Name: の単一細胞解析枯草菌バイオフィルム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: 学ぶバイオフィルム内のBacillus subtilisの特異な細胞集団を蛍光顕微鏡とフローサイトメトリーで可視化・定量化する手法。転写レポーターを用いて単一細胞レベルで遺伝子発現をモニタリングし、微生物コミュニティの構造解析に役立つ。

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この作品は、ヴュルツブルク大学の感染症研究センター（ZINF）から、若手研究プログラムによって運営されている。フアン·C·ガルシア·Betancurは、ヴュルツブルク大学の生命科学研究科（脂質）から博士課程の仲間です。

<ol><li>Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+microbial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ind.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Overview of microbial biofilms.</a> J. Ind. Microbiol. 15, 137-140 (1995).</li>
<li>Davey, M. E., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+biofilms%3A+from+ecology+to+molecular+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64, 847-867 (2000).</li>
<li>Kolenbrander, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+microbial+communities%3A+biofilms%2C+interactions%2C+and+genetic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Oral microbial communities: biofilms, interactions, and genetic systems.</a> Annu. Rev. Microbiol. 54, 413-437 (2000).</li>
<li>O'Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+as+microbial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation as microbial development.</a> Annu. Rev. Microbiol. 54, 49-79 (2000).</li>
<li>Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+microbial+life+on+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Biofilms: microbial life on surfaces.</a> Emerg. Infect. Dis. 8, 881-890 (2002).</li>
<li>Lopez, D., Vlamakis, H., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Perspect.+Biol%22%5BJournal%5D)">Biofilms.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, a000398-a000398 (2010).</li>
<li>Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+the+matrix+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilms: the matrix revisited.</a> Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).</li>
<li>Branda, S. S., Chu, F., Kearns, D. B., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+major+protein+component+of+the+Bacillus+subtilis+biofilm+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A major protein component of the Bacillus subtilis biofilm matrix.</a> Mol. Microbiol. 59, 1229-1238 (2006).</li>
<li>Latasa, C., Solano, C., Penades, J. R., Lasa, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm-associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22C.+R.+Biol%22%5BJournal%5D)">Biofilm-associated proteins.</a> C. R. Biol. 329, 849-857 (2006).</li>
<li>O'Gara, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ica+and+beyond%3A+biofilm+mechanisms+and+regulation+in+Staphylococcus+epidermidis+and+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">ica and beyond: biofilm mechanisms and regulation in Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus aureus.</a> FEMS Microbiol Lett. 270, 179-188 (2007).</li>
<li>Chai, Y., Chu, F., Kolter, R., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bistability+and+biofilm+formation+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bistability and biofilm formation in Bacillus subtilis.</a> Mol. Microbiol. 67, 254-263 (2008).</li>
<li>Chen, R., Guttenplan, S. B., Blair, K. M., Kearns, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+sigmaD-dependent+autolysins+in+Bacillus+subtilis+population+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Role of the sigmaD-dependent autolysins in Bacillus subtilis population heterogeneity.</a> J. Bacteriol. 191, 5775-5784 (2009).</li>
<li>Guttenplan, S. B., Blair, K. M., Kearns, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+EpsE+flagellar+clutch+is+bifunctional+and+synergizes+with+EPS+biosynthesis+to+promote+Bacillus+subtilis+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The EpsE flagellar clutch is bifunctional and synergizes with EPS biosynthesis to promote Bacillus subtilis biofilm formation.</a> PLoS Genet. 6, e1001243-e1001243 (2010).</li>
<li>Kearns, D. B., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+population+heterogeneity+during+growth+of+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Cell population heterogeneity during growth of Bacillus subtilis.</a> Genes Dev. 19, 3083-3094 (2005).</li>
<li>Lopez, D., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+signaling+in+a+bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Paracrine signaling in a bacterium.</a> Genes Dev. 23, 1631-1638 (2009).</li>
<li>Veening, J. W., Smits, W. K., Hamoen, L. W., Jongbloed, J. D., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+differential+gene+expression+by+improved+cyan+fluorescent+protein+and+yellow+fluorescent+protein+production+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Visualization of differential gene expression by improved cyan fluorescent protein and yellow fluorescent protein production in Bacillus subtilis.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 6809-6815 (2004).</li>
<li>Veening, J. W., Smits, W. K., Hamoen, L. W., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+analysis+of+gene+expression+patterns+of+competence+development+and+initiation+of+sporulation+in+Bacillus+subtilis+grown+on+chemically+defined+media%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Single cell analysis of gene expression patterns of competence development and initiation of sporulation in Bacillus subtilis grown on chemically defined media.</a> J. Appl. Microbiol. 101, 531-541 (2006).</li>
