Name: 細胞内細菌性病原体を持つゼブラフィッシュ胚の感染 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 18 s
Description: 学ぶ ゼブラフィッシュ胚への細菌マイクロ注射法。蛍光標識細菌を用いて、貪食細胞と細菌病原体の相互作用をライブイメージングで観察する技術を習得できます。免疫学研究に有用です。

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著者は、有益な議論のために魚の世話のために、図4、ウルリケNehrdichとデービー·デ·ウィット内の画像、および他のラボメンバーのチャオ崔、フロア·デ·コート氏、エスターのストゥープとラルフ·カルバリョに感謝します。この作品は、経済や教育·文化·科学省のオランダ省、欧州委員会第7次フレームワークプロジェクトZF-HEALTH（健康F4-2010から242048）、欧州マリー·キュリーのスマートミックス·プログラムでサポートされています初期研修ネットワークFishForPharma（PITN-GA-2011から289209）、およびオーストラリアNHMRC（637394）で。オーストラリアの再生医学研究所は、ビクトリア州政府とオーストラリア政府からの補助金によってサポートされています。

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<li>Renshaw, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108, 3976-3978 (2006).</li>
<li>Stoop, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+embryo+screen+for+mycobacterial+genes+involved+in+the+initiation+of+granuloma+formation+reveals+a+newly+identified+ESX-1+component%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Zebrafish embryo screen for mycobacterial genes involved in the initiation of granuloma formation reveals a newly identified ESX-1 component.</a> Dis. Model Mech. 4, 526-536 (2011).</li>
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</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

