Name: 甲殻類との長期致死毒性試験アルテミアfranciscana /em (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 40 s
Description: 学ぶ Artemia franciscanaを用いた14日間長期致死毒性試験の標準化プロトコル。化学物質や産業廃棄物の海洋生態系への影響評価に有用な環境毒性学的手法を確立し、環境モニタリングに貢献します。

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環境保護や研究のための研究所のLoredana Manfra（環境品質監視のイスプラ·専攻）と環境保護のための地域機関（エミリアロマーニャ、イタリア）のフェデリカSavorelliによって生成された。 生物学的方法グループ内のアルテミア甲殻類のサブワーキンググループのリファレンスメンバー-水の品質に及ぼす塩水/ UNICHIM委員会の汽水と土砂（化学部門の技術標準オペレーティング·システム用の研究所）。 イスプラのマルコPisapia（Webユニット）によるビデオ撮影と編集。 アンナ·マリア·キケロとイスプラのエリカMagaletti（環境品質監視科）による生産調整。 海水/汽水 - 私たちは、エミリアロマーニャの環境保護、フェラーラ支店、生物学的方法グループの地域の代理店に感謝したいと思いますロセラボスコロとその財政支援のためのイスプラのマッシモGabellini（予防と影響の緩和科）;ファビオMatassaとロンドンの水質とルチアナミリオレ、彼らの協力のためのイビストルヴェルガータ大学（ローマ）のUNICHIM委員会の水と土砂彼らの言語サポートのためにローマの言語の学校。

1。メソッドは、標準我々のテストは、14日間暴露し、定義された条件を満たす生物の50％（LC 50）の死を引き起こす濃度または希釈濃度を決定する目的のために物質濃度や試験サンプルの間隔にアルテミア幼生を公開することが含まれこの方法による。必要かつ可能であれば、以下も決定することができる。）露出した生物の20％（LC 20）の死を引き起こす濃度レベルと、b）のそれよりも高い死亡率を決定するものではありません最高の分析濃度レベルネガティブコントロール（NOEC）、14日後に、決定する最低試験濃度レベル、ネガティブコントロール（LOEC）のそれよりも高い死亡率。 2。材料試験 2.1 アルテミアの卵テストを実行するには、 アルテミアfranciscana </em古い48時間未満の&gt;幼虫は（ノープリウス）が新たに孵化した卵5から得られた、ステージIIまたはIIIで、要求されます。テストをサポートするために利用認定卵や嚢胞は品質保証研究部門、米国環境保護庁、シンシナティOH 45268、米国や水生汚染の生物学的研究のための研究所から、ゲント大学、ベルギー、例えば、市販されている。 2.2水の希釈合成塩水が認識され、分析品質の試薬または蒸留水または脱イオン水に市販の製剤を溶解して調製し、希釈水として使用することができます。理想的な海水を作成するための塩のブレンドは、 インスタントオーシャン混合物を 、例えば、市販されている。それは35（±2）に等しい塩分希釈水をお勧めしますPSUと同様に彩度の値の80％以上の溶存酸素濃度と温度25（±2）＆度、C. 48時間、少なくとも0.45μmの多孔度を有するフィルターでろ過するための曝気した後、希釈は0〜4℃の温度で、暗所で、最大30日間保存することができる 2.3藻類の培養 2.0x10 6細胞/ mlに-それは、試験生物は、指数関数的に成長し、1.3×10 6の密度に達するDunaliella tertiolecta微細藻類を餌であることをお勧めします。環境サンプルのテストは、2.0x10 6細胞/ mlの6より高い密度の文化を必要とします。それは（30（±2）PSU、20（±1）℃）Dunaliella tertiolectaは、海水を含む培養培地中で成長することが示唆された必須栄養素、ミネラル、ビタミンを加えた。藻類の培地組成と準備に関するいくつかの兆候は、付録に報告されています。初期細胞密度は約10 5細胞/ mlであることが示唆されています。藻類の培養は、内に保持され20部屋のサーモスタット（±1）℃、蛍光灯3000（±300）LX、闇の8時間に光の16時間の光周期比で照らさ。 他の植物プランクトン種が、また給紙を使用することができるが、それはDunaliella tertiolectaに&quot;同等&quot;の種を見つけるために、これらの植物プランクトン種との比較研究を行うことが必要となるため、実験条件（例えば、初期細胞密度、光照射、温度、組成物培地と露光時間）は、植物プランクトンの種によって異なります。別の汚染物質への耐性微細藻類のほかにも、 アルテミアへの植物プランクトンへの影響の成長と発展に汚染物質の影響するため考慮する必要があります。 2.4参照物質このテストでは、参照物質は、ドデシル硫酸ナトリウムです。 2.5実験室ガラス製品<ol><li> 100ミリリットルホウケイ酸ガラスビーカー（18ソリューションを転送するためのテストと18を実行する）を含むテストコンテナ。 </li><li>標準溶液を調製するためのフラスコ（500 mlフラスコ）。 </li><li>試験溶液を調製するための6つのフラスコ（例えば、200 mlのフラスコ）。 </li><li>嚢胞を活性化し、孵化皿からテストコンテナにアルテミアを転送するために使用される取り外し可能なカバー付きガラスやポリスチレン5cmの直径ペトリ皿。 </li><li>ノープリウスを転送するためのガラスパスツールピペット（炎で丸めヒント付き）。 </li><li>ガラスカニューレまたはアルテミアを転送するためのパスツールピペット3ミリリットル使い捨てのプラスチックピペット（カットする）。 </li><li>試験溶液を調製するためにマイクロピペットとメスピペット。 </li><li>フラスコからtにテストソリューションを転送するための6つのメスシリンダー（例えば、50mlのシリンダ）彼はコンテナをテストする。 </li></ol> 3。嚢胞のアクティベーション 3.1。嚢胞+注ぐ水を含むペトリ皿試験生物を生成するには、嚢胞の20 mgを48時間テストの前に希釈水12ミリリットルを含むペトリ皿に置かれます。 3.2。光の中で、暗所でインキュベーションペトリ皿は、一時間のために25（±2）℃、4000（±1000）ルクス（平方メートルあたりのルーメン）の光強度で維持されます。 3.3。顕微鏡を用いて培地を交換する 24時間後、孵化幼虫は人工的な水で満たされた新しいペトリ皿に転送されます。転送が孵化、屈光性幼虫は、光ビームに向かって移動するように、すなわち光源を使用して、顕微鏡を使用して行われます。ガラスパスツールピペットは、その唯一の新生幼虫がARを確保するため、転送を行うために使用されますeが膜に残って嚢胞や幼虫を転送しません。 3.4。暗闇の中でインキュベーション幼虫を含んだ料理は25℃で24時間、暗所恒温槽（±2）℃に置かれ 4。試験溶液の調製 4.1。物質+フラスコへの転送を量るそれは、テスト物質の標準溶液を500 mlのフラスコ中の物質0.5gを溶解して調製することをお勧めします。フラスコを脱イオン水または蒸留水を充填されており、試験物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌されています。ソリューションは、それは物質が溶液中で安定しているかどうかは知られていない限り、使用時に準備する必要があります。その場合には、標準溶液は、試験前に2日以内に調製することができる。 4.2。希釈水と藻wiを追加して、ネガティブコントロールの準備10ミリリットルピペット番目ネガティブコントロールは、10 5細胞/ mlの密度が得られるように希釈水に藻類懸濁液の一部を追加することにより、フラスコ（例えば200ミリリットルの容積）で調製されています。 4.3。テストソリューションの準備：希釈水、藻類及び標準溶液を加えるそれは、テストソリューションは、テストのための所望の濃度が得られるように指定した量の希釈水に標準溶液を添加することにより5 200ミリリットルのフラスコで調製されることをお勧めします。生物を養うために、Dunaliella tertiolecta微細藻類懸濁液のアリコートを、テスト·ソリューションが用意されて10 5細胞/ mlの密度に到達するために使用して追加することができます。また、次の順序が推奨されます。希釈水、藻類懸濁液および標準のソリューションを提供します。試験溶液の調製後、彼らはできるだけ早くアッセイに使用する必要があります。 4.4。フラスコからテストコンテナには、ペトリ皿に移すソリューションテストソリューションの等量（50ml）をメスシリンダーを利用した試験容器に導入されています。各濃度の3つのレプリカが作られています。テストの各シリーズでは、コントロールコンテナは、テスト·ソリューションの体積に等しい希釈水の量で用意されています。試験溶液の等量（約12 ml）をペトリ皿に導入される。テストの各シリーズでは、コントロールのペトリ皿を使用しています。 5。テストの準備 5.1。 II-IIIの段階でノープリウス嚢胞のアクティベーション48時間後、ノープリウスは、II-III幼虫の段階に到達してから、テストのために使用できます。 5.2。顕微鏡を用いてペトリ皿にノープリウス転送嚢胞に使用されるペトリ皿<html>活性化は、恒温槽から取り出しています。幼虫は少量の制御とテストソリューションを含むペトリ皿に転送されます。このタスクでは、生物が破損しないように十分に広い直径のピペットを利用した顕微鏡で実行されることになっている。テストのこのフェーズでは、転送がガラスパスツールピペット（炎で丸め先端）と集計するアルテミアを奨励して横方向に配置されたライトソースで実行されるかもしれません。 5.3。顕微鏡を使用してテストコンテナへのペトリ皿からノープリウス転送十幼虫は、テストソリューションのペトリ皿からテストコンテナに転送されます。また、この操作は、パスツールピペットや顕微鏡を利用することによって実行する必要があります。それは1 mLを超えないボリュームは、テスト·システム全体の音量に影響を与えない幼虫の通過中に転送されることをお勧めします。 パラフィルムで覆われてe_step &quot;&gt; 5.4。