アッセイのメソッドショウジョウバエ行動
2012年3月7日
キイロショウジョウバエでは、世紀の1以上にわたり、多くの重要な生物学的過程の分子および細胞基盤を理解するために使用されている遺伝的に行動的に扱いやすいモデル系である。 ショウジョウバエがよく飛ぶ行動の遺伝的洞察を得るために利用されてきた。
この手順の全体的な目標は、ショウジョウバエの運動感覚および協調行動を調べる方法を実証することです。これは、最初に溶岩の運動機能を評価し、クロールアッセイを使用し、成体の運動機能を評価し、リングアッセイを使用し、求愛アッセイを使用して成虫の協調性と感覚能力を評価することによって達成されます。最終的に、この行動アッセイのパネルは、薬物治療などの遺伝的要因や外的要因が活動や協調にどのように影響するかを示すことができます。
イントラソフラ。ネガティブジオアクシスのような既存の方法に対するこのアッセイの主な利点は、リングアッセイがより高いスループットとより感度が高いことです。この方法は、機関車の欠陥の早期検出など、神経変性疾患分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。
このアッセイを実証するのは、私の研究室のポスドクであるJamie Becknell博士です。幼虫の這うasayは、標準的なボトルに10〜15人の男性と10〜15人の処女の十字架を設定するために、運動性に対する遺伝的および環境的要因の影響を測定するために使用されます。24時間後、健康な成体は、その人口を24時間に合わせるためにボトルに十分な卵を産むことになります。
大人を新しいボトルに片付け、このプロセスを繰り返します。次に、スターの幼虫の3番目がボトルに食物中に観察されるまでボトルをインキュベートします。50〜100ミリリットルの20%スクロースを加え、20分間放置します。
幼虫は上に浮かび、先端がカットオフされた25ミリリットルの血清学的ピペットを使用して幼虫を収集し、メッシュバスケットに入れます。メッシュバスケットの中の幼虫を脱イオン水で2回洗います。これで実験することができます。
幼虫を薬で治療するには、ブラシを使用して、5%スクロースの溶液と目的の薬を含む5ミリリットルのビーカーに目的の幼虫を輸送します。薬を飲んだ砂糖溶液を15分間食べさせてから、メッシュバスケットに戻し、すすぎ、運動性に対する薬物効果の測定を進めます。ブラシを使用して、個々の溶岩を2%アロスを含む15センチメートルのシャーレに運びます。
グラフトペーパーの上に置きます。次に、データを収集します。溶岩が1分間に交差するグリッドラインの数を数えるだけです。
次に、ブラシを使用して溶岩を希薄な酵母ペースト溶液を含むガラス解剖皿のウェルに移し、解剖顕微鏡で1分間かけて、パーシーの収縮を数えます。1回の収縮は、完全な後方から前方への動きとしてカウントされます。必要な数の幼虫がカウントされるまで繰り返します。
リングプロトコルは、成体の動物の移動速度を測定し、新たに出現した成体のオスのハエを軽い麻酔下で収集し、通常の食品または薬漬けの食品を含む標準ファイルに移します。バイアルあたり約25匹のハエを入れます。ハエを室温で2〜3日間維持し、完全な麻酔回復と定常状態の薬物レベルの蓄積を行います。
次に、麻酔なしで約25匹のハエを成形プラグ付きのポリスチレンバイアルに移し、バイアルを1つ以上のリング装置に組み立てます。ハエを15〜20分間休ませながら、デジタルカメラを位置合わせしてバイアルを側面から撮影し、タイマーを準備して、アッセイの希望の期間に設定します。通常、アッセイの実行には3秒かかります。
ハエの邪魔にならないように片手でリング装置を持ち、もう一方の手でカメラのタイマーを鋭く持ちます。ベンチの上の装置を3回タップしてハエを倒すと同時に、カメラのカウントダウンタイマーを開始します。エッセイを1分に1回繰り返して、5〜6回の試行が行われます。
最初のデータセットが収集された後にポリスチレンテストバイアルを再利用しないことが重要です。使用済みのバイアルに入れられた新しいハエは、新しいバイアルに入れられたハエと同じ程度まで上昇しないためです。画像ビューアを使用してデータを収集するには、平均身長をスコアリングし、さまざまなグループで登ります。
このアッセイでは、アッセイのためにハエを収集するために、豊富な子孫を生産しているボトルに調製された遺伝的交配が必要です。動物の主観的な数時間以内に、夜明けはボトルをクリアして、3〜4時間間隔ですべての成虫を収集します。新たに出現した性的にナイーブな男性と女性を集め、男性をバイアルまたはチューブに個別に収容し、女性を5〜6人のグループで収容します。
同様のエンクロージャーでは、アッセイには同数の男性と女性が必要です。採取したハエを5日間単離した後、それらを交配ホイールにロードし、アッセイを実施する準備をします。次に、片方の雌と1片の雄を、解剖顕微鏡で嵌合ホイールのチャンバーに慎重に移します。
ペアを10分間、またはその時間に交尾が成功するまで観察します。複数の動作のそれぞれが最初に観察されたときを記録します。男性が最初に女性の方を向いたときに記録します。
オスが初めて脚でメスに触れたとき、オスが最初に翼を伸ばして振動したとき、オスが最初に女性器を舐めたとき、オスが最初に腹部を自分の下に丸めたとき、レコード。男性が最初に女性のメールをマウントしようとしたときを記録します。最後に、交尾が発生するまで求愛行動に従事した合計時間を記録します。
野生型の動物の場合、これはほとんどの場合5〜10分以内で、3つの異なるパラメータでデータを収集します。まず、動作の遅延は、動作が最初に観察されるまでにかかる時間です。次に、行動の頻度は、それが観察されるかどうかです。
そして第三に、求愛指数は、求愛に費やされた時間を、動物実験における交尾までの合計時間で割ったものです。F-U-S-T-L-Sの変異は、筋萎縮性側索硬化症に関連しています。挿入中心を持つ遺伝子変異体は、野生型コントロールの半分の這う能力を示しましたが、R 5 21 Cミスセンス変異は、這う速度を1分間に約1センチメートルに低下させました。
野生型の成虫の若いバエのリングテストでは、平均身長が3秒間で3〜5センチメートル上昇しました。このアッセイでは、リングアッセイを試みている間、1分間隔で5回の連続した試行まで脱感作は観察されませんでした。タイミングに関しては、できるだけ正確であることを忘れないようにすることが重要です。
習得すると、幼虫のクラウディングエッセイは30〜40分で完了し、適切に実行されれば、1つの遺伝子型に対して10回の試行を観察できます。このビデオを見た後、その場で求愛行動を観察し、採点する方法についてもよく理解しているはずです。
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概要
この記事は、ショウジョウバエの運動感覚および協調行動を調べる方法を示しています。この研究では、さまざまなアッセイを使用して運動機能と協調性を評価し、これらの行動に影響を与える遺伝的および外部要因に関する洞察を提供しています。
研究の主要な構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 行動生物学
- 遺伝学
背景
- ショウジョウバエは広く使用されているモデル生物です。
- 生物学的プロセスの理解に大きく貢献しています。
- ハエの行動の遺伝的基礎が広範に研究されています。
- 行動アッセイは神経変性疾患への洞察を明らかにすることができます。
研究の目的
- ショウジョウバエの運動機能を評価する方法を示す。
- 遺伝的および外部要因が行動に与える影響を評価する。
- 既存のアッセイよりも高いスループットと感度の代替手法を提供する。
使用された方法
- 幼虫の運動機能評価のためのクロールアッセイ。
- 成体の運動機能評価のためのリングアッセイ。