この資料に記載されている感染方法は、頻繁に自然免疫遺伝子や細菌の病原性遺伝子1の機能を研究するために使用されています。静脈内マイクロインジェクション法（プロトコル5および6.1）は、そのような研究のために最も頻繁に使用されています。後部血島で尾静脈には、1日齢の胚の静脈注射のための最も便利な場所です。尾静脈は後の段階で浸透することはより困難になるにつれ、我々は2-3 DPFにおける胚の静脈内注射部位としてキュビエ管を好む。すべてのケースでは、CFUカウントのためのメッキ注入接種によってチェックされるべき細菌の一貫した数字との胚を注入することが重要です。次の側面は、再現性の注射を達成するために考慮する必要があります。第一に、高品質のガラスマイクロキャピラリー注射針を持っていることが不可欠である。針先が大きすぎる場合は、インジェクションは発生する出血のために十分な大きさの穿刺孔を作成します。注入された細菌は、血液循環の外に流れます。第二に、細菌が血液循環に直接注入する必要があります。針の先端が卵黄嚢の拡張子への注入液のスプレッド静脈内またはそうでない場合であれば、胚は実験から破棄しなければなりません。第三に、Mを注入するためのキャリアとしてPVP40を使用して、 marinumはガラス針に沈んでから細菌を防ぐことに役立ちます。 PVP40は、注射の期間中、より再現性の接種の結果、懸濁液の均質性を向上させます。 PVP40もS.ために使用することができる大きいサイズや細菌の明るい蛍光が実験中に注射接種上のビジュアルコントロールを許可しているので、 ネズミチフス菌の注射が、ここではそれほど重要ではありません。注射を実施するための我々は、フェノールレッド染料（1％v / v）の、または1μmの異なる色（Invitrogen社製）で利用可能な蛍光球の使用をお勧めします。技術が習得されれば、約30 minutを取るESは、アガロースプレート上胚を合わせ、細菌の注入量を調整するために必要な時間を含めて、50から100の胚を注入する。 血島（プロトコル5）に、またはキュビエ（プロトコル6.1）のダクトに静脈内注射が最も一般的に使用されていますが、このビデオ資料に記載されている感染症の代替ルートは、（プロトコル6.2、6.3、マクロファージおよび好中球走化性の研究に有用であることが分かった、および6.4）、弱毒菌株（プロトコル6.5）の成長を研究するために、高スループットアプリケーションのためのゼブラフィッシュ感染モデル（プロトコル6.6）4-8を適応させる。に記載のマイクロインジェクション法もウイルス18、19、真菌の胞子14、20または原生動物の寄生虫（マリアForlenza、私信）の注射のために適用することができます。このビデオ資料に記載されている注射の手続きに便利な付加はzebrに細菌の皮下注射のために最近では説明した手順です。afish胚21。この手順は、組織の表面に効率的に巻き込む細菌に見つかっていたが好中球による細菌の貪食を研究するために適用され、マクロファージとは対照的に、血液中にまたは液体で満たされた体腔への注入時に細菌を貪食することが事実上できませんでした。皮下注射の胚については、このビデオ資料に記載されている尾の筋肉注射の場合と同様に配置されていますが、針が体節を介して細菌を注入するだけで皮膚の下に挿入されます。 マイクロインジェクションは、本質的に感染の人工的なルートであることを考慮することが重要です。しかし、初期の胚は、細菌性病原体に対する外部被曝に対して高い耐性があります。実際には、胚を細菌懸濁液に浸されている液浸アッセイは、我々の手22の再現性はありません。いくつかの胚は、浸漬に感染するかもしれませんが、我々は、死亡率や急行に大きな変化を観察しているこのようなアッセイの個々の胚の間に炎症性マーカー遺伝子のイオン。この資料に記載されているマイクロインジェクション方法は再現性の感染症を達成し、宿主生来の免疫細胞と細菌の相互作用を研究するのに特に有用である。個々の胚で細菌感染を定量化するための効率的なアプローチは、カスタムメイド、専用の画素の定量化ソフトウエア17、23に感染した胚の蛍光画像を分析することです。このアプローチは、感染した胚のめっき後のCFUカウントの結果とよく相関することが示されている。同様に、胚当たりの白血球数の相対的変化は、トランスジェニック白血球フルオロフォアレポーターラインのデジタル画像解析によって定量化されていますが、このアプローチでは感染24〜ホスト白血球産生の反応を定量化するにも適切でしょう。 宿主自然免疫遺伝子の機能について説明し、感染モデルを組み合わせることにより、 生体内で効率的に調べることができますモルホリノノックダウンした。 Morpholinosは、特定のRNAを標的とし、このジャーナル10、25の他のビデオの記事に示されているように、1細胞期のゼブラフィッシュ胚に注入する遺伝子産物の発現を軽減する合成アンチセンスオリゴヌクレオチドである。モルホリノノックダウンの研究では、比較するすべての胚グループは、細菌注射の前に正しく上演されていることを非常に重要である。胚は時間の経過とともにますます有能になる発展途上の免疫システムを持っているので、これは特に重要です。 ゼブラフィッシュ胚では、主要な先天性免疫のサブセット、マクロファージおよび好中球を区別するために現在利用可能ないくつかのトランスジェニックレポーターラインがあります。 MPXとLYZプロモーターは好中球レポーターライン16、26、27を生成するために使用されており、csf1r（FMS）とMPEG1プロモーターは、マクロファージの記者14、28を生成するために使用されました。一方、CSF1R（FMS）は、さらにMPEG1発現がマクロファージで排他的ですが、xanthophoresで表されます。このビデオの記事で示したように、最近開発されたMPEG1レポーターラインはマクロファージによるイメージング細菌貪食のために非常に便利です。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬 </td><td> サプライヤー </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>フェノールレッド</td><td>シグマ</td><td> P0290 </td></tr><tr><td>グリセロール</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> 228210 </td></tr><tr><td> Difco社製ミドル7H10寒天培地</td><td>ベクトン·ディッキンソンアンドカンパニー</td><td> 262710 </td></tr><tr><td> BBLミドルOADC濃縮</td><td>ベクトン·ディッキンソンアンドカンパニー</td><td> 211886 </td></tr><tr><td> Difco社製ミドル7H9ブロス</td><td>ベクトン·ディッキンソンアンドカンパニー</td><td> 271310 </td></tr><tr><td> BBLミドルADCの濃縮</td><td>ベクトン·ディッキンソンアンドカンパニー</td><td> 211887 </td></tr><tr><td>ツイーン80 </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> P1754 </td></tr><tr><td>ポリビニルピロリドン（PVP40） </td><td> Calbiochem社、メルク</td><td> 529504 </td></tr><tr><td> N &lt;/ em&gt;は、フェニルチオ尿素（PTU） </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> P7629 </td></tr><tr><td> 3 - アミノ安息香酸エチルメタンスルホン酸塩（Tricaine） </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> A5040 </td></tr><tr><td>メチルセルロース</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> M0387 </td></tr><tr><td> SeaPlaqueアガロース（低融点アガロース） </td><td>ロンザ社</td><td> 50100 </td></tr><tr><td> FluoSpheres（1.0μmの、赤色蛍光（605分の580）） </td><td>インビトロジェン</td><td> F8821 </td></tr><tr><td> FluoSpheres（1.0μmの黄緑色蛍光（515分の505）） </td><td>インビトロジェン</td><td> F8823 </td></tr></tbody></table>

