymes </td><td> F-531 </td><td> Bは、ステップ6に</td></tr><tr><td>ピコグリーン（クワント-IT）のdsDNA試薬</td><td>インビトロジェン</td><td> P11495 </td><td>ステップ7.5.2 </td></tr><tr><td>ポリスチレン丸底試験管</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 352057 </td><td> 4.1ステップ</td></tr><tr><td>プロテアーゼインヒビターカクテル錠（完全、EDTAフリー） </td><td>ロシュ社</td><td> 11873580001 </td><td> 、1.6以降のステップ</td></tr><tr><td>プロテイナーゼK溶液（20mg/ml） </td><td> Fermentas </td><td> E00491 </td><td> 、4.4、7.5.1ステップ ステップB 4.1 </td></tr><tr><td> T4 DNAリガーゼ</td><td> Fermentas </td><td> EL0013 </td><td>ステップB、2.2、3.9および5.4 </td></tr><tr><td> T4 DNAリガーゼ緩衝液（NEB） </td><td> NEB </td><td> B0202S </td><td>ステップB、3.3および3.9 </td></tr><tr><td> T4 DNAポリメラーゼ</td><td>プロメガ</td><td> M4215 </td><td>ステップB、1.2 </td></tr><tr><td> T4 DNAポリヌクレオチドキナーゼ</td><td> NEB </td><td> M0201 </td><td>ステップB、3.3 </td></tr><tr><td> TruSeq SBSキットV5-GA </td><td>イルミナ</td><td> FC-104-5001 </td><td>イルミナGenome AnalyzerのIIxは、システムのリージェンツ</td></tr><tr><td> TruSeq PEクラスタキットV2-CBOT-GA </td><td>イルミナ</td><td> PE-300-2001 </td><td>イルミナCBOTクラスタ発電システムで使用できるようにするには</td></tr><tr><td> SYBR Green Iを</td><td>インビトロジェン</td><td> S-7585 </td><td>ステップB、6.3および6.8 </td></tr><tr><td> X細胞SureLockミニ細胞電気泳動システム</td><td>インビトロジェン</td><td> EI0001 </td><td>ステップB、6.3および6.8 </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> 名 </td><td colspan="2"> シーケンス </td><td> コメント </td></tr><tr><td rowspan="2">ビオチン化したハーフリンカーA（200ng/μl） </td><td>トップ</td><td> 5 &#39;GG CCG CGA / iBiodT / ATC TTA TCC AACの3&#39; </td><td> 250ナノモル規模HPLC精製された内部ビオチンDT（9） </td></tr><tr><td>ボット</td><td> 5 &#39;GTT GGA TAA GAT ATC GC 3&#39; </td><td> 250ナノモルスケールHPLC精製</td></tr><tr><td rowspan="2">ビオチン化したハーフリンカーB（200ng/μl） </td><td>トップ</td><td> 5 &#39;GGC CGC GA / iBiodT / ATA CAT TCC AACの3&#39; </td><td> 250ナノモル規模HPLC精製された内部ビオチンDT（9） </td></tr><tr><td>ボット</td><td> 5 &#39;GTT GGA ATG TAT ATC GC 3&#39; </td><td> 250ナノモルスケールHPLC精製</td></tr><tr><td rowspan="2">非ビオチン化したハーフリンカー（200ng/μl） </td><td>トップ</td><td> 5 &#39;CGC GGC GAT ATC GGA TCC AACの3&#39; </td><td> 250ナノモル規模PCRグレード</td></tr><tr><td>ボット</td><td> 5 &#39;GTT GGA TCC GAT ATC GC 3&#39; </td><td> 250ナノモル規模PCRグレード</td></tr><tr><td rowspan="2"> GS20アダプター（200ng/μl） </td><td>トップ</td><td> 5 &#39;CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCC CATCTG TTC CCT CCC TGT CTC AGN N 3 &#39; </td><td> 250ナノモル規模PCRグレード</td></tr><tr><td>ボット</td><td> 5&#39;CTG AGA CAG GGA GGG AAC AGA TGG GAC ACG CAG GGA TGA GAT GG 3 &#39; </td><td> 250ナノモル規模PCRグレード</td></tr><tr><td rowspan="2"> GS20アダプターB（200ng/μl） </td><td>トップ</td><td> 5 &#39;CTG C​​AC AGA GCA ACA GGG GAT AGG CAA GGC ACA CAG GGG ATA GG 3&#39; </td><td> 250ナノモル規模PCRグレード</td></tr><tr><td>ボット</td><td> 5 &#39;CCT ATC CCC TGT GTG CCT TGC CTA TCC CCT GTT TGT GCG CTC AGN N 3&#39; </td><td> 250ナノモル規模PCRグレード</td></tr><tr><td rowspan="2">イルミナ-NNアダプタ</td><td>トップ</td><td> 5 &#39;ACA CTC TTT CCC TAC ACG ACG CTC TTC CGA TC 3&#39; </td><td> 250ナノモルスケールHPLC精製は、ステップB、5.4を参照してください。 </td></tr><tr><td>ボット</td><td> 5 &#39;リン - GAT CGG AAG AGC TCA GGT GCA GGA ATG CCG AG 3&#39; </td><td> 250ナノモルスケールHPLC精製は、5 &#39;末端は、ステップBを参照してください5.4リン酸化</td></tr><tr><td>イルミナ1から454（フォワード）プライマー（10μM） </td><td colspan="2"> 5 &#39;AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACC CTA TCC CCT GTG TGC CTT G 3&#39; </td><td> 250ナノモル規模PCRグレード</td></tr><tr><td>イルミナ2から454（リバース）プライマー（10μM） </td><td colspan="2"> 5 &#39;CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA CGG GAT TCC ATC TCA TCC CTG C​​GT GTCの3&#39; </td><td> 250ナノモル規模PCRグレード</td></tr><tr><td>定量PCRプライマー1.1（10μM） </td><td colspan="2"> 5 &#39;→3 AT AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG&#39; </td><td> 10nmole規模PCRグレード</td></tr><tr><td>定量PCRプライマー2.1（10μM） </td><td colspan="2"> 5 &#39;CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA 3&#39; </td><td> 10nmole規模PCRグレード</td></tr><tr><td>イルミナの3から454シークエンシングプライマー（100μM） </td><td colspan="2"> 5&#39;TGC GTG TCC CAT TTC CTG C​​CT CCC TGT CTC AG 3 &#39; </td><td> 100nmoleスケールHPLC精製</td></tr><tr><td>イルミナの4から454の配列決定プライマー（100μM） </td><td colspan="2"> 5&#39;GTG CCT TGC CTA TCC CCT GTT TGT GCG CTC AG 3 &#39; </td><td> 100nmole規模HPLC精製</td></tr></tbody></table>統合されたDNAテクノロジー（IDT）からオリゴおよびアダプタのテーブル。注文オリゴは、10前述と同様にリンカーおよびアダプタを準備します。ハーフリンカーとアダプタあらかじめ準備され、-20℃で数ヶ月の​​保存が可能

