正常なヒト脳内の可溶性および不溶性のPrPオリゴマーの分離

本手順の目的は、正常なヒト脳のすべての靭帯から、可溶性および不溶性のプリオンタンパク質（PRP）を単離することです。まず、ヒト脳組織をホモジナイズして画分を分離し、次に、ショ糖ステップ勾配による速度沈降法を行います。

次に、サイズ排除クロマトグラフィーを行います。最後に、PRPをgene five protein（G5P）でキャプチャします。最終的に、ショ糖ステップ勾配超遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー、およびG5PによるPRPのキャプチャを通じて、正常なヒト脳から可溶性および不溶性のPRPまたはリガメントを単離できるという結果が得られます。この手法は、クロイツフェルト・ヤコブ病、Bovine spongiform encephalopathy、および臨床的な消耗性疾患を含むプリオン病の研究における重要な疑問への回答に寄与します。さらに、プリオン疾患だけでなく、アルツハイマー病やパーキンソン病などの他の疾患における可溶性および不溶性タンパク質凝集体の単離に関する洞察を提供することができます。

一般的に、これらの手法に不慣れな方は、すべての実験ステップが重要であり、細心の注意を要するため、困難に直面することがあります。SEC Fiの深度やG five Pを用いたPRPキャプチャーといったステップは、言葉で説明することが難しく、より精密な操作が行われなければ十分な結果が得られない可能性があるため、ビデオによる実演が不可欠です。脳ホモジネートを調製するには、まず電動ペッスルを用いて、凍結した脳組織100 mgに溶解バッファー100 µLを加え、氷上で組織をホモジナイズし、ドライアイスで5分間凍結させた後、再度ホモジナイズします。

溶解バッファーをそれぞれ 300 µL または 800 µL 加えて、20% または 10% の全脳ホモジネートを調製します。ベンチトップ遠心機を用い、ホモジネートを 4 °C、1000 G で 10 分間遠心分離します。S SW 55 ローターを備えた遠心機を用いて、S1 分画を 4 °C、35,000 RPM で 1 時間遠心分離し、SNA を回収します。

上清を清潔なチューブに移します。ウェスタンブロット用の試料を調製するため、界面活性剤不溶性ペレットを溶解バッファーに再懸濁させます。S2画分およびP2画分に50 µg/mLのproteinase Kを加え、37 °Cで1時間インキュベートします。

5 mMのPMSFとSDSサンプルバッファーを加えて消化反応を停止させます。サンプルを10分間煮沸し、室温で5分間冷却します。速度沈降法を行うには、まず5 mL遠心チューブ内で、20% S1分画 450 µLと等量の2% Sarco X水を氷上で30分間インキュベートします。60%、30%、25%、20%、15%、10%のスクロースをそれぞれ0.5 mLずつ加えます。インキュベートしたS1 0.4 mLを、10〜60%スクロース密度の最上層にロードします。

SW 55ローターを用い、チューブ上部から4°Cで48,000 RPMで1時間、ステップ勾配遠心分離を行います。283 µLずつの等量分画を12分画回収します。各分画から20 µLを分取し、等量のSDSサンプルバッファーを加えます。

SDS-PAGEゲルのサンプルを調製します。サンプルを10分間煮沸し、その後4分間冷却します。サンプルを1000 Gで1分間遠心分離します。

その後、ボルテックスで混合し、プリキャストのサイズ排除ゲルにロードします。PRP分子のオリゴマー状態を決定するためにクロマトグラフィーを用います。まず、7種類の個別の分子量マーカーを200 µLずつ、Superdex 200 HRビーズを用いた1×30カラムにロードすることから始めてください。

ブルーデキストランの溶出量空隙容量として使用します。クロマトグラムと分画回収量から、VEのピーク溶出量を算出します。分配係数KAVを、式 KAV = (V - V zero) / (VT - V zero) を用いて算出します。

検量線を作成します。タンパク質標準品のKAVを、標準品の分子量の対数に対してプロットします。次に、0.25 milliliters per minuteの流速で、S oneを200 microlitersカラムに適用します。