細胞内細菌性病原体を持つゼブラフィッシュ胚の感染

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

ゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ ）の胚がますます宿主-病原体相互作用の1の脊椎動物の自然免疫系の機能を研究するためのモデルとして使用されています。自然免疫系の主要な細胞型、マクロファージおよび好中球は、免疫応答に必要とされるリンパ球の成熟の前に胚発生の最初の日の間に開発しています。胚の大量入手のしやすさ、外部の開発のために、アクセシビリティ、胚および幼虫の光透過性、遺伝的なツール、トランスジェニックレポーターラインの大規模な変異体リソースやコレクションの広い範囲は、すべてのゼブラフィッシュの汎用性を追加モデル。 サルモネラ血清型Typhimuriumの（ネズミチフス菌）と結核marinumは、マクロファージに細胞内に存在することができ、頻繁にゼブラフィッシュ胚における宿主-病原体相互作用を研究するために使用されます。これら二つの感染過程細菌の病原体は、比較することは興味深いものですので、S.ネズミチフス菌感染症は、M.、一方、1日以内の急性および致命的であるmarinum感染症は慢性的であり、幼虫2、3までイメージングすることができます。胚（ 図1）に細菌の微小注射部位の感染が急速に全身になるか、最初にローカライズされたままかどうかを決定します。急速な全身感染症が直接後部血島で、またはキュビエ、トランク血管系に心を接続する卵黄嚢の広い流通チャネルのダクトを介して尾静脈を介して血液循環にマイクロ注入細菌によって確立することができます。 1 DPFで、この段階で胚がphagocyticallyアクティブマクロファージを持っていますが、好中球はまだ血島に注入し、成熟していない場合が好ましい。 2月3日DPFにおける注射のために、胚は、機能（ミエロペルオキシダーゼ産）好中球を開発しているときは、キュビエのダクトはtとして好ましい彼は、注射部位。ローカル感染症に対する骨髄細胞の指示への移行を検討するため、細菌は、尾の筋肉、耳胞、あるいは後脳室4から6に注入することができます。さらに、脊索、骨髄系細胞に正常にアクセスできないように見える構造は、局所感染、7〜非常に敏感です。ハイスループットアプリケーションのための有用な代替手段は受精後の最初の8時間以内に胚の卵黄への菌の注射である。蛍光マクロファージや好中球と蛍光細菌およびトランスジェニックゼブラフィッシュラインを組み合わせることにより、宿主 - 病原体相互作用のマルチカラーイメージングのための理想的な状況を作成します。このビデオの記事はSでゼブラフィッシュ胚の静脈内投与と局所感染の詳細なプロトコルを記述します。 ネズミチフス菌またはM. marinum細菌と自然免疫系の細胞との相互作用のその後の蛍光イメージングのために。

透明なゼブラフィッシュの胚は、次のような視覚化するための有用なモデルのホストと自然免疫細胞と細胞内細菌性病原体との間の機能的研究の相互作用を、証明している<em&gt;ネズミチフス菌</em&gt;と<em&gt;結核marinum</em&gt;。細菌のマイクロインジェクションやマルチカラー蛍光イメージングは​​、ゼブラフィッシュ胚の感染モデルのアプリケーションに関与する必須の技術です。

