の単一細胞解析枯草菌バイオフィルム

この手順の全体的な目標は、モデル生物である微量桿菌のバイオフィルムで分化する特殊な細胞の異なる亜集団を視覚化し、定量化することです。これは、最初に転写レポーターをB微妙な染色体に挿入することによって達成されます。これらのレポーターは、研究中の細胞の亜集団でのみ発現されます。

次のステップは、バイオフィルム誘導媒体である Ms GG gg で B 微妙な粒子を成長させることにより、バイオフィルムの開発を促進することです。バイオフィルム形成後、バイオフィルムからの細胞をパラホルムアルデヒドで分散させ、固定します。手順の最後のステップは、蛍光、顕微鏡法、およびフローサイトメトリーを使用して、微生物群集の単一細胞から放出される蛍光シグナルを検出することです。

最終的に、結果は、細胞がどのように生成と分泌に特化したかを示しています。バイオフィルムを構成する細胞外マトリックスは、マトリックスプロデューサーの亜集団の分化に関与するシグナル伝達分子である界面活性剤を分泌する細胞とは異なる亜集団です。この手法は、Vita Itiesアッセイのマイクロレイ解析を用いた転写発現の定量化などの既存の方法に比べて、単一細胞レベルで遺伝子発現をモニタリングし、特定の遺伝子を発現する細胞に特化した細胞の特に小さな細胞集団を可視化できる点です。

これらの遺伝子発現は、全集団を解析する際には検出されません。統合プラスミドはB微量物の標識に使用され、その一例をここに示します。PTAAは、タスの生産に関与する遺伝子のプロモーターです。

マトリックスタンパク質は、制限部位ECO R oneおよびHindi 3を使用してベクターにクローニングされます。CFPレポーター遺伝子の発現は、現在、ptap Aの制御下にあり、Bの標識手順を開始し、酵素消化によって統合プラスミドを微妙に直鎖化します。推奨される制限酵素は、統合プラスミドの準備ができたときにXH oh oneであり、37°Cで5時間培地を誘導する能力で細胞を増殖させることにより、Bサブトレスト株1 68の自然な能力を誘導します。

直鎖状プラスミドをコンピテントBサブレスト細胞の培養液に加え、2時間後に摂氏37度で2時間インキュベートし、細胞を寒天上にスペクトマイシンで播種し、摂氏37度で一晩インキュベートします。B微妙な染色体には、Amy、E、E、LAC Aの2つの中性遺伝子座があり、バイオフィルムの発達に影響を与えることなくレポーター融合を統合するために使用できます。直鎖化されたPKM 0 0 8プラスミドは、二重組換えによってB微妙なゲノムに組み込まれます。

次のステップは、レポーターを標識された株から、SPP one phage transduction protocolを使用してバイオフィルムを形成できる株に移すことです。このビデオでは、プロトコルの重要な手順のみを示しています。ドナー株1 68を増殖させ、レポーター融合を37°CのTY培地に保持し、培養物がガラス管内の細胞の200マイクロリットルから希釈されたファージストックの100マイクロリットルの初期固定相に達するまで

そして、摂氏37度で15分間立ってみましょう。次に、熱いTY軟質寒天をチューブにピペットで入れ、ボルテックスして十分に混合します。新鮮なTYプレートに静かに広げ、摂氏37度で8〜16時間インキュベートして、ファージハローが発生するまで待ちます。

ファージハローを採取するには、プレートに3ミリリットルのTY培地を追加し、ガラスピペットを使用して上部の寒天を分解します。寒天懸濁液を15ミリリットルのファルコンチューブに移します。穏やかにボルテックスして寒天を分解し、1000Gで15分間遠心分離します。

上清を新しいチューブに移します。上清をポイント22ミクロンのシリンジフィルターに通します。この上清を使用して、TY培地で増殖したレシピエント株の培養

1〜10に希釈した10ミリリットルの培養物に30マイクロリットルの上清を加え、摂氏37度で30分間インキュベートします。その後、5, 000 RPMで7分間遠心分離した後、ペレットを200マイクロリットルのTY培地に懸濁し、SPECTマイシンと10ミリモルを含むプレート上に広げます。クエン酸ナトリウム。

摂氏37度で12〜36時間インキュベートします。コロニーを選択し、摂氏37度の液体LBで一晩成長させます。最後に、固体バイオフィルム誘導培地で3マイクロリットルの一晩培養物を見つけます。

細胞を摂氏30度で72時間増殖させます。3日間の成長後、Ms.GG 寒天の表面に形成されたバイオフィルムは、寒天の表面に複雑な形態学的構造を発達させます。この手順を開始するには、つまようじまたはピンセットを使用して、MSGG寒天の表面からバイオフィルムを取り除きます。

バイオフィルムの粘稠度により、寒天の表面からバイオフィルムを剥がすことができます。1ピースで、バイオフィルムを3ミリリットルのPBSバッファーに入れ、バイオフィルムをマイルドに分散させます。出力3、振幅0.7秒で12パルスを実行し、シングルセル分析の前にサンプルを固定します。

Resusは、300マイクロリットルの細胞懸濁液を1ミリリットル、4%パラホルムアルデヒド溶液に懸濁し、室温で正確に7分間インキュベートします。7分間の固定後、PBSバッファーで細胞を3回洗浄します。最後に、蛍光顕微鏡検査の前に、細胞を300マイクロリットルのPBSバッファーに再懸濁します。