フルコンテナテストのビーカーをパラフィルム（空気通路のギャップを残して）で覆われ、25℃の温度で維持されている（±2）℃試験の全期間、900の照明で（±100）日長とLX暗闇の10時間への光の14時間の比率。 6。ミディアムとフードサプリメントを交換する 6.1。生存率の制御テストが開始された二日後、その5、7、9、12日後に、 アルテミアは、生存率を確認し、培地と栄養補助食品を置き換えるために顕微鏡下で観察されています。 生菌数は、各試験容器内にカウントされます。顕微鏡下で観察し、わずかに機械的刺激後（ガラスパスツールピペットで幼虫を触るなど）約10秒のためのいくつかの動きを表示しない生物econdsは死んだと見なされるべきである。 6.2。マイクロピペットを使用してテストする物質の10 mlのピ​​ペットとサンプリングと藻類のサンプリングを示す試験溶液の調製。フラスコからテストコンテナへの転送ソリューションテスト中、テストソリューションは、定期的に交換し、それらが使用されるのと同じ日に準備する必要があります。試験溶液を予め調製した標準溶液から作られています。 つの新しいコンテナに古いテストコンテナから6.3。 アルテミア転送 、カットパスツールピペットを利用して、 アルテミアの転送は、そのような生物を傷つけないように十分に広い直径をピペットを用いて行われる。このフェーズでは、3ミリリットルプラスチック製パスツールピペットは（カットする）を使用することができます。 6.4。ライブまたは死んだアルテミアを含むビーカーの幼虫 1の後<html>テストの終わりに露出の4日間は、幼虫の生存数をカウントし、ワークシートに記録されます。 14日目のLC 50および/ ​​またはLC 20、NOECおよびLOECは、計算されたと記録されたほか、95％信頼限界を必要に応じて、計算方法をされています。 7。代表的な結果テスト（14日）の終わりには、次の式に従って、各濃度での死亡率の割合を計算します。 （M、S / N）* 100 ここで、 M sは 、分析試料中に死亡した個体数の平均値です Nは、曝露した人の総数です。 表1レポートドデシル硫酸ナトリウムにさらされたアルテミアとテスト（14D）のデータの例を。 <table border="1"><tbody><tr><td> 濃度（mg / l）の </td>各レプリカで死亡した個人の &quot;&gt; 数 </td><td> 死亡率（％） </td></tr><tr><td></td><td> 私は </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> 負の制御 </td><td> 0 </td><td> 2 </td><td> 1 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 1.56 </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 0 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 3.12 </td><td> 2 </td><td> 0 </td><td> 2 </td><td> 13 </td></tr><tr><td> 6.25 </td><td> 3 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 27 </td></tr><tr><td> 12.5 </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> 10 </td><td> 90 </td></tr><tr><td> 25.0 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 50.0 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 100 </td></tr></tbody></table>また、決定するグラフィカルガウス対数プロットするか、適切な統計的手法（例えばスピアマン-Karberまたはプロビット法）を用いてLC 50値を返します。表1のデータのためのLC 50の計算は、8.18（7.15から9.37）mg / Lである。最大濃度は50％の低死亡率の原因となった試験を行った場合、あなたは、信頼できない、あるいは非計算になるLC 50値の計算に進むべきではありません。ただし、この場合、試験濃度の範囲を拡張することにより、テストを繰り返すことが適切であろう。また、LC 50値はより正確に最高濃度よりも大きいように表現されている可能性が試験した最高濃度と効果なしに対応した最高濃度で死亡率の割合を示す、テストされています。 以下の条件をテストの終了時に満たされている場合、結果は有効とみなされています。 <ol class="lalpha"><li>コントロールの平均死亡率≤20％です。 </li><li>ドデシル硫酸ナトリウムを使用して、どこに、14日間のLC 50は 8.0（±5）mg / lの区間に含まれています。 </li></ol>上記の条件が満たされていない場合、生物の同じバッチで得られたすべてのデータは無効と見なされ、テストは繰り返されるべきである。