ゼブラフィッシュ（Danio rerio）の胚は、宿主と病原体の相互作用における脊椎動物の自然免疫系の機能を研究するためのモデルとして、ますます利用されるようになっています。

この手順の目的は、ゼブラフィッシュの胚に蛍光標識細菌をマイクロインジェクションし、宿主の免疫細胞との相互作用をライブイメージングすることです。まず、注射針を準備し、細菌懸濁液を充填します。次に、胚のステージを判定し、インジェクションプレート上に整列させます。次に、局所的または全身的な細菌感染を誘導するための経路を用いて、細菌接種液を注入します。最後に、胚をマウントし、イメージングを行います。これにより、蛍光および共焦点顕微鏡を用いて、透明なゼブラフィッシュ胚ホストの蛍光食細胞内における細菌病原体の細胞内局在を示す結果を得ることができます。ゼブラフィッシュ胚モデルは、宿主と病原体の相互作用をライブイメージングする上で非常に強力であるため、この手法は免疫学分野における重要な疑問への解答に寄与します。一般的に、全身感染のためにゼブラフィッシュ胚の血流へ、あるいは局所感染を達成するために特定のコンパートメントへ、細菌を再現性高くマイクロインジェクションするためには多大な練習が必要であり、この手法に不慣れな方は苦労することがあります。ガラス製マイクロキャピラリーニードルを抽出し、先端を45度に面取りした後、一定の血流があることを確認して、受精後28時間のゼブラフィッシュ胚をステージ上に配置します。眼に色素沈着が始まり、尾がまっすぐで、心臓が眼のすぐ腹側に位置していることを確認してください。胚を麻酔した後、マイクロローダーチップを使用して、あらかじめ調製した細菌接種液を針に充填します。充填した針をスタンドに接続されたマイクロマニピュレーターに取り付け、実体顕微鏡の下に配置します。注入時間を0.2秒に、補正圧を15 Hector Pascalsに設定します。使用する針に対して適切な注入量を得るために、注入圧を700から900 Hector Pascalsの間で調整します。注入前に、針を装着したマイクロマニピュレーターを適切な位置にセットします。麻酔をかけた胚を平らな1%agarose注入プレート上に配置し、余分な卵水を取り除きます。次に、ヘアループツールを使用して、各注入に向けて胚を整列させます。注入中はプレートを手で動かし、胚の尾が針先に向くように方向を調整します。針先を、尿生殖腔に近い尾側静脈の直上に配置します。針先で周皮を貫通させ、所定用量の蛍光標識細菌を注入します。本手法では、Salmonella typhimuriumを約250 CFU（コロニー形成単位）、Mycobacterium marumを約120 CFU使用しています。注入が正しく行われれば、注入直後に血管系の体積が拡大することを確認でき、注入された細菌懸濁液は後大静脈を通じて心臓に向かって血流に沿って流れます。実験中、注入量が一定に保たれているか頻繁に確認してください。実験全体を通して注入の整合性を確認するためのコントロールとして、細菌の液滴を細菌増殖培地上の滅菌PBSの液滴に直接注入します。およそ30個の胚に注入するごとに、この液滴をプレートに塗り広げ、培養後に細菌コロニー数をカウントしてください。注入量中のCFUを決定するために、蛍光実体顕微鏡を用いて、注入直後に血流中を循環している個々の蛍光標識styria細胞を観察し、適切に注入されていない胚は廃棄します。M marum細菌の蛍光凝集塊は、感染後2日までに視認でき、時間の経過とともに大きくなります。クビエ管に注入するには、受精後2〜3日の胚を麻酔して並べます。胚の背面から45度の角度で心静脈（coddle vein）に注入する場合、針をクビエ管（duct of cuvier）の始点に刺入します。後脳脳室への注入位置については、クビエ管が卵黄嚢に向かって広がり始める部位の直背側に刺入します。受精後32時間の胚を、背面を針先に向けた状態で麻酔してください。針を前方の位置から後脳室に挿入し、神経系の組織に触れないようにして尾部の筋肉に注入します。麻酔をかけた受精後1〜2日の胚を、尾が針先に向くように配置し、針を約65度の角度にセットして、耳胞注入のために尿生殖腔上の筋肉に注入します。