細胞内細菌性病原体を持つゼブラフィッシュ胚の感染

この手順の全体的な目標は、ゼブラフィッシュの胚に蛍光細菌をマイクロインジェクションして、宿主免疫細胞との相互作用をライブイメージングすることです。これは、最初に注射針に細菌懸濁液を準備してロードすることによって達成されます。次に、胚をステージングし、注入プレート上に整列させます。

次に、細菌接種物は、局所的または全身的な細菌感染を達成するためのルートを使用して注入されます。最後に、胚をマウントし、胚を画像化します。最終的には、蛍光顕微鏡と共焦点顕微鏡により、透明なゼブラフィッシュの胚性宿主の蛍光食細胞内の細菌性病原体の細胞内局在を示す結果を得ることができます。

この方法は、ゼブラフィッシュ胚モデルが宿主病原体相互作用の生命イメージングに非常に強力であるため、免疫学分野での重要な質問に答えるのに役立ちます。一般的に、この方法に不慣れな個人は、全身感染のためにゼブラフィッシュ胚の血液循環に細菌を再現性よくマイクロ注入したり、局所感染を達成するために特定のコンパートメントに細菌を注入したりするために多くの練習が必要なため、苦労します。ガラス製のマイクロキャピラリー針を引っ張り、先端を45度の角度に面取りした後、受精後28時間でゼブラフィッシュの胚をステージングし、血液循環が一貫していることを確認します。目の色素沈着の始まり、まっすぐな尾、そして心臓が目のちょうど腹側に位置していること。

胚に麻酔をかけたら、マイクロローダーチップを使用して、事前に準備した細菌接種物を針にロードします。ロードした針をスタンドに接続されたマイクロマニピュレーターに取り付け、実体顕微鏡下に置きます。射出時間を 0.2 秒に、補正圧力を 15 Hector Pascals に設定します。

注入圧力を700〜900ヘクターパスカルの間で調整して、使用する針の正しい注入量を取得します。注入する前に、針を装填したマイクロマニピュレーターを正しい位置にセットします。麻酔をかけた胚を平らな1%アガロース注入プレートに置き、余分な卵水を取り除きます。

次に、ヘアループツールを使用して、各注入の胚を並べます。注入中はプレートを手で動かして、胚の尾が針先を向くように胚の向きを合わせます。針先を泌尿生殖器の開口部に近い甘えん坊静脈の真上に置きます。

針先で皮周囲を突き刺し、蛍光標識された細菌を所望の用量で注入します。私たちは、約250のコロニー形成単位またはCFUのサルモネラ菌チフス菌と約120のCFUのマイコバクテリウムマルムを使用しています。注射された細菌懸濁液は、パルスの直後に血管系の体積が拡大しているかどうかを確認することにより、注射が正しく行われた場合、甘えん坊静脈を通って心臓モニターに向かう血流を追跡します。

実験中に注入量が同じままであることを頻繁に確認してください。実験全体を通して注射の一貫性を制御するには、細菌増殖培地上の滅菌PBSの滴に直接細菌を一滴注入します。約30回目の胚注入ごとに、このドロップをプレートアウトし、インキュベーション後の細菌コロニーを数えます。

注入量中のCFUを決定するには、蛍光実体顕微鏡を使用して、注入直後に血流中を循環する個々の蛍光シュタイリッシュマルク細胞を観察し、適切に注入されていない胚を廃棄します。M marum細菌の蛍光凝集体は、感染後2日までに見えるようになり、時間の経過とともに大きくなります。キュビエの管に注入するには、受精後2〜3日で胚を麻酔します。

胚の背側から45度の角度で胚静脈注入を行う場合は、キュビエの管の始点に針を差し込みます。後脳心室注射位置のために、管が卵黄嚢の上に広がり始める位置のすぐ背側。受精後32時間で、胚の背側を針先に向けて麻酔します。

ニューロヘリウムに触れることなく、前方の位置から後脳室に針を挿入して尾筋に注入します。受精後1〜2日で麻酔をかけた胚の尾を針先に向けて、針を約65度の角度にして、泌尿生殖器開口部の上の筋肉に注入して耳小胞を注入します。受精胚の2〜3日後に、尾を針に向けて麻酔

65度の角度で低圧で注入し、1〜2日でノードコードに注入します。尾が針から離れている向きの受精後の胚。針を尾筋組織を通してコードに挿入します。

16〜1000細胞期の胚の卵黄注入では、コリオンを通して針を突き刺して卵黄の中心に感染を画像化します。トリカを含む卵水で覆われた1%の層状のペトリ皿で感染した胚を麻酔します。ヘアループツールを使用して、蛍光実体顕微鏡下でイメージングするための正しい位置に胚を位置合わせしました。

個々の蛍光細胞は、注射直後に血流中を循環しているのを観察できます。側面図とは異なる位置が必要な場合。胚を1.5%メチルセルロースにマウントし、ヘアループツールを使用して胚を必要な位置に操作し、倒立共焦点顕微鏡を使用して感染を画像化します。

ガラス底の皿に低融点のエアロを一滴垂らします。麻酔をかけた胚を限られた量の卵水でエアロドロップに入れ、ヘアループツールを使用して胚を所定の位置に操作します。エアロを固め、エアロドロップをトリカを含む卵水に沈めます。

サンプルは、サルモネラ菌チフス菌またはマイコバクテリウム・マルム菌を胚の血液島に1日で共焦点イメージング注射する準備が整いました。受精後は、比較的大きくて明るく蛍光的なDSのマクロファージ播種による急速な食作用をもたらします。赤色標識のシュタイアーマルク菌は、ステレオ蛍光と共焦点イメージングで2時間で直接イメージングできます。感染後、多くの細菌が蛍光マクロファージによって食作用していることが示されています。

野生型シュタイアーマルクの250CFUの注射用量は、強力な炎症誘発反応を誘発し、1日以内に致死的です。.対照的に、ERMの静脈内注射は、感染したマクロファージが結核の特徴である肉芽腫の初期段階と見なされる密集体を形成する持続的な感染につながります。トランスジェニックEG one EGFP株におけるこのような肉芽腫様凝集体の共焦点イメージングは、感染後5日目にm cherry 標識されたM num細菌の細胞内増殖を示しています。

緑色蛍光マクロファージの内部では、細菌は、受精後32時間でマクロファージが存在しないコンパートメントである脳室後部に注入することができ、このコンパートメントに20〜100Mチェリー標識Mマルム細菌を注入すると、ここに示すように細菌を食作用するマクロファージによる急速な浸潤につながります。トランスジェニックM-P-X-E-G-F-Pを使用して、約20CFUのStyriaを耳小胞に注入すると、感染後3時間で好中球が引き寄せられます。この応答はPBSコントロール注射では観察されませんが、白血球による浸潤に抵抗性があるように見える脊索は、他の組織に注入すると強く減衰するエルム変異体の成長に対する許容コンパートメントです。

2240 CFUの用量のヨーク注射後、エルム細菌は数日間にわたって胚組織に広がり、凝集体のような肉芽腫を形成します。従来の静脈内注射法で観察されるものと同様です。この手順を試みる際には、発生中に胚の免疫系がますます有能になるため、ゼブラフィッシュの胚の適切な病期分類が重要であることを覚えておくことが重要です。

この手順に続いて、トランスクリプトームプロファイリングや免疫組織化学などの他の方法を実行して、胚性自然免疫系が病原性感染にどのように反応するかなどの追加の質問に答えることができます。