Name: アッセイのメソッドショウジョウバエ行動 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: 学ぶショウジョウバエの運動・感覚・協調性評価法。這行動アッセイ、リングアッセイ、求愛アッセイを用いて、遺伝的要因と薬剤処理が行動に与える影響を解析します。神経変性疾患研究に応用可能です。

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私たちは、幼虫のクロールデータを生成するためAstha Maltareに感謝します。私たちは、原稿上の彼のコメントを与えるために博士はニコラス·ランソン·ジュニアに感謝します。この作品は、ジョンズホプキンス大学でALSのためにロバートパッカードセンター（UBP）および筋萎縮性側索硬化症協会（UBP）がサポートされていました。と国立精神衛生研究所（CDN）からR01MH083689。

A.幼虫クロールアッセイ 1。幼虫コレクション<ol><li>ハエの8オンスボトル（10-15男性+女性10月15日）を設定します。 </li><li>ハエの明確な瓶その後、ハエは24時間の卵を産むしましょう​​。 （新しいボトルに大人を転送し、必要に応じて繰り返します）。 </li><li> 3-4日のためにボトルをインキュベートし、または3齢幼虫になるまで表示されます。 </li><li>幼虫のボトルに20％ショ糖の100 mlを、20分間放置 - 50を追加します。幼虫は上にフロートします。 </li><li>チップと25ミリリットル血清ピペットを用いて収集した幼虫は、カットオフ、およびメッシュバスケットに場所。 </li><li> 2倍の脱イオンH 2 Oでメッシュバスケットに幼虫を洗う幼虫は現在の実験の準備が整いました。 </li></ol> 2。薬で幼虫を治療する<ol><li>溶液5％スクロース+薬剤を含む5 mlのビーカーに幼虫の希望数を輸送するためにブラシを使用しています。 </li><li>少なくとも15分間幼虫してみましょう。</li><li>メッシュバスケットに薬剤処理した幼虫を入れ、すすいでください。彼らは今、使用する準備が整いました。 </li></ol> 3。運動アッセイ（測定総走行距離や体壁の収縮） <ol><li>に個々の幼虫を輸送するためにブラシを使用します。 <ol><li> 0.2センチメートル2グリッドとグラフ用紙の上に、2％アガロース（以前に注ぎ、硬化さ）を含む15センチメートルペトリ皿。 <ol><li> 1分で交差するグリッド線の数をカウントします。 </li></ol></li><li>希薄酵母糊液を含有するガラス解剖皿のよく。 <ol><li>解剖顕微鏡下で観察しながら1分で蠕動収縮を（後方移動= 1収縮への完全な前方）カウントされます。 </li></ol></li></ol></li><li>幼虫の希望する番号がカウントされるまで繰り返します。 </li></ol> B.ラピッド負の走地性（RING）プロトコルを反復このアッセイは、もともとドでしたガルガーノら 5によってスクライブ。 <ol><li>食品（または食品+薬）を含む標準バイアルに光CO 2麻酔と場所の下に新たに浮上して成人男性のハエを収集します。 </li><li> CO 2（定常状態薬物濃度の蓄積が適切であれば）からの回復を可能にするために2〜3日室温（ベンチの上に。〜22°C）でハエを維持しています。 </li><li>準備されたポリスチレンバイアルに麻酔なしで 25ハエについて転送します。 </li><li>リング装置（図1）にハエのバイアルを組み立てる。 </li><li>ハエは15〜20分間、邪魔されず、環境に順応することができます。 </li><li>この時間の場所にデジタルカメラの間に装置の前に〜1メートル（プラットフォームバイアルの中間の高さでレンズの中心を揃えるために必要な場合に）、フォーカス、装置の上にカメラをズームし、タイマーを設定する3.0秒。 </li><li>慎重にdistにならないように左手でリング装置のホールドを取るURBは、ハエ、そして右手でタイマーを保持します。 </li><li>急激にタップが難しいバイアルの底にすべてのハエをノックダウンするのに十分であることを保証する、ベンチの表面に三回に装置をシャットダウン]をタップします。 </li><li>第三タップの完成と同時に、3秒のカウントダウンタイマーを起動します。 </li><li> 3秒で写真を撮る。 </li><li> 1分間タイマーをリセットして起動します。この時間の間にカメラの電源をリセットして装置に焦点を当て、3秒のタイマーの別のチャネルを設定します。 </li><li> 1分は、手順1.7から1.10の後に</li><li> 5月6日の試験の合計した後、コンピュータに画像をアップロードして開くようにお気に入りの画像ビューアを使用して、平均身長のスコアは各バイアルのため登った。 </li><li>登った高さの平均を比較して、異なるグループの統計分析を実行します。 </li></ol> Cの求愛と交尾アッセイ<ol><li>午前中にまず最初に、FLIの明確なだけでなく生産のボトルESは、使用することができます。 </li><li>一日のコース（3〜4時間毎）を介して、新たに浮上して性的にナイーブな雄と雌を収集します。 <ol><li>媒体とバイアルまたはチューブ内で個別に男性を配置します。 </li><li>バイアル/チューブあたり一緒に行われ5-6の女性。 </li><li> 5日間暗12時間の明/下25°Cで収集されたハエを分離します。 </li><li>交配ホイールの室に一人の女性を転送します。 </li><li>交配ホイールのチャンバーに1男性を転送します。 </li><li>次の動作のために解剖顕微鏡下でペアを守ってください。 <ol><li>オリエンテーション（女性に向かって男性向き） </li><li> （男性が女性をタップする）をタップ</li><li>翼の歌（男性が拡張し、片翼を振動させる） </li><li> （男性が女性の性器を舐める）ブーツ</li><li>カーリング（オス自体は下で腹部をカール） </li><li>交尾の試み（女性をマウントしようとしたときに、アクティビティをカーリング） </li></ol></li></ol></li><li> 1の観察0分または成功した交尾まで、交尾（求愛指数を計算するための）と同様に、首尾よく与えられた動作を実行ペアの数になるまで求愛行動に従事し、それぞれの現象が発生した時刻（待ち時間）、合計時間を記録（周波数）。野生型のペアの100％が一般的に5分以内に交尾します。 </li><li>計算する 交尾までの合計時間で割った求愛で費やされた時間を割って求愛指数（CI）。野生型のペアの場合、これは通常0.6から0.8の間の範囲。 </li></ol> D.描写結果アッセイをクロール通常の野生型幼虫は約3センチメートル/分、展示〜1分間に40から50体壁の収縮をさまよいます。我々は最近、障害6を登る幼虫のクロール欠陥の減少寿命と成人を示しています。FUS / TLS関連の筋萎縮性側索硬化症のショウジョウバエモデルを開発した。我々は表現oを対象とし運動ニューロン（OK-371-GAL4ドライバー）へとf野生型とFUS / TLSの変異体は、幼虫のクロールアッセイを行った。以下に示すように、野生型のFUSの発現が約6cmの幼虫のクロール能力が低下し、一方、野生型幼虫は、最大12 cmまでクロールします。 FUS / TLSのALSの原因となる変異R521Cを発現している動物は約1 cm /分をクロールし、それらのクロールの動き（図1）は非常に重度の障害を示しています。 負の走地性リングアッセイ若い野生型の成虫は、3秒の時間で〜4,5センチ（時間が与えられたために与えられた平均の高さを定義するには、異なる株または活性レベルに対応するために3秒から調整することができ、平均登山高さを持つべきひずみ/処理）。下部に残っているハエは​​、0の値が割り当てられています。それがその後の高さを測定するために、個々のフライの位置を決定することが困難になるので、バイアルあたり25以上のハエを使用することをお勧めされていません。 NOの脱感作は、我々が採用していることを離れて1分間隔で6つの連続した​​試験までに観察されている。それは、使用されるバイアルに入れ、新しいハエは新鮮なバイアルと同程度に上昇しないので、収集されたデータの初期セットの後に、このアッセイにおけるポリスチレンのテストバイアルを再使用しないことが重要です。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3795/3795fig1.jpg" /> 図1。リングアッセイのセットアップ。デジタルカメラは、ポリスチレンバイアル中にハエを含む装置の前に〜1メートルに配置されています。装置の上にカメラをフォーカスとズーム、および3.0秒にタイマーを設定します。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3795/3795fig2.jpg" /> 図2。を使用して幼虫のクロールアッセイからの代表的なデータは、異所性運動ニューロンドライバ（OK371-GAL4）の制御下にUAS-FUS WTと、UAS-FUS R521Cを表現飛ぶ。 <pクラス= &quot;jove_content&quot;&gt;