クロマチンの相互作用のマッピングと転写調節を理解するためのペアエンドタグシーケンシング（chia-pet）によるクロマチンの相互作用の解析

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

ゲノムは、ミクロンサイズの核のスペース内に高次のコンフォメーション7、2、12を採用し 、三次元構造に編成されています。このようなアーキテクチャは、ランダムではなく、遺伝子のプロモーターおよび調節エレメント13との間の相互作用を伴う。特定の調節配列に転写因子の結合は、転写調節と協調1、14のネットワークをもたらす。 ペアエンドタグシーケンシング（CHIA-PET）によるクロマチンの相互作用の解析は、これらの高次クロマチン構造の5,6を識別するために開発されました。セルが固定されており、相互作用する遺伝子座は、共有結合、DNA-タンパク質のクロスリンクによってキャプチャされます。非固有のノイズを最小限に抑え、複雑さを軽減するだけでなく、クロマチンの相互作用分析の特異性を向上させるために、クロマチン免疫沈降（ChIP）は、近接ライゲーションの前に興味のあるクロマチンの断片を豊かにするために、特定のタンパク質因子に対して使用されている。ハーフリンカーを含むライゲーションは、その後、個々のクロマチン複合体の中で一緒につながれたDNA断片のペアの間に共有リンクを形成します。ハーフリンカーに隣接MmeI制限酵素サイトはMmeI消化時のペアの終了タグ - リンカー - タグ構造（PETS）の抽出を可能にします。ハーフリンカーはビオチン化されているように、これらのPETの構造は、ストレプトアビジン磁気ビーズを用いて精製されています。精製したPETSは、次世代シーケンシング·アダプタとの相互作用フラグメントのカタログのようなイルミナGenome Analyzerなどの次世代シーケンサーを経由して生成されますと連結されています。マッピングおよびバイオインフォマティクス解析は、チップに富む結合部位とチップ濃縮クロマチンの相互作用8を識別するために実行されます。 我々は、チップの品質がCHIA-PETライブラリの結果に大きな役割を果たしている特にCHIA-PETプロトコルは、チップの準備の重要な側面を示すためにビデオを制作しています。プロトコルがあるよう非常に長い、唯一の重要なステップは、ビデオで表示されます。