<li>Veening, J. W., Kuipers, O. P., Brul, S., Hellingwerf, K. J., Kort, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+phosphorelay+perturbations+on+architecture%2C+sporulation%2C+and+spore+resistance+in+biofilms+of+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Effects of phosphorelay perturbations on architecture, sporulation, and spore resistance in biofilms of Bacillus subtilis.</a> J. Bacteriol. 188, 3099-3109 (2006).</li>
<li>Vlamakis, H., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cell+fate+by+the+formation+of+an+architecturally+complex+bacterial+community%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Control of cell fate by the formation of an architecturally complex bacterial community.</a> Genes Dev. 22, 945-953 (2008).</li>
<li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+heterogeneity+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nat. Rev. Microbiol. 6, 199-210 (2008).</li>
<li>Veening, J. W., Smits, W. K., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bistability%2C+epigenetics%2C+and+bet-hedging+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bistability, epigenetics, and bet-hedging in bacteria.</a> Annu. Rev. Microbiol. 62, 193-210 (2008).</li>
<li>Aguilar, C., Vlamakis, H., Guzman, A., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KinD+is+a+checkpoint+protein+linking+spore+formation+to+extracellular-matrix+production+in+Bacillus+subtilis+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">KinD is a checkpoint protein linking spore formation to extracellular-matrix production in Bacillus subtilis biofilms.</a> MBio. 1, (2010).</li>
<li>Lopez, D., Fischbach, M. A., Chu, F., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structurally+diverse+natural+products+that+cause+potassium+leakage+trigger+multicellularity+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Structurally diverse natural products that cause potassium leakage trigger multicellularity in Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 280-285 (2009).</li>
<li>Lopez, D., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannibalism+enhances+biofilm+development+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cannibalism enhances biofilm development in Bacillus subtilis.</a> Mol. Microbiol. 74, 609-618 (2009).</li>
<li>Arima, K., Kakinuma, A., Tamura, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfactin%2C+a+crystalline+peptidelipid+surfactant+produced+by+Bacillus+subtilis%3A+isolation%2C+characterization+and+its+inhibition+of+fibrin+clot+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Surfactin, a crystalline peptidelipid surfactant produced by Bacillus subtilis: isolation, characterization and its inhibition of fibrin clot formation.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 31, 488-494 (1968).</li>
<li>Romero, D., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+accessory+protein+required+for+anchoring+and+assembly+of+amyloid+fibres+in+B.+subtilis+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">An accessory protein required for anchoring and assembly of amyloid fibres in B. subtilis biofilms.</a> Mol. Microbiol. 80, 1155-1168 (2011).</li>
<li>Hardwood, C. R., Cutting, S. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHardwood%2C+CR+%22Molecular+Biological+Methods+for+Bacillus%22">Molecular Biological Methods for Bacillus</a>. , Wiley. (1990).</li>
<li>Novick, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+systems+in+staphylococci%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Genetic systems in staphylococci.</a> Methods Enzymol. 204, 587-636 (1991).</li>
<li>Yasbin, R. E., Young, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+in+Bacillus+subtilis+by+bacteriophage+SPP1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Transduction in Bacillus subtilis by bacteriophage SPP1.</a> J. Virol. 14, 1343-1348 (1974).</li>
<li>Branda, S. S., Gonzalez-Pastor, J. E., Ben-Yehuda, S., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fruiting+body+formation+by+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Fruiting body formation by Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 11621-11626 (2001).</li>
<li>Nakano, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((srfA+is+an+operon+required+for+surfactin+production%2C+competence+development%2C+and+efficient+sporulation+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">srfA is an operon required for surfactin production, competence development, and efficient sporulation in Bacillus subtilis.</a> J. Bacteriol. 173, 1770-1778 (1991).</li>
<li>Gonzalez-Pastor, J. E., Hobbs, E. C., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannibalism+by+sporulating+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cannibalism by sporulating bacteria.</a> Science. 301, 510-513 (2003).</li>
<li>Aguilar, C., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinking+about+Bacillus+subtilis+as+a+multicellular+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Thinking about Bacillus subtilis as a multicellular organism.</a> Curr. Opin. Microbiol. 10, 638-643 (2007).</li>
<li>Shapiro, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinking+about+bacterial+populations+as+multicellular+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Thinking about bacterial populations as multicellular organisms.</a> Annu. Rev. Microbiol. 52, 81-104 (1998).</li>
</ol>