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</ol>

我々は、開示することは何もありません。

ショウジョウバエの行動は密接に遺伝的要因と環境要因によって調節される。我々は、他のものは、以前の行動やショウジョウバエ 5-19にモデル化する人間の神経変性疾患への飛行に関連する遺伝子を調べるためにデータを収集するためにここで説明するアッセイを使用しています。クロールアッセイのために、第3齢幼虫の慎重な選択が重要なステップです。薬で治療する場合、それは良好な溶解性を持っている場合、最大の効果を得るために（またはそれ以上の薬物の種類や性質に応じて）10〜15分かかります。したがって、我々は定期的に餌を15分間薬剤を飛ぶし、テストする前に、さらに15分待ちます。それは、溶液中の薬物濃度を維持するために、しかし、重要であり、治療群間の露光時間、正確な比較のために同じです。 CNS活性薬剤は、通常、持続的な最大の効果〜45分を持ちます。幼虫はフライ食品を除去するために選択（または授乳を掘った）の後によく洗浄しなければならないと許可され、クロールアッセイを開始する前に1分間馴化。低い温度は幼虫のクロール能力に影響を与えることができるように寒天プレートは、1時間室温（...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>スクロース</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> S5-500 </td></tr><tr><td>アガロース</td><td>インビトロジェン</td><td> 16500-500 </td></tr><tr><td> 6オンスショウジョウバエのボトル</td><td>ジェネシー科学</td><td> 32から130 </td></tr><tr><td>ペイントブラシ（＃1） </td><td>テッド·ペラ社</td><td> 11859 </td></tr><tr><td> 食品成分を飛ぶ </td><td></td><td></td></tr><tr><td>コー​​ンミール</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> NC9109741 </td></tr><tr><td>寒天</td><td>ジェネシー科学</td><td> 66から104 </td></tr><tr><td>糖蜜</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> NC9349176 </td></tr><tr><td>プロピオン酸</td><td>アクロス</td><td> 14930-0010 </td></tr><tr><td> Tegosept </td><td>頂点</td><td> 20から258 </td></tr><tr><td>エタノール</td><td>フィッシャー科学的な</td><td> BP2818-4 </td></tr><tr><td>酵母</td><td>ジェネシー科学</td><td> 62から107 </td></tr></tbody></table>

アッセイのメソッドショウジョウバエ行動

Methods to Assay Drosophila Behavior

キイロショウジョウバエ 、ショウジョウバエは、例えば癌、心血管疾患や様々な神経疾患1などのヒト疾患の広い範囲の分子機構を研究するために使用されています。私たちは、幼虫の移動、大人のクライミング能力（リングアッセイ）、 ショウジョウバエの求愛行動を決定するためのシンプルかつ堅牢な行動アッセイを最適化した。これらの行動のアッセイは、ハエの行動に関する遺伝的要因と環境要因の役割を研究するために広く適用されます。幼虫のクロール能力は確実にショウジョウバエの幼虫のクロール能力の早期の変化を決定するため、また、それらの運動に薬やヒト疾患遺伝子の効果を（トランスジェニックハエの）を調べるために使用することができます。彼らがそうでなければ評価することができたところこれらのハエが大人に生きていけないように遺伝子の発現または廃止は、蛹の大人の段階で致死性が発生した場合に幼虫のクロールアッセイは、より適切になります。この基本的なssayは、 ショウジョウバエの幼虫で追加行動反応を調べるために、明るい光やストレスと組み合わせて使用することもできます。求愛行動は広く性的行動の遺伝的基礎を調査するために使用されており、また同様に学習や記憶など、活動との調整を調べるために使用することができます。 ショウジョウバエの求愛行動は、視覚、聴覚、および嗅覚信号を含む様々な感覚刺激の交換を伴う成功した交尾で絶頂に達する十分に特徴付けられ、モータの動作の複雑な一連につながる男女の間に。伝統的な成人登山のアッセイは、（負の走地性）は、異なる試験2月4日の間には有意な変化で、退屈な、労働集約的で、時間がかかります。急速（RING）負の走地性を反復アッセイ図5に示すように 、再現性に敏感な、高スループットのアプローチ大人の運動を定量化すると負の走地性bを提供し、より広く用いられてプロトコルを介して多くの利点がありますehaviors。リングアッセイでは、いくつかの遺伝子または薬物治療は、ハイスループットスクリーニングのアプローチは、実験のほうが従順することで、同時に動物の多数を使用してテストすることができます。