<ol><li>Togulga, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Short-Term+Toxicity+of+Two+Toxicants+to+Artemia+Nauplii%5BTitle%5D)+AND+%22Tr.+J.+of+Zoology%22%5BJournal%5D)">The Short-Term Toxicity of Two Toxicants to Artemia Nauplii.</a> Tr. J. of Zoology. 22, 259-266 (1998).</li>
<li>Persoone, G., Wells, P. G. Artemia in aquatic toxicology: a review. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPersoone%2C+G+%22Artemia+Research+and+its+Applications.+Morphology%2C+Genetics%2C+Strain+characterization+Toxicology%22">Artemia Research and its Applications. Morphology, Genetics, Strain characterization Toxicology</a>. Sorgeloos, P. , Universita Press. Belgium. 259-275 (1987).</li>
<li>Nunes, B. S., Carvalho, F. D., Guilhermino, L. M., Stappen, G. V. an <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+genus+Artemia+in+ecotoxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Envir.+Poll%22%5BJournal%5D)">Use of the genus Artemia in ecotoxicity testing.</a> Envir. Poll. 144, 453-462 (2006).</li>
<li>APAT IRSA-CNR. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Metodi+analitici+per+le+acque+Manuali+e+Linee+guida+29%2F2003%22">Metodi analitici per le acque Manuali e Linee guida 29/2003</a>. Terzo Metodo, 8060(2003).</li>
<li>Sorgellos, P., Wielen, C. R. emiche-V. anD. er, Persoone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+Artemia+nauplii+for+toxicity+tests+%C3%A2%E2%82%AC%E2%80%9C+a+critical+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotox.+Env.+Saf%22%5BJournal%5D)">The use of Artemia nauplii for toxicity tests â€“ a critical analysis.</a> Ecotox. Env. Saf. 2, 249-255 (1978).</li>
<li>Savorelli, F., Palazzi, D., Gorbi, G., Invidia, M., Sei, S., Magaletti, E., Manfra, L., Gelli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Set+up+of+a+standard+methodology+for+14-day+bioassay+on+Artemia+franciscana+and+A.+parthenogenetica%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Amb%22%5BJournal%5D)">Set up of a standard methodology for 14-day bioassay on Artemia franciscana and A. parthenogenetica.</a> Biol. Amb. 21, 27-36 (2007).</li>