我々は、開示することは何もありません。

細菌群集は、特定の遺伝子の証拠一連の微生物群集33,34の複雑性を発現する細胞の集団を示しているという事実。このプロトコルは、関心のある任意の遺伝子の発現が微生物群集内に特殊化した細胞の特定の集団に限定されているかどうかを判断するのに役立ちます。伝統的な方法は、全体の微生物群集と微生物群集内で遺伝子発現の変動に遺伝子発現やマイク​​ロアレイ解析率遺伝子発現のレベルを一般的に見逃して監視するので、これらの集団の可視化は、新しい技術の開発を必要とします。 蛍光顕微鏡とフローサイトメトリーは、関心のある集団の定義する定性的および定量的な組み合わせを提供するために、細胞の種類の分析のために理想的に補完します。両方の技術の限界は、番目のためにお互いを参照するために彼らが必要なように測定の精度の電子酒。蛍光顕微鏡の場合には、蛍光細胞（時には集団の大きさ）からの信号の強度は、サンプル（通常は50〜200ミリ秒の間）に励起するために使用される露光時間に応じて異なります。しかし、フローサイトメトリーの場合には、細菌細胞のサイズが小さい検出を制限し、いくつかの細菌は、監視すること...

<table border="1"><tbody><tr><td> テクニック </td><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td rowspan="11"> MSgg構成</td><td> 5mMのリン酸カリウム</td><td>ロート</td><td> 6878 </td></tr><tr><td> 100mMのMOPS </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> M1254 </td></tr><tr><td>塩化マグネシウム2mMの</td><td>ロート</td><td> 2189.1 </td></tr><tr><td>塩化カルシウム700μM </td><td>ロート</td><td> A119.1 </td></tr><tr><td>塩化第二鉄50μM </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> 157740 </td></tr><tr><td>塩化亜鉛1​​μM </td><td> Applichem </td><td> A2076 </td></tr><tr><td>チアミン2μM </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> 74625 </td></tr><tr><td>グリセロール0.5パーセント</td><td>ロート</td><td> 7533 </td></tr><tr><td> Glutaメイト0.5パーセント</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> 49621 </td></tr><tr><td>トリプトファン50μg/mlの</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> T0254 </td></tr><tr><td>フェニルアラニン50μg/mlの</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> P2126 </td></tr><tr><td>細胞固定</td><td>パラホルムアルデヒド</td><td>ロート</td><td> 0335 </td></tr><tr><td></td><td> 機器の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>超音波処理</td><td>セルソニケーター</td><td> Bandelin </td><td> D-1000 </td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡検査法</td><td>蛍光顕微鏡</td><td>ライカ</td><td> DMI6000B </td></tr><tr><td></td><td> ソフトウェアの名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡検査法</td> &lt;TD&gt;アサフ</td><td>ライカ</td><td></td></tr><tr><td>フローサイトメトリー</td><td> FCASDiva </td><td> BD </td><td></td></tr><tr><td>フローサイトメトリー</td><td> FlowJo </td><td> Treestar </td><td></td></tr></tbody></table>