キイロショウジョウバエでは、世紀の1以上にわたり、多くの重要な生物学的過程の分子および細胞基盤を理解するために使用されている遺伝的に行動的に扱いやすいモデル系である。 ショウジョウバエがよく飛ぶ行動の遺伝的洞察を得るために利用されてきた。

ショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）は、癌や心血管疾患など、広範なヒト疾患の分子メカニズムを研究するために利用されてきました。

本手順の全体的な目的は、ショウジョウバエの運動感覚および協調行動を調べる方法を実証することです。これは、まずクロールアッセイを用いて幼虫の運動機能を評価し、次にリングアッセイを用いて成虫の運動機能を評価し、さらに求愛アッセイによって成虫の協調性と感覚能力を評価することによって達成されます。最終的に、これらの一連の行動アッセイを用いることで、遺伝的要因や薬物治療などの外部要因が活動や協調性にどのような影響を与えるかを示すことができます。Intra sophala。負のジオアクシスなどの既存の手法に対するこのアッセイの主な利点は、リングアッセイの方がスループットが高く、感度が優れていることです。この手法は、運動機能欠損の早期検出など、神経変性疾患分野における重要な課題の解決に寄与します。このアッセイの実演は、私の研究室のポストドクターであるJamie Becknell博士が行います。幼虫の這行性アッセイは、運動能に対する遺伝的および環境的要因の影響を測定するために使用されます。まず、標準ボトルにオス10〜15匹と未交配のメス10〜15匹を合わせて交配させます。24時間後には、健康な成虫が十分な卵を産下し、ボトル内を幼虫で満たして、集団の齢を24時間に揃えることができます。成虫を新しいボトルに移し、この工程を繰り返します。次に、餌の中に3齢幼虫が観察されるまでボトルをインキュベートします。20% sucroseを50〜100 mL加え、20分間静置します。幼虫は水面に浮いてきます。先端をカットした25 milliliterのセロロジカルピペットを用いて幼虫を回収し、メッシュバスケットに入れます。メッシュバスケットに入った幼虫を脱イオン水で2回洗浄します。これで、実験に使用可能な状態になります。薬剤で幼虫を処理するには、ブラシを用いて所定数の幼虫を、5% sucroseと目的の薬剤を含む5 mLのビーカーに移動させます。薬剤を含む糖溶液を15分間摂取させた後、メッシュバスケットを通して幼虫を戻し、洗浄してから、運動性に対する薬剤の効果の測定に進みます。ブラシを用いて個々の幼虫を、2% agarを含む15 cmのペトリ皿に移動させます。方眼紙の上にセットします。次に、データを収集します。1分間に溶岩が通過した格子線の数を単純に数えてください。次に、解剖顕微鏡下で、刷毛を用いて幼虫を希釈酵母ペースト溶液が入ったガラス解剖皿のウェルへと1分間かけて移し、Percyの収縮回数をカウントします。1回の収縮は、後方から前方への完全な1回の動作としてカウントします。目的の数の幼虫がカウントされるまで、この操作を繰り返します。リングプロトコルを用いて、成体動物の移動速度を測定します。軽度の麻酔下で羽化したばかりの成体雄フライを回収し、通常食または薬物含有食が入った標準的なバイアルに移します。1バイアルあたり約25匹のフライを投入してください。麻酔から完全に回復させ、薬物濃度を定常状態にするため、フライを室温で2〜3日間維持します。その後、麻酔をかけない状態で約25匹のハエをモールドプラグ付きのポリスチレンバイアルに移し、バイアルを1つ以上のリング装置に組み立てます。デジタルカメラをバイアルの側面から撮影できるように調整し、タイマーを準備してアッセイの希望時間に設定している間、ハエを15〜20分間休ませます。