<li>Brix, K. V., Cardwell, R. D., Adams, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+toxicity+of+arsenic+to+the+Great+Salt+Lake+brine+shrimp%2C+Artemia+franciscana%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotox.+Environ.+Saf%22%5BJournal%5D)">Chronic toxicity of arsenic to the Great Salt Lake brine shrimp, Artemia franciscana.</a> Ecotox. Environ. Saf. 54, 169-175 (2003).</li>
<li>Brix, K. V., Deforest, D. K., Cardwell, R. D., Adams, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+a+chronic+site-specific+water+quality+standard+for+selenium+in+the+Great+Salt+Lake%2C+Utah%2C+USA%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Toxicol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Derivation of a chronic site-specific water quality standard for selenium in the Great Salt Lake, Utah, USA.</a> Environ. Toxicol. Chem. 23, 606-612 (2004).</li>
<li>Qualitá dell'acqua - Determinazione della tossicitá letale a 14 giorni con Artemia franciscana (Crustacea: Anostraca). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Commissione+UNICHIM+%22Qualit%C3%A1+dell%27acqua%22+Gruppo+di+Lavoro+%22Metodi+Biologici%22+Sottogruppo+%22Acque+salate%2Fsalmastre+e+sedimenti%22%22">Commissione UNICHIM "Qualitá dell'acqua" Gruppo di Lavoro "Metodi Biologici" Sottogruppo "Acque salate/salmastre e sedimenti"</a>. , UNICHIM. (2010).</li>
<li>Varo, I., Navarro, J. C., Amat, F., Guilhermino, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+cholinesterases+and+evaluation+of+the+inhibitory+potential+of+chlorpyrifos+and+dichlorvos+to+Artemia+salina+and+Artemia+parthenogenetica%5BTitle%5D)+AND+%22Chem%22%5BJournal%5D)">Characterisation of cholinesterases and evaluation of the inhibitory potential of chlorpyrifos and dichlorvos to Artemia salina and Artemia parthenogenetica.</a> Chem. 48, 563-569 (2002).</li>
</ol>

利害の衝突が宣言されません。

アルテミアは、私たちは、それが毒性毒性学におけるアルテミアの使用に関連するいくつかのオプションを維持することが可能であることを明記することができ、これまで行わ生態毒性試験および研究のために利用できる最も貴重な試験生物の一つです。バイオアッセイに適した種にこの生物をオン特性は次のとおりです。広い地理的分布、不利な環境条件と様々な栄養素を、比較的単純な培養検査、メンテナンス、操作への抵抗、短いライフサイクル、大規模な子孫の生産と高い適応性いくつかの種については、かなりの量の存在。 アルテミアの使用に対する批判は、化学物質暴露に対する感度と呼ばれています。以前の研究では、3つの同一の実験条件下で他の試験生物と比較すると、生態毒性研究のための機密性の低い種とし ​​てアルテミア （24時間の暴露試験）を参照してください。選択生態毒性試験方法は、この点で重要である。我々は、暴露4の24時間プロトコルの同じ開始条件（試験生物としてのノープリウス、嚢胞の使用から得られる）であった方法を標準化したかったのですが、比較的長い露出時間（14...