カラムを1%cile溶解バッファーで洗浄し、フラクションコレクターを用いて0.25 mLずつ溶出させます。各フラクションから125 µLを分取し、-20 °Cで予冷した500 µLのメタノールと共に2時間インキュベートします。サンプルを4 °C、13,000 ×gで30分間遠心分離します。

ペレットを20 µLのSDSサンプルバッファーで再懸濁し、10分間沸騰させます。室温まで冷却した後、15%ポリアクリルアミドゲルで分離します。標準曲線を用いて、磁気ビーズにG5P分子を結合させるために回収した各種PRP種の分子量を外挿します。

100 µgのG five Pを、1 mLのPBSに含まれる350 µLのtoci活性化磁気ビーズとともに、37 °Cで20時間インキュベートします。外部磁石を用いてG five Pビーズをエッペンドルフチューブの側壁に集め、溶液を除去します。非特異的結合をブロックするため、ビーズを1 mLの0.1% BSA含有PBSで3回洗浄します。

G5P結合ビーズを、0.1% BSA含有0.2 M Tris-HCl (pH 7.4) 1 mL中で、37 °Cで5時間インキュベートします。その後、ビーズを3回洗浄します。最後の洗浄液を除去し、PRPを分離するためにPBS 1 mLを加えます。S1またはP2 100 µLとG5B結合ビーズ 60 µLを、結合バッファー 1 mL中で、室温にて絶えず回転させながら3時間インキュベートします。

チューブをマグネットの上に置きます。溶液を除去し、洗浄バッファーでビーズを3回洗浄します。最後の洗浄液を除去し、SDSサンプルバッファーを加えます。

ビーズを95°Cで5分間加熱します。サンプルを15%プリキャストゲルにロードし、150 Vで約80分間電気泳動を行います。メンブレンを5%ミルク含有TBSTでブロッキングした後、タンパク質を70 Vで2時間かけてPVDF膜へ転写します。

PRP抗体と共に室温で2時間インキュベートします。3F4、1E4、anti-Nまたはanti-Cを用います。HRP標識二次抗体でインキュベートした後、メーカーの指示に従ってメンブレンを化学発光溶液で処理し、ここに示すようにフィルムに感光させます。散在性クロイツフェルト・ヤコブ病（sCJD）のサンプルと比較して、正常脳のP2画分において少量の不溶性細胞PRPが検出されました。

しかしながら、大部分はS2画分で回収されました。不溶性PRPは、フルレングスおよび末端欠損種を含む全PRPの約5〜25%を占めています。スクロースステップ勾配沈降法を用いた解析により、非CJD脳由来のPRPCの大部分は上層画分（1〜3）で回収された一方で、通常は巨大凝集体が含まれる下層画分（9〜11）からも少量のPRPが検出されたことが明らかになりました。病原性PRPまたはPRPSC種には、モノマーから多岐にわたる形態が存在します。

CRUT弁やkup病を患った脳において、ゲルろ過により、より小さなリガメントとより大きな凝集体が分離されました。驚くべきことに、2000 kilodaltonsを超える分子量を持つ大きな凝集体が少量、正常な脳の不溶性画分からも検出されました。さらに、PRPCのダイマーおよびテトラマーは、不溶性画分だけでなく、不溶性画分においても検出されました。

PKおよびPNGase処理後、G5Pによって捕捉されたPRPを、PRP 97 1 0 5 3に対する1E4抗体を用いて検出した。PRP*20、PRP*19、およびPRP*7と称されるPK耐性コアフラグメントが、それぞれ20 kDa、19 kDa、および7 kDaの位置に検出された。

しかし、1E4抗体を1E4エピトープと同一の配列を持つ合成ペプチドと事前にインキュベートすると、PRPは検出されませんでした。このことは、1E4によって検出されたバンドがPRP断片であることを示しています。抗C抗体は、約18 kilodaltonsおよび約12 to 13 kilodaltons付近に移動する2つの異なるPRP断片を検出しました。PRP ETE 20法に加えて。

この手法は、適切に実施すれば4日間で完了させることができます。このビデオを視聴することで、ヒト脳下部における可溶性および不溶性のPRPポリマーを、その形成後に分離する方法について十分に理解できるはずです。この手法は、脳内におけるPIPの確証情報を探索するための、その運命に関する研究への道を開きました。