の単一細胞解析枯草菌バイオフィルム

本手順の全体的な目的は、モデル生物であるbacillus subtlesのバイオフィルム内で分化する、特殊化した細胞の異なるサブポピュレーションを可視化し、定量化することです。これは、まずB subtlesの染色体に転写リポーターを挿入することで達成されます。これらのリポーターは、研究対象となる細胞のサブポピュレーションにおいてのみ発現します。

次のステップでは、バイオフィルム誘導培