環境保護や研究のための研究所のLoredana Manfra（環境品質監視のイスプラ·専攻）と環境保護のための地域機関（エミリアロマーニャ、イタリア）のフェデリカSavorelliによって生成された。 生物学的方法グループ内のアルテミア甲殻類のサブワーキンググループのリファレンスメンバー-水の品質に及ぼす塩水/ UNICHIM委員会の汽水と土砂（化学部門の技術標準オペレーティング·システム用の研究所）。 イスプラのマルコPisapia（サイエンティフィック·アドバイザリーおよびドキュメント·サービス）によるビデオ撮影と編集。 アンナ·マリア·キケロとイスプラのエリカMagaletti（環境品質監視科）による生産調整。 我々は、エミリアロマーニャ、フェラーラ支店とBiologの環境保護のための地域機関に感謝したいと思いますiCalのメソッドグループ - 海水/汽水とその協力のための水の品質に及ぼすUNICHIM委員会の土砂、ロセラボスコロとその財政支援のためのイスプラのマッシモGabellini（予防と影響の緩和学科）、ローマの言語のロンドン·スクール彼らの言語サポートのために。 <table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> 製品番号 </td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> L4390 </td></tr></tbody></table>付録藻類のメディアは、分析品質の試薬を用いて調製する必要があります。 栄養溶液のリットルのNaNO 3、蒸留水のNH 4 ClのKH 2 PO 4と20グラムの30グラムの300グラムに溶解して調製されています。 最初は、以下の4つのソリューション（A、B、C、D鉱物の）は以下のように調製されています。 <ul><li>溶液1リットル&quot;&quot;のCuSO 4の硫酸亜鉛4 H 2 O、25グラム5 H 2 O、COSO 4 7 H 2 O 30gを蒸留水でのMnSO 4 H 2 Oの20グラムの30グラムを含んでいる。 </li><li>溶液1リットルの蒸留水にFeCl 3を •6 H 2 Oの50グラムを含んで&quot;B&quot;; </li><li>溶液1リットルの蒸留水中のNa 2たMoO 4•2 H 2 Oの25グラムを含んでいる&quot;C&quot;; </li><li> 50グラムディのNa 2 EDTAを含む溶液を&quot;D&quot;蒸留水で•2 H 2 Oリットル。 </li></ul>鉱物（ソリューション &quot;E&quot;）の最終的な溶液1リットルの蒸留水に、上記のソリューションのアリコートを添加し得られます。また、次の順序が推奨されます。ソリューション &quot;D&quot;の100ミリリットル、溶液10ml &quot;C&quot;、ソリューション &quot;B&quot;の10mlと溶液10ml &quot;&quot;。 三のイニシアティブビタミンlのソリューション（F、G、H）は以下のように調製されています。 <ul><li>溶液1リットルの蒸留水でビオチン100mgを含む &quot;F&quot;; </li><li>蒸留水でチアミンの10グラムを含む溶液1リットル &quot;G&quot;; </li><li>蒸留水でコバラミンの100mgを含有する溶液を &quot;H&quot;リットル。 </li></ul>ビタミン（ソリューション &quot;I&quot;）の最終的な溶液1リットルの蒸留水の3つの初期解の10ミリリットルを添加し得られます。 藻類のメディアリットルの培養液、ミネラル最終的な解決策（ソリューション &quot;E&quot;）と海水中のビタミン最終的な解決策（ソリューション &quot;I&quot;）1 mlの1 mlの1mlを溶解して調製されています。この後者は認知されている分析品質の試薬または蒸留水または脱イオン水に市販の製剤を溶解することによって得ることができる。理想的な海水を作成するための塩のブレンドは、 インスタントオーシャン混合物を 、例えば、市販されている。それはrecommenです。30（±2）PSUと温度20（±1）℃の塩分と海水の使用DED

甲殻類との長期致死毒性試験アルテミアfranciscana</em

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

我々の研究活動は、海水/汽水と堆積物への特定を参照して、環境の質の評価のための生物学的方法の使用を対象としています。生物学的指標の選択は、標準化された手順の可用性に、おそらく、信頼できる科学的知見に基づいてしなければなりません。本稿では、化学物質、および/ ​​または海洋環境の行列の毒性を評価するために、海洋甲殻類のブラインシュリンプを使用した標準化されたプロトコルを提示します。科学者たちは、ブラインシュリンプ（ アルテミア ） は世界的に利用するための標準アッセイの開発に適した候補であることを提案する。論文の数は、ブラインシュリンプ（ アルテミア ）の様々な化学物質や有害物質の毒性に公開されています。毒性研究のためのこの甲殻類の主な利点は、乾燥した嚢胞の全体的な可用性であり、これらはすぐにテストで使用することができ、困難な栽培が求められていません<suP&gt; 1,2。嚢胞ベース毒性アッセイは、継続的に、利用可能な、シンプルで信頼性の高い安価であるため、工業用監視の要件については、または規制上の目的3の毒性スクリーニングのルーチンニーズに重要な答えです。提案手法は、エンドポイントとして死亡率を伴う。生存者の数を数えたと死亡の割合を算出した。彼らが観察4の数秒の間に、任意の内部または外部の動きを示さなかった場合は、幼虫が死んだと考えられた。このプロシージャは、参照物質（ドデシル硫酸ナトリウム）標準化されたテストであった。いくつかの結果がこの仕事に報告されています。この資料では、プロトコルに関連するすべての手順を示す、手続きの毒性試験の性能を説明するビデオが付属しています。

本研究では、化学物質、産業廃水や下水と海水甲殻類の液体環境試料によって発揮される長期的（14日）致死毒性を決定するための貴重な方法論的なプロトコルの開発と標準化にかかわる<em&gt;アルテミアfranciscana</em&gt;。

私たちの研究活動は、特に海水および汽水域に着目し、環境質の評価に生物学的手法を用いることを目的としています。

私たちは、環境保護・研究高等研究所（ISRA）の環境品質モニタリング、植物プランクトン、生態毒性学および生態学研究室の研究員であるLaura ManfraとFederica Selliです。私たちの研究活動は、特に海水、汽水、および堆積物を対象とした、環境品質評価のための生物学的手法の活用を目的としています。最新の研究では、化学物質、産業廃棄物、廃水、下水、または液状の環境試料が、海水性甲殻類であるartia Franciscanに及ぼす14日間の長期致死毒性を測定するための、有用な方法論的プロトコルの開発と標準化に取り組んでいます。このビデオでは、手順に沿った毒性試験の実施について説明します。本試験では、アルテミアの幼生を一定範囲の物質濃度または試験サンプルに曝露させ、本手法で定義された条件を満たした上で、14日間にわたり曝露された生物の50%が死亡する濃度または希釈レベルを決定することを目的としています。必要に応じて、また可能な場合には、以下の項目についても決定することができます。20%の生物が死亡する濃度レベルは、分析した最高濃度レベルにおいて、陰性対照よりも高い死亡率が認められない場合に決定されます。また、14日後に陰性対照よりも高い死亡率が認められた最低試験濃度レベルに基づきます。試験を実施するために、孵化したばかりの卵から得られた、ステージ2または3の48時間未満のFranciscan幼生をチームに用意してもらいました。希釈水としては、認定された分析グレードの試薬または市販の調製液を蒸留水または脱イオン水に溶解して調製した合成海水を使用できます。48時間の撹拌後、孔径0.45 µm以上のフィルターでろ過し、希釈液を暗所で最大30日間保存することが可能です。0〜4 °Cの温度で、密度が1.3 × 10⁶ 〜 2.0 × 10⁶ cells/mLの間で対数増殖している微細藻類Ella terを試験生物として投与してください。本試験における参照物質はドデシル硫酸ナトリウムです。通常の実験器具に加え、以下の試験用容器が必要です。100 mLのホウケイ酸ガラス製ビーカー、標準溶液調製用の500 mLフラスコ、試験溶液調製用の100 mLフラスコ6個、シストの活性化および孵化皿から試験容器へのアルテミアの移送に使用する、取り外し可能な蓋付きの直径5 cmのガラス製またはポリ製ペトリ皿。ノプリの移送用には、先端を火炎で丸めたガラス製パステールピペット、または切断して使用する3 mL使い捨てプラスチックピペットを使用します。また、試験溶液の調製にはマイクロピペットとメスピペットを使用します。試験溶液をフラスコから試験容器に移送し、試験生物を準備するために、50 mLメスシリンダー6本を用意してください。試験の48時間前に、12 mLの希釈水が入ったシャーレに20 mgのシストを入れます。このシャーレを25 °C、光強度4,000 lumens/m²の条件下で1時間保持します。24時間後、孵化した幼虫を人工水で満たした新しいシャーレに移します。光源を備えた顕微鏡を用いて転移操作を行い、孵化した光屈性の幼虫が光線に向かって移動するようにします。ガラス製ペーストピペットを使用し、シスト自体や膜の中にいる幼虫ではなく、新生した幼虫のみを転移させるように注意してください。幼虫を入れたディッシュを、暗所である恒温槽に入れ、25 degreesでさらに24時間保持します。試験物質の標準溶液は、物質0.5 gを500 mLフラスコに溶解させて調製してください。脱イオン水または蒸留水を加え、完全に溶解するまで攪拌します。物質の溶液中での安定性が不明である場合を除き、溶液は使用直前に調製してください。その場合、標準溶液は試験の2日前までに調製しておくことができます。陰性対照は、希釈水に適切な量の藻類懸濁液を加え、細胞密度が10⁵ cells/mLとなるように200 mLフラスコ内で調製してください。試験溶液は、希釈水に規定量の標準溶液を加え、目的の試験濃度となるように500 mLフラスコ内で調製する必要があります。生物に餌を与えるには、duna teta微細藻類懸濁液を使用し、試験溶液を調製する際に密度が10⁵ cells/mLになるまで添加してください。ただし、開始前に、希釈液、水、藻類懸濁液、標準溶液の順に添加することを推奨します。メスシリンダーを用いて、50 mLずつ等量の試験溶液を試験容器に入れてください。各試験シリーズの各濃度について、3つのレプリカを作成します。試験溶液の量と同量の希釈水を入れたコントロール容器を準備します。約12 millilitersの試験溶液を等量ずつペトリ皿に導入します。一連の試験ごとに、対照用ペトリ皿を作成します。シスト活性化から48時間後になると、線虫は第2、第3幼虫期に達し、試験に使用可能な状態になります。シスト活性化に使用したペトリ皿を恒温槽から取り出します。少量の幼虫を、対照溶液および試験溶液を含むペトリ皿にそれぞれ移します。この試験段階での移送には、先端を火炎で丸めたガラス製パステールピペットと、アルティアを凝集させるために側面に配置した光源を使用してください。試験溶液から10匹の幼虫を移送します。ペトリ皿を試験容器に移します。また、先ほどのピペットと顕微鏡カバーを用いてこの操作を行い、試験用ビーカーをパラフィルムで覆います。その際、空気通路として隙間を残し、試験期間全体を通して25 °Cの温度を維持してください。また、照度900 lumens/m²とし、試験開始から2日後以降は、明期14時間、暗期10時間の光周期に設定してください。その後、5日、7日、9日、および12日後に、顕微鏡下でアルテミアを観察し、生存率を確認します。培地を交換し、約10秒間動きが見られない個体は死滅したものと見なしてください。また、試験中は定期的に試験溶液を交換する必要があり、使用する当日に調製してください。試験溶液は定期的に交換し、使用当日に調製する必要があります。以前に調製した標準溶液を用いて、テスト溶液を調製します。この段階で生物に損傷を与えないよう、十分に太い直径のEPI PETを用いてARTIA転送を行います。14日間の曝露後に切断することを想定し、3 mmのプラスチック製ポスターパイプペットを使用しても構いません。試験終了後、生存している幼虫の数を数え、ワークシートに結果を記録してください。14日時点でのlc 50および/またはlc 20、NOEC、LOECを算出し、その値を報告してください。95%信頼限界を適用し、適切な計算方法を用いてください。試験終了時に、対照群の平均死亡率が 20% 以下であること、および sodium doda cell sulfate を使用した場合の 14 日後の lc 50 が 8.0 milligram liter の範囲内に含まれていること、という以下の条件が満たされている必要があります。上記の条件が満たされていない場合、同一バッチの生物を用いて得られたすべてのデータは無効と見なし、試験を繰り返す必要があります。

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甲殻類との長期致死毒性試験アルテミアfranciscana

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