通常、アッセイの実施時間は3秒間です。ショウジョウバエを驚かせないように、片手でリング装置を保持し、もう一方の手でカメラのタイマーをしっかりと保持します。ベンチ上で装置を3回軽く叩いてハエをダウンさせると同時に、カメラのカウントダウンタイマーを開始します。この試験を1分ごとに繰り返し、5〜6回の試行を行います。初期データセットを収集した後のポリスチレン製試験バイアルを再利用しないことが極めて重要です。使用済みのバイアルに新しいハエを入れた場合、新品のバイアルに入れたハエと同程度まで登らないためです。画像ビューアを用いてデータを収集し、グループごとの平均登高をスコア化してください。このアッセイでは、十分な数の子世代が得られるように準備されたボトル内の遺伝交配個体が必要となります。動物の主観的な夜明けから数時間以内に、3〜4時間おきにボトルをクリアしてすべての成虫を回収します。羽化したばかりの、交配経験のないオスとメスを回収し、オスは個別にフードを入れたバイアルまたはチューブに、メスは5〜6匹のグループに分けて飼育します。同様の飼育容器において、アッセイには同数の雄と雌が必要です。採集したハエを5日間隔離した後、交配ホイールへの導入準備を行い、アッセイを実施します。次に、解剖顕微鏡下で、雌1匹と雄1匹を慎重に交配ホイールのチャンバーへ移します。ペアを10分間、またはその間に交尾が成功するまで観察します。いくつかの行動について、それぞれが初めて観察された時間を記録します。オスが初めてメスの方を向いた時間を記録してください。オスが脚でメスに最初に触れたとき、オスが最初に翅を広げて振動させたとき、オスがメスの生殖器を最初に舐めたとき、オスが最初に腹部を自分の下に丸めたとき、それぞれ記録します。オスがメスへのマウントを最初に試みたときも記録してください。最後に、交尾が起こるまで求愛行動に従事していた合計時間を記録します。野生型動物の場合、これはほぼ常に5〜10分以内であり、3つの異なるパラメータでデータを収集します。第一に、行動への潜時とは、その行動が最初に観察されるまでに要した時間のことです。第二に、行動の頻度とは、その行動が観察されたかどうかを指します。そして3つ目に、求愛指数とは、動物を用いた実験において、求愛に費やした時間を総時間および交尾までの時間で除したものです。筋萎縮性側索硬化症に関連するF-U-S-T-L-Sに突然変異を持つ個体において、挿入変異を持つ遺伝子変異体は、野生型対照群（左）の半分の這行能力を示し、R 5 21 Cミスセンス変異では這行速度がわずか約1 cm/minまで低下しました。若齢の野生型成体ショウジョウバエを用いたリングテストの結果、平均高さは3秒間で3〜5 cmの登攀距離でした。このアッセイでは、リングアッセイの試行において1分間隔で最大5回連続で試行しても、脱感作は観察されませんでした。タイミングに関しては、可能な限り正確に行うことが重要です。習熟すれば、適切に行うことで1つの遺伝子型につき10回の試行を観察する幼虫過密アッセイは30分から40分で完了させることができます。このビデオを視聴することで、ショウジョウバエにおける求愛行動の観察方法とスコアリングについても十分に理解できるはずです。

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JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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アッセイのメソッドショウジョウバエ行動

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