ペアエンドタグシーケンシング（CHIA-PET）によるクロマチンの相互作用分析のための方法です。<em&gt; de novoの</em転写制御の理解を深めるためのクロマチンの相互作用&gt;検出。

クロマチンの相互作用のマッピングと転写調節を理解するためのペアエンドタグシーケンシング（CHIA-PET）によるクロマチンの相互作用の解析

ゲノムは三次元構造として組織化されており、ミクロンサイズの核内空間において高次コンフォメーションを形成している 7, 2, 12。このような...

パウダーおよびタグシーケンシングを用いたCOMIN相互作用解析は、ゲノムワイドなCOMIN長距離相互作用解析のための手法です。簡潔に、この手法をmagic share padと呼びます。本手法は多くの分子生物学的工程を含んでおり、複雑な場合があります。したがって、以下のビデオでは、共免疫沈降およびChIA-PET解析のためのライブラリ作製に関わるいくつかの主要なステップについて説明します。ChIA-PETライブラリを構築する上で、最初の重要なステップとなるのが、クロマチン免疫沈降（ ChIP）です。ここでは、細胞培養物から得られたクロマチンサンプルを架橋し、ソニケーションを行い、免疫沈降させます。次に、分注したチップDNAをバーコード付きハーフリンカーにライゲーションし、近接ライゲーションを行います。制限酵素消化によってPetsを遊離させ、コーティングされた磁気ビーズで精製した後、次世代シーケンシング用の adapters にライゲーションします。キメラ状のchair petsは、ABリンカーの組成とタグの隣接関係に基づいて同定されます。セントラルリンカー配列を読み取り、ゲノムにマッピングします。このビデオでは、当研究室で乳がん細胞株MCF7を用いて日常的に使用している標準的なChIPプロトコルを紹介します。当研究室のデータでは、特異的抗体によるChIP濃縮効率が高いほど、より優れたChAIR-PETデータが得られることが示されています。したがって、ChIPプロトコルの最適化およびqPCRによる濃縮のバリデーションを行うことを強く推奨します。ChIP-seqライブラリ作製に進む前に、CF7細胞を500 cm²の組織培養ディッシュでコンフルエンシーが約75%になるまで培養します。架橋前の細胞数は約2000万個です。増殖培地を除去し、温めたPBSで細胞を2回洗浄します。室温でローテーターを用い、新鮮に調製した1.5 mM EGSで45分間細胞を固定します。その後、ホルムアルデヒドを最終濃度1%になるように加え、20分間インキュベートします。架橋効率は極めて重要であり、細胞株や目的タンパク質によって異なります。架橋剤の濃度、インキュベーション時間、および温度を最適化する必要があります。最終濃度 200 millimolar のグリシンを用いて、10 分間架橋剤をクエンチしてください。クエンチした架橋剤を廃棄し、冷PBSで2回洗浄します。冷蔵卓上遠心機を用いて細胞ペレットをスクレイピングし、回収します。これで細胞溶解の準備が整いました。あるいは、ペレットを-80 °Cで冷凍保存してください。細胞ペレットを冷凍した場合は、細胞溶解に進む前に氷上で融解させ、0.1% SDS溶解バッファーでペレットを再懸濁します。冷却遠心機を用いて4°Cでチューブを回転させ、上清を廃棄し、細胞溶解を繰り返します。クロマチンの断片化を行う前に、架橋されたクロマチンを放出させるため、核溶解を行います。核膜が存在しないことで、より穏やかな条件下で架橋クロマチンのソニケーションを行うことが可能になります。1% SDS溶解バッファーで核ペレットを再懸濁します。懸濁液を高速遠心管に移します。4°Cでチューブを回転させます。遠心分離により核デブリを除去します。クロマチンペレットはこのようになります。P 1000 ピペットチップを使用してペレットを細かく砕き、0.1% SDS溶解バッファーで2回洗浄します。冷却遠心機を用いて、4 °Cでチューブを回転させます。これで核ペレットの超音波処理の準備が整いました。