スライド上に0.8%アグロスを200マイクロリットル分注し、別のスライドで慎重に覆うことで顕微鏡スライドを調製します。2分後、上部のスライドをそっと取り外して、下部のスポットのスライドに付着したアグロスの層を取得します。アグロス層の表面に2マイクロリットルの固定細胞を固定し、それを顕微鏡カバーガラスで覆います。

サンプルを蛍光顕微鏡のステージに置きます。実験で選択した条件で蛍光を示さないネガティブコントロールに従って励起周期を設定します。露出は 50 から 200 ミリ秒の間である必要があります。

各視野の蛍光画像と明視野画像を取得します。フローサイトメトリー分析用の細胞を調製するには、固定細胞のサンプルをマイルドな超音波処理によって分散させます。出力が5、振幅が0.7秒の12パルスを2回連続して実行し、細胞溶解を引き起こさずに凝集体を単一細胞に分散させます。

細胞分散の効率を光学顕微鏡で確認します。次に、サンプルをPBSバッファーで100に希釈します。BD FAX Canto 2 フロー サイトメーターは、YFP 蛍光のこの分析に使用されます。

CFP蛍光には、5 30 30フィルターと組み合わせた488ナノメートルのレーザー励起が使用されます。405ナノメートルでのレーザー励起と4 0 8 40フィルターの組み合わせを使用し、2つのネガティブコントロールでフローサイトメーターを校正します。懸濁液中の細胞を含まないPBSバッファーのサンプルは、フローサイトメーターで感知される粒子のサイズのネガティブコントロールとして機能するはずです。

蛍光レポーターのないサンプルは、フローの蛍光感度のネガティブコントロールとして機能する必要があります。サイトメーターは、キャリブレーション後、蛍光レポーターでラベル付けされたサンプルを各サンプルのフローサイトメーターに配置し、毎秒303, 000イベント間の流量で少なくとも50, 000イベントを分析します。バイオフィルム誘導培地のプレート上でB Subtlesが成長すると、摂氏30度での3日間のインキュベーション後にMSGGバイオフィルム形成が観察されます。

バイオフィルムは、異なる関与細胞亜集団を示す複雑な形態学的構造を示しています。例えば、細胞外マトリックスやバイオフィルムが生成されると、コロニーの表面にしわが形成されます。この図は、蛍光顕微鏡を用いて単一の標識株における細胞分化を可視化した例を示しています。

この株は、青色で着色されたマトリックス産生細胞の亜集団で発現するCFPである蛍光レポーターPtapを保有しています。この亜集団は、バイオフィルムを構成する細胞外マトリックスを産生し、分泌します。この次の画像は、レポーターPtap、A CFP、および追加のレポーターP Surfactin YFPを保有する二重標識株を蛍光顕微鏡で可視化した結果です。

この2つ目のレポーターは、シグナル伝達分子のサーファクチンを分泌する細胞の亜集団のモニタリングを可能にし、マトリックス産生者の分化のためのシグナル伝達カスケードをトリガーします。ここでは、マトリックスプロデューサーは青色で偽色、界面活性剤プロデューサーは黄色で偽色で、レポーターptapを保有する単一の標識株を使用した2Dフローサイトメトリーの結果です。YFBはここに表示されます。

蛍光タンパク質遺伝子を含まずに未処理の対照株は、ptapを有する相対蛍光細胞が低い単一の集団を示した。非バイオフィルム誘導条件下でのYFPは、マトリックス生産者の亜集団を区別せず、全集団も低い相対蛍光を示しました。対照的に、バイオフィルム誘導条件下では、相対蛍光の高い細胞の亜集団が、低い相対蛍光の右側の肩として検出されました。

3Dフローサイトメトリーから得られたピーク結果を以下に示します。モニターされたチャネルの蛍光シグナルは、YFPの場合はX軸、CFPの場合はY軸で示され、左上のパネルはバックグラウンド蛍光のコントロールとして蛍光タンパク質遺伝子を持たない株を示しています。右上のパネルでは、黄色で囲まれたYFP蛍光チャネルのサーファクチン生産者の亜集団を検出するために、単一の標識株が使用されました。

左下のパネルでは、マトリックス生産者の亜集団を検出するために、別の単一の標識株が使用されました。青色で囲まれたCFP蛍光チャネルでは、マトリックス生産者と界面活性剤生産者の亜集団を二重標識菌株を使用してモニターし、結果を表示します。この右下のパネル。

蛍光レポーターを高レベルで発現する細胞の2つの亜集団が検出されました。各集団は、特殊な細胞の2つの亜集団間でレポーターの発現に重複がないことを示すフレーム化されています。この最終的な図は、3Dフローサイトメトリーによるマトリックス生産者と人食い人種の亜集団の定量化を示しています。

右上のパネルでは、1つの標識株を使用して、人食い動物の亜集団を検出しました。黄色で囲まれたYFP蛍光チャネルでは、この人食い人種の亜集団は、マトリックス生産者の亜集団と協調して区別するように説明されています。左下のパネルでは、マトリックス生産者の亜集団がCFP蛍光チャネルの別の単一の標識株で検出されています。

青色で囲んだ右下のパネルの二重標識株の結果は、緑色で囲まれたCFPのYFPの両方を発現する蛍光細胞の単一の亜集団を示しました。2人のレポーターの同時発現は、両方の細胞分化経路が同じ亜集団で座標活性化されていることを示しています。このビデオを見れば、蛍光顕微鏡やフローサイトメトリーなどの細胞集団の細胞分析を使用して、微生物バイオフィルムを構成する細胞の異なる亜集団を視覚化し、定量化する方法を十分に理解できるはずです。