麻酔をかけた受精後2〜3日の胚を、尾が針に向くように配置します。針を65度の角度で、低圧で注入し、受精後1〜2日の胚のノードコード（節索）に注入します。胚の尾が針とは反対方向を向くように配置してください。針を尾の筋肉組織を通してコード内に挿入します。16〜1000細胞期の胚への卵黄注入を行う際は、針を絨毛膜（corion）に通して卵黄の中心に刺し、注入を行う。注入後の胚を、tricaを含む卵水で満たした1%のaugurous層付きペトリ皿内で麻酔させる。ヘアループツールを用いて、蛍光実体顕微鏡下での撮像に適した位置に胚を調整する。注入直後、血流中を循環する個々の蛍光標識T細胞を観察できます。側面観とは異なる方向からの観察が必要な場合は、胚を1.5%メチルセルロースに固定し、ヘアループツールを用いて胚を任意の方向へ操作し、倒立共焦点顕微鏡で感染部位をイメージングします。低融点Aerosをガラスボトムディッシュに一滴滴下します。麻酔した胚を少量の卵水とともにAerosの滴に置き、ヘアループツールを用いて胚を適切な位置に調整します。Aerosを凝固させ、Tricaを含む卵水にAerosの滴を浸します。サンプルは、受精後1日の胚の血管島へ Salmonella typhimurium または Mycobacterium marinum 細菌を注入し、共焦点イメージングを行う準備が整いました。受精後、マクロファージによる急速な食作用が起こります。比較的大きく、明るい蛍光を持つ Ds.Red ラベル済み S. typhimurium 細菌の播種は、感染後2時間でステレオ蛍光イメージングおよび共焦点イメージングを用いて直接観察できます。これにより、多くの細菌が蛍光標識されたマクロファージによって食作用を受けていることが示されます。野生型 styria を 250 CFU 投与すると、強力な炎症性反応が誘導され、1日以内に致死となります。対照的に、erum を静脈内投与すると持続性感染が引き起こされ、感染したマクロファージが密な凝集体を形成します。これは結核の特徴である肉芽腫の初期段階と考えられています。感染から5日後の transgene EG one EGFP 株におけるこのような肉芽腫様凝集体の共焦点イメージングでは、m cherry で標識された M num 細菌の細胞内増殖が認められます。緑色蛍光マクロファージが存在する中で、細菌を後脳室に注入することができます。この部位は受精後32時間時点ではマクロファージが存在しない区画です。この区画に20から100 MのmCherry標識M. marum細菌を注入すると、ここに示すように、マクロファージが急速に浸潤し、細菌を貪食します。トランスジェニックM-P-X-E-G-F-Pを用いることで、耳胞に約20 CFUのStyriaを注入すると、感染後3時間で好中球が誘引されます。この反応はPBSコントロール注入では観察されませんが、白血球の浸潤に耐性があると思われる脊索は、他の組織に注入した場合には強く減毒されるerum変異株の増殖が許容される区画となっています。2240 CFUのerum細菌を卵黄に注入した後、数日かけて細菌が胚組織に広がり、従来の静脈注射法で観察されるものと同様の肉芽腫様凝集体を形成します。この手順を行う際は、胚の免疫系が発達に伴い徐々に機能的に成熟するため、ゼブラフィッシュ胚の正確なステージングが極めて重要であることに留意してください。この手順に従い、胚の自然免疫系が病原体感染にどのように反応するかといった追加の疑問を明らかにするために、トランスクリプトームプロファイリングや免疫組織化学などの他の手法を実施することができます。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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細胞内細菌性病原体を持つゼブラフィッシュ胚の感染

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