あるいは、-80 °Cでペレットを凍結させても構いません。ペレットを透明なチューブに移します。0.1% SDS溶解バッファーをペレットに加え、すべての気泡を取り除きます。過熱を防ぐため、ソニケーションの間、サンプルは常に低温に保ってください。バッファー量、プローブの深さ、ソニケーション強度、サイクル数、および架橋の程度などの異なる条件が、ソニケーション効率に影響を及ぼす可能性があります。Proteinase Kを用いてクロマチンの逆架橋および分注を行い、アガロースゲル電気泳動を実施します。断片化効率を確認し、目的とする200から600 bpのDNAサイズ範囲を得るために、最適化を行うことが推奨されます。遠心分離によりセルデブリを除去します。クロマチンの磁気ビーズによるプレクリア準備が整いました。あるいは、十分な量のクロマチンが回収されるまで-80 °Cで保存します。ChIPを開始するには、ビーズをビーズ洗浄バッファーで3回洗浄します。今回および今後の磁気タンパク質ビーズを用いた洗浄は、以下の手順で行います。ソニケーション後のクロマチンをあらかじめ洗浄したビーズに加え、別のチューブを用いて4°Cで一晩インキュベートする。あらかじめ洗浄したビーズに抗体をコートし、4°Cで一晩インキュベートする。抗体コート済みビーズをビーズ洗浄バッファーで2回洗浄する。近接ライゲーションに用いる基質の複雑性が高いと、不可避的に相当量の非特異的なノイズが生じ、その結果、シーケンシングのコストが増大します。複雑性とバックグラウンドノイズのレベルを低減することに加え、我々はマウスRNAポリメラーゼIIモノクローナル抗体を用いて、転写調節に関与するクロマチン相互作用を同定しました。これにより、活性プロモーターおよび対応する調節領域の調査が可能となり、効率的かつ協調的な転写の理解につながります。抗体コートビーズから洗浄緩衝液を取り除きます。プレクリア済みクロマチンと抗体コートビーズを混合し、4 °Cで一晩インキュベートします。一晩のインキュベーション後、ビーズを回数分洗浄し、未結合のクロマチンを除去します。その後、ビーズをTE緩衝液で再懸濁し、定量および濃縮確認用に分注します。PaR-C taggingシーケンシングを用いたクロマチン相互作用解析は、高次クロマチン構造の相互作用を大規模にde novo解析するために開発された手法です。クロマチン免疫沈降によって濃縮されたDNA断片を、近接ライゲーションによって捕捉します。CHI-PETライブラリの構築にはパッドおよびタグ戦略が適用され、ハイスループット次世代シーケンシング技術によってシーケンスされます。このビデオでは、CHI-PETライブラリ構築における重要な実験的側面について説明します。ライブラリ構築の前半では、DNA断片が結合しているProtein AまたはGビーズを操作し、酵素と緩衝塩を除去します。各酵素反応後、各洗浄ステップにおいて、緩やかな遠心分離と弾く動作を行ってください。磁性粒子に配置した際にビーズの回収率を最大化するため、上清を数回ピペッティングしてください。反応混合液にビーズを含むすべてのインキュベーションステップでは、コンセントレーターを使用します。あらかじめマスターミックスを調製し、ビーズを均一に再懸濁させた後、最後に酵素を添加してください。インキュベーションの間、ビーズが十分に混合されていることを確認してください。ハーフリンカーオリゴヌクレオチドは、4つのヌクレオチドからなる内部バーコードと、タイプIIS制限酵素MME Iの認識サイトを備えるように設計されています。Cクロマチン複合体中のテザー付きDNA断片にハーフリンカーをライゲーションさせた後、相互作用しているDNA断片は完全なリンカー配列によって連結されます。これらのハーフリンカーは、非特異的なライゲーション産物由来のヘテロ二量体abリンカーを持つ配列、または特異的なライゲーション産物由来のホモ二量体AAまたはBBリンカーを持つ配列を生成します。したがって、異なるヌクレオチドバーコードを持つ2種類のハーフリンカーを使用することで、異なる実験やレプリケートの特定が可能になるとともに、異なるチップ複合体間における非特異的なキメラライゲーション率のモニタリングが可能になります。