の単一細胞解析枯草菌</em蛍光顕微鏡とフローサイトメトリーを用いて>バイオフィルム

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

バイオフィルム形成は、ほぼすべての細菌1-6一般的な属性です。細菌がバイオフィルムを形成するとき、細胞は主に7月10日 、他の要因の中で、タンパク質やexopolysaccharidesによって構成されている細胞外マトリックスに収められています。微生物群集は、多くの場合、11月17日特殊化した細胞の異なる集団の分化を示しています。バイオフィルム内に納められた。これらの集団が共存し、しばしばフィルム18から21の中で空間的および時間的な組織を示しています。 モデル生物の枯草菌のバイオフィルム形成は、特殊な細胞の異なる集団の分化をする必要があります。その中で、バイオフィルムの細胞外マトリックスを生成し、分泌する責任マトリックスプロデューサーの集団は、バイオフィルム形成11,19のために不可欠である。したがって、マトリックスの生産の分化は、Bのバイオフィルム形成の特徴である枯草菌。 我々は、Bのバイオフィルムのマトリックスの生産者の集団を視覚化し、定量化するために蛍光レポーターを使用している枯草菌 15,19,22-24。具体的には、マトリックスの生産者集団は、セルフ·プロデュース細胞外シグナルサーファ25の存在に応答して区別することを観察した。興味深いことに、サーファクチンは、マトリックスの生産者15の集団とは異なる特殊な細胞の集団によって生成されます。 我々は、このレポートで枯草菌のバイオフィルム内のマトリックスの生産者とサーファクチン生産者の集団を可視化し、定量化するために必要な技術的アプローチを紹介しています。これを行うには、行列の生産とサーファクチン生産に必要な遺伝子の蛍光レポーターは、Bの染色体に挿入され枯草菌 。記者は、特殊化した細胞の集団で表現されます。その後、集団は、することができます（図1参照）蛍光顕微鏡とフローサイトメトリーを用いて監視されます。 特殊化した細胞の異なった集団は、細菌の多地域内で共存するという事実は私達に原核生物における遺伝子発現の調節に関する異なる視点を提供します。このプロトコルは、実験的にこの現象に対処し、それが容易に微生物のコミュニティ内で表現型の不均一性の根底にある分子機構を解明するために、他の作業モデルに適合させることができます。

微生物のバイオフィルムは、一般的に特殊化した細胞の異なる集団によって構成されています。これらの集団の単一細胞解析では、蛍光レポーターを使用する必要があります。ここでは、いくつかのsubpopulationswithinを視覚化し、監視するためのプロトコルについて説明します。<em&gt; B.枯草菌</em&gt;蛍光顕微鏡とフローサイトメトリーを用いたバイオフィルム。

バイオフィルム形成は、ほぼすべての細菌に共通する特性である1-6。細菌がバイオフィルムを形成すると、細胞は大部分が...で構成される細胞外マトリックスに包み込まれる。

この手順の全般的な目的は、モデル生物である bacillus subtles のバイオフィルム内で分化する、特化した細胞の異なるサブポピュレーションを可視化し、定量化することです。これは、まず B subtles の染色体に転写リポーターを挿入することで達成されます。これらのリポーターは、研究対象となる細胞のサブポピュレーションにおいてのみ発現します。次のステップは、バイオフィルム誘導培地（Ms GG gg）で B subtles を培養し、バイオフィルムの形成を促進することです。バイオフィルム形成後、バイオフィルム中の細胞を分散させ、パラホルムアルデヒドで固定します。本手順の最終ステップでは、蛍光顕微鏡およびフローサイトメトリーを用いて、微生物コミュニティの単一細胞から放出される蛍光信号を検出します。最終的に、これらの結果は、産生と分泌に特化した細胞がどのように機能するかを示しています。バイオフィルムを構成する細胞外マトリックスを産生する細胞は、マトリックス産生細胞への分化を誘導するシグナル分子である界面活性剤を分泌する細胞とは異なるサブポピュレーションです。バイアビリティアッセイやマイクロアレイ解析を用いた転写発現の定量化などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、単一細胞レベルで遺伝子発現をモニタリングでき、特定の遺伝子を発現することに特化した極めて少数の細胞集団を可視化できる点にあります。これらの遺伝子発現は、集団全体を解析した場合には検出されません。B subtlesの標識には統合プラスミドが使用されており、その例をここに示します。PTAAは、tassの産生を担う遺伝子のプロモーターです。制限酵素Eco RIおよびHind IIIを用いて、マトリックスタンパク質をベクターにクローニングします。これにより、CFPレポーター遺伝子の発現がptapAの制御下に置かれます。B. subtilisの標識手順を開始するために、まず酵素消化によってインテグレーションプラスミドを線状化します。推奨される制限酵素はXho Iです。インテグレーションプラスミドの準備が整ったら、B. subtilis株168の細胞をコンピテンス誘導培地で37 °Cで5時間培養し、自然形質転換能を誘導します。線状化したプラスミドをコンピテントB subtilis細胞の培養液に加え、37 °Cで2時間インキュベートします。2時間後、スペクチノマイシンを含むアガープレートに細胞を播種し、37 °Cで一晩インキュベートします。B subtilisの染色体には、バイオフィルムの形成に影響を与えることなくレポーター融合遺伝子を組み込むことができる、Amy EおよびLAC Aという2つのニュートラル遺伝子座が存在します。線状化したPKM 0 0 8プラスミドは、二重組み換えによってB subtili

single-cell-analysis-bacillus-subtilis-biofilms-using-fluorescence

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

プロトコルは、共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）のために微生物膜を成長し、分析するためのフローセルシステムのアプリケーションを記述する。...