- 成体の協調性と感覚能力を評価するための求愛アッセイ。
- 新しいアッセイと従来の方法の比較。
主要な結果
- リングアッセイは高いスループットと感度を提供します。
- 行動アッセイは初期段階の運動機能障害を検出できます。
- 遺伝的および薬物治療はショウジョウバエの活動と協調性に影響を与えます。
- 得られた洞察は神経変性疾患の研究に情報を提供できます。
結論
- ショウジョウバエのアッセイは運動および感覚行動の研究に効果的です。
- これらの方法は行動に対する遺伝的影響の理解を深めることができます。
- 将来の研究はこれらの発見を神経変性疾患研究に活用できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Robust behavioral assays in Drosophila enable early-stage interrogation of genetic and pharmacological effects on motor and coordination phenotypes, supporting predictive confidence in neurodegenerative and disease-relevant models. High-throughput, quantitative readouts from larval crawling, adult climbing (RING), and courtship assays facilitate rapid hypothesis testing and mechanistic de-risking at critical discovery inflection points. These methods underpin portfolio triage by providing scalable, reproducible data for target validation and compound screening.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional assessment of genetic perturbations and drug effects on motor behavior.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying phenotypic outcomes in disease-relevant models.
- Facilitates rapid triage of targets based on reproducible behavioral endpoints.
Screening & Assay Development
- Provides validated, high-throughput behavioral assays for scalable compound evaluation.
- Delivers quantitative, standardized outputs for cross-condition comparison.
- Reduces assay variability and increases reproducibility for screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Aligns behavioral phenotypes with translational endpoints relevant to neurodegenerative disease models.
- Enables continuity from genetic discovery to preclinical validation of functional outcomes.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on early behavioral readouts.
Pipeline & Workflow Integration
These behavioral assays position Drosophila as a versatile platform from early discovery through lead identification and preclinical research, enabling seamless integration of genetic, pharmacological, and phenotypic data.
- Discovery Biology: Quantitative behavioral assays support hypothesis testing and clarify gene-function relationships.
- Screening: High-throughput RING and crawling assays provide reproducible, scalable platforms for compound and genetic screening.
- Analytics: Standardized measurements (e.g., climbing height, crawling speed, courtship index) enable robust statistical comparison across genotypes and treatments.
- Translational Research: Behavioral endpoints align with disease-relevant phenotypes, supporting translational biomarker development.
- Enterprise Reuse: Assays are adaptable for diverse genetic backgrounds and drug modalities, supporting broad portfolio applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes behavioral phenotyping for reproducibility and scalability across studies.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of disease-relevant targets and compounds.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila genetics and behavioral phenotyping.
- Needs access to imaging equipment and standardized assay infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization for reproducible outputs.
- Assay protocols must be adapted for specific genetic backgrounds or drug treatments.
- Potential limitations include sensitivity to environmental variables and assay throughput constraints for large-scale screens.