反応系を氷上でセットアップし、ハーフリンカーを氷上で緩やかに解凍することが重要です。ハーフリンカーを水で十分に混合した後、リガーゼバッファーを含むPEGと混合します。再懸濁させる前に、マスターミックスが十分に混ざっていることを確認してください。ハーフリンカーとチップDNA断片が十分に混合され、ハーフリンカーの連結（コンカテマー化）を防いだ後で、T4 DNAリガーゼを添加してチップDNAを懸濁させます。チューブをパラフィルムで密閉し、16 °Cで回転させながら一晩インキュベートします。その後、SDSを含むバッファーEBを添加して、ビーズから完全なクロマチン複合体を溶出させます。溶出DNAにTriton X-100を加え、SDS濃度を下げてSDSをクエンチします。クロマチン複合体の環状化は、2つのハーフリンカーが相互作用接合部でライゲートされ、完全なリンカー配列が形成されることで促進されます。異なるDNAタンパク質複合体間のライゲーションを最小限に抑えるため、溶出したクロマチン複合体を極めて希釈した条件下でライゲートします。溶出したクロマチン複合体が反応混合液中で十分に希釈された後で、T4 DNAリガーゼを添加してください。逆架橋後、DNA結合タンパク質を除去し、フェノール・クロロホルム抽出を用いて環状化DNA断片を精製します。簡単な分離には、Qiagen PhaseLockゲルシステムを使用してください。フェノール抽出後、ペレットの質量と視認性を高めるためにGlycoBlue A DNAキャリアを使用します。ハーフリンカーオリゴヌクレオチドには、隣接するMmeI認識部位が含まれています。MmeIはタイプIIS制限酵素であり、標的結合部位から18および20塩基対下流を切断することで、クロマチン断片の短いタグを生成し、petsと略されるPETタグリンカータグ構築物を産生します。さらに、各ハーフリンカーは、ストレプトアビジンコート磁気ビーズによるpet構築物の精製を可能にするためにビオチンで修飾されています。MMEによる1回目の消化を行い、タグ付きリンカー構築物を遊離させます。ストレプトアビジンビーズへの選択的結合によりpetを精製し、ハイスループットシーケンシング用のアダプターを用いてpet構築物をライゲーションします。CHI PETライブラリーフュージョンを増幅させるために、fusion DNAポリメラーゼを使用します。DNAポリメラーゼは、高い精度と効率でテンプレートを生成するために使用されます。PCR反応は冷却状態で準備し、最後にfusion DNAポリメラーゼを添加してください。この酵素は3'から5'方向のエキソヌクレアーゼ活性を有しているため、dNTPsが存在しない条件下ではプライマーを分解する可能性があります。charsetライブラリーが正常に構築されていれば、約223 bpの明瞭でくっきりとしたバンドが認められます。ゲルから223 bpのバンドを切り出す際は非特異的バンドを避けるようにし、切り出したバンドをGel Crush Protocolに従って精製してください。ハイスループットシーケンシングの前に、Agilent 2100 bioanalyzerとDNA 1000キットを用いてクオリティチェックを行います。ここでは、ゲノム全域にわたるクロマチン相互作用を非バイアスに検出するためのCHI-PETの手順を実演しました。CHI-PETデータの品質は、使用したチップ抗体の有効性とシーケンシング深度に依存します。ここでは、相互作用マッピングに1800万から2000万リードを使用します。この特定のプロトコルは、ヒトゲノムにおけるエストロゲン受容体およびRNAポリメラーゼによって結合されるクロマチン相互作用ネットワークの特性評価に成功しています。本アッセイは、全ゲノムコンテキストにおける転写生物学の三次元構造に関する今後の研究において、強力なツールになると期待されます。このビデオがお役に立てれば幸いです。ご視聴ありがとうございました。

chromatin-interaction-analysis-with-paired-end-tag-sequencing-chia

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

クロマチン免疫沈降法と超高スループットシーケンシング（チップ-SEQ）の組み合わせは、所定の組織または細胞株におけるタンパク質-DNA相互作用を特定し、マッピングすることができます。概説としては、例えば、転写因子TCF7L2の経験を使用して、その後の配列決定のための高品質のChIPテンプレートを生成する方法である。...

ハイスループットシーケンシングのための高品質クロマチン免疫沈降DNAテンプレート（チップ-SEQ）の生成

生体内でゲノムにどのような影響を与えるかクロマチン制御因子とクロマチンの状態の問題は、細胞運命決定が発生中の胚になっている様子を、早期の我々の理解の鍵である。 ChIPの-SEQ-グローバルレベル-さアフリカツメガエル胚のためにここで概説でクロマチンの機能を調査するための最も一般的なアプローチ。...

クロマチンレギュレータと米国でのゲノムワイドスナップショット<em&gt;アフリカツメガエル</emChIPの-配列によって&gt;胚

クロマチン免疫沈降は、DNAは、インビボでのシロイヌナズナのタンパク質の結合部位を同定するための強力な技術です。この手順は、クロマチン架橋および断片化、目的のタンパク質に対する選択的な抗体を用いた免疫沈降、および結合したDNAの定量PCR分析を含みます。私たちは、シロイヌナズナ植物用に最適化され、単純なChIPアッセイを説明します。...

シロイヌナズナタンパク質-DNA相互作用の同定のための免疫沈降アッセイクロマチン<em&gt;インビボ</em

ミクロコッカスヌクレアーゼ（MNase）融合タンパク質でゲノムワイドのタンパク質結合部位をマッピングするためのクロマチン免疫沈降（ChIP） - 直交方法であるハイスループット配列決定（ChEC-seq）と結合したクロマチン内在性切断について記載する。...

ChEC-seqとのタンパク質 - DNA相互作用のゲノムワイドマッピング<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

ここでは、最適化された高スループット チップ シーケンス プロトコルと冷凍腫瘍組織や細胞からゲノム...

腫瘍組織に高スループット チップ シーケンスを用いたクロマチン状態のゲノム マッピングの統合プラットフォーム

ここでは、チップ Seq を実行する方法について記述して ES 細胞の CARIP-Seq、次世代シーケンシング ライブラリ準備も含めて世界的なエピゲノムとクロマチン関連 RNA...

CARIP Seq とチップ Seq: クロマチン結合 Rna および胚性幹細胞における蛋白質 DNA 相互作用を識別する方法

遺伝子および調節配列の物理的な相互作用の同定が困難な染色体構造をキャプチャする方法によって促進されています。これは 4 C seq プロトコルを修正は PCR テンプレートが過大に増幅を最小限に抑えることによって PCR バイアスを軽減、追加制限の酵素のダイジェスト ステップを組み込むことによって読み取りの mappability...

円の染色体構造の次世代シーケンシングによる遺伝子制御配列の高スループット識別キャプチャ (4 C seq)

タンデム クロマチンのステップバイ ステップ プロトコルについて述べる免疫沈降配列 (tChIP-Seq)...

TChIP-Seq: 細胞型特異エピゲノムのプロファイリング

ゲノム全体のタンパク質結合位置の正確な決定は、遺伝子調節を理解するために重要です。ここでは、クロマチン免疫沈降DNAをエキソヌクレアーゼ消化(ChIP-exo)に続けてハイスループットシーケンシングで処理するゲノムマッピング方法について説明します。この方法は、哺乳類ニューロンにおける近接塩基対マッピング分解能および高いシグナル対雑音比を用いてタンパク質とDNAの相互作用を検出する。...

クロマチン免疫沈降-エキソヌクレアーゼ(ChIP-Exo)を用いたマウス幹細胞由来ニューロンにおけるタンパク質-DNA相互作用の高分解能マッピング

ここでは、L4期 Caenorhabditis elegans...

Caenorhabditis elegans L4幼虫全体におけるクロマチンアクセス性プロファイリング

ここでは、RNA関連のクロマチンDNA-DNA相互作用をキャプチャし、RNA関連の三次元ゲノム組織をマッピングするプロトコルを提示します。...

RNA関連クロマチンDNA-DNA相互作用法

学ぶChIA-PET法によるクロマチン相互作用解析と転写調節機構の理解。クロマチン免疫沈降とライブラリ構築の最適化手法を解説し、ゲノム規模の長距離相互作用解析に役立つ実験プロトコルを提供します。

クロマチンの相互作用のマッピングと転写調節を理解するためのペアエンドタグシーケンシング（CHIA-PET）によるクロマチンの相互作用の解析

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