フローセル内の緑膿菌と出芽酵母のバイオフィルム

このプロトコルは、自動化された蛍光タイムラプス顕微鏡を用いて時間の異なる細菌の単セルの動作を監視するためにステップバイステップ手順を提供します。さらに、我々は、顕微鏡画像を分析する方法のガイドラインを提供します。...

の生細胞イメージング枯草菌と肺炎球菌自動タイムラプス顕微鏡を使用して

出典:ケイビーン、M. T.らバチルス・サブティリスの単細胞マイクロ流体解析。J. Vis.

マイクロ流体システムにおける細菌増殖を単細胞分解能で追跡

バイオフィルムは、周囲の環境と複雑な相互作用を持っています。バイオフィルムと環境の相互作用を包括的に研究するために、バイオフィルム開発のための不均一な化学環境を作り出すための一連の方法、局所的な流速の定量化、およびバイオフィルムコロニー内および周囲の物質輸送を分析するための一連の方法を紹介します。...

バイオフィルムと生息地異質の共同開発を特徴付けるための方法

進化のシナリオで品揃え（空間的分離）の役割は、空間分布の調整を可能にする制御された実験室での単純な微生物系を用いて調べることができます。創始細胞密度を変更することにより、様々な品揃えのレベルは、 枯草菌のコロニーバイオフィルム内の蛍光標識された菌株を使用して可視化することができます。...

微生物集団に定着表面に空間的分離の監視

このプロトコルは、成長し、質的に、共焦点顕微鏡および電子顕微鏡により真菌の菌糸上の細菌のバイオフィルムを分析するための新しい方法を説明しています。...

共焦点顕微鏡および電子顕微鏡を用いて糸状菌コロニー上の細菌のバイオフィルムの定性的マルチスケール解析のための新しい方法

例として枯草菌を使用して個々...

枯草菌の単一細胞マイクロ流体解析

視覚的クラスタ リングと組み合わせてフローサイトメトリー水生バイオ フィルムを研究するための使いやすい高速メソッドを提供しています。バイオ フィルムの特性評価、バイオ フィルムのコミュニティ構造の変化の検出とバイオ...

フローサイトメトリーによる水生バイオ フィルムの特性

この記事では、タンパク質の細胞内局在ダイナミクスを調査し、バチルス・サチリスおよび黄色ブドウ球菌における高分解能蛍光顕微鏡を用いて形態学的変化を監視するためのステップバイステップガイドを提供します。...

細菌における細胞内タンパク質の局在化と細胞形態の変化を調べる生細胞蛍光顕微鏡

細菌細胞のイメージングは、大きな高分子機械の機能を決定する静的および動的プロセスの定義に焦点を当てた新しいシステム生物学アプローチです。ここでは、定量的ライブ細胞イメージングとクライオ電子断層撮影の統合により、レジオネラ菌型肺炎球体系IV型分泌系のアーキテクチャと機能を研究しています。...

レジオネラ肺球菌ドット/Icm分泌系の空間的特徴を解決するためのライブ細胞イメージングとクライオ電子断層撮影の適用

このプロトコルは、フローサイトメトリーとカウントビーズを使用して、エチジウムブロマイドで標識された細菌胞子を定量化することに焦点を当てています。この方法は、無傷の胞子の表面におけるタンパク質の共有結合を分析するのにも効率的です。...

フローサイトメトリーにおける 枯草菌 胞子の計数と標識解析の改善

学ぶバイオフィルム内のBacillus subtilisの特異な細胞集団を蛍光顕微鏡とフローサイトメトリーで可視化・定量化する手法。転写レポーターを用いて単一細胞レベルで遺伝子発現をモニタリングし、微生物コミュニティの構造解析に役立つ。

の単一細胞解析枯草菌バイオフィルム

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