アッセイのメソッドショウジョウバエ行動

本手順の総合的な目的は、ショウジョウバエの運動感覚および協調行動を調べる方法を実証することです。具体的には、まずクロール検定を用いて幼虫の運動機能を評価し、次にリング検定を用いて成虫の運動機能を評価し、さらに求愛検定を用いて成虫の協調能および感覚能力を評価します。最終的に、これら一連の行動検定を用いることで、遺伝的要因や薬剤投与などの外部要因が活動性や協調性にどのような影響を与えるかを示すことができます。

Intra sophala。負の地軸（negative geo axis）などの既存の手法と比較した本アッセイの主な利点は、リングアッセイの方がスループットが高く、感度が高いことです。この手法は、運動機能障害の早期検出など、神経変性疾患分野における重要な課題の解決に寄与することが期待されます。

本アッセイの実演は、私の研究室のポストドクターであるJamie Becknell博士が行います。幼虫のクロールアッセイは、運動能に対する遺伝的および環境的要因の影響を測定するために使用されます。まず、標準ボトルに10〜15匹の雄と10〜15匹の処女雌を交配させ、セットアップを開始します。24時間後、健康な成虫が十分な数の卵を産むことでボトル内を満たし、個体群の齢を24時間に揃えることができます。

成虫を新しいボトルに移し、この工程を繰り返します。次に、ボトル内の餌に第3 instar（齢）の幼虫が見られるまでインキュベートします。20% sucroseを50〜100 mL加え、20分間静置します。

幼虫が表面に浮いてきます。先端をカットした25 milliliterのセロロジカルピペットで幼虫を回収し、メッシュバスケットに入れます。メッシュバスケット内の幼虫を脱イオン水で2回洗浄します。これで実験に使用可能な状態になります。

幼虫に薬剤を投与するには、ブラシを用いて、5%ショ糖溶液と目的の薬剤を含む5 mLビーカーに規定数の幼虫を移します。薬剤入りの糖溶液を15分間摂取させた後、メッシュバスケットを通して回収し、洗浄し、運動性に対する薬剤の効果の測定に進みます。ブラシを用いて、個々の幼虫を2%アガロースを含む15 cmシャーレに移します。

方眼紙の上にセットします。次に、データを収集してください。溶岩が1分間にまたいだ格子線の数を数えるだけで完了です。

次に、解剖顕微鏡下で、筆を使用して溶いた酵母ペースト溶液を含むガラス製解剖皿のウェルに幼虫を移し、1分間かけてPercyの収縮回数をカウントします。1回の収縮は、後方から前方への1回の完全な動きとしてカウントします。目的の数の幼虫がカウントされるまで、この操作を繰り返します。

リングプロトコルでは、羽化したばかりの成体雄 flies を軽度麻酔下で収集し、通常食または薬物投与食を含む標準的な vial に移すことで、成体動物の移動速度を測定します。1本の vial あたり約 25匹の flies を入れます。完全な麻酔回復と薬物濃度の定常状態への到達させるため、室温で2〜3日間 flies を維持します。

次に、麻酔をかけない約 25 匹のハエを、成形プラグ付きのポリスチレン製バイアルに移し、これらのバイアルを 1 つまたは複数のリング装置に組み込みます。バイアルを側面から撮影できるようデジタルカメラを調整し、タイマーを準備して、アッセイに必要なた希望の時間に設定した状態で、ハエを 15 から 20 分間休ませます。通常、アッセイの実施時間は 3 秒間です。

ショウジョウバエを刺激しないように片手でリング装置を持ち、もう一方の手でカメラのタイマーをしっかりと保持します。装置をベンチに3回叩きつけてハエをダウンさせ、同時にカメラのカウントダウンタイマーを開始します。この試験を1分に1回、5〜6回の試行が行われるまで繰り返します。

初期データセットを収集した後のポリスチレン製試験用バイアルを再利用しないことが極めて重要です。使用済みのバイアルに新しいハエを入れた場合、新品のバイアルに入れたハエと同程度には登らないためです。画像ビューアを用いてデータを収集し、グループごとの平均登高をスコア化してください。

このアッセイでは、アッセイ用の個体を回収するため、十分な子孫が得られているボトル内で準備された遺伝学的交配が必要です。動物の主観的な夜明けから数時間以内に、3〜4時間の間隔でボトルをクリアにし、すべての成虫を回収します。羽化直後の未経験のオスとメスを回収し、オスは餌を入れたバイアルまたはチューブに個別に、メスは5〜6匹のグループに分けて飼育します。

同様の飼育容器を用い、アッセイには同数の雄と雌が必要です。収集したハエを5日間隔離した後、交尾ホイールへの導入およびアッセイの準備を行います。次に、解剖顕微鏡下で、雌1匹と雄1匹を慎重に交尾ホイールのチャンバーへ移します。

10分間、またはその間に交尾に成功するまで、ペアを観察します。いくつかの行動について、それぞれ初めて観察された時間を記録してください。オスが初めてメスの方を向いた時間を記録してください。

オスが脚で初めてメスに触れたとき、オスが初めて翅を伸ばして振動させたとき、オスが初めてメスの生殖器を舐めたとき、およびオスが初めて腹部を自分の下に巻き付けたときを記録してください。オスが初めてメスへの交尾試行を行ったときを記録してください。最後に、交尾が起こるまで求愛行動に従事した合計時間を記録してください。

野生型動物の場合、これはほとんど常に5〜10分以内であり、3つの異なるパラメータでデータを収集します。第一に、行動への潜時とは、その行動が最初に観察されるまでの時間のことです。第二に、行動の頻度とは、その行動が観察されるか否かということです。

そして3点目に、求愛指数とは、動物を用いた実験において、求愛に費やした時間を総時間および交尾に至るまでの時間で除したものです。筋萎縮性側索硬化症に関連するF-U-S-T-L-Sの変異を保持させた個体において、挿入変異を持つ遺伝子変異体は、野生型対照群（左）の半分の這行能力を示し、R 5 21 Cミスセンス変異では這行速度がわずか約 1 cm/min まで低下しました。

野生型の若い成虫ハエを用いてリング試験を行った結果、平均上昇高度は3秒間で3〜5 cmであった。このアッセイでは、リングアッセイを試行する際に1分間隔で最大5回連続で試験を行ったが、脱感作は見られなかった。タイミングに関しては、可能な限り正確に測定することが重要である。

適切に実施すれば、幼虫の密集アッセイに習熟した後は、1つの遺伝子型につき10回の試行を30〜40分で観察することができます。このビデオを視聴することで、ショウジョウバエにおける求愛行動の観察方法とスコアリングについても十分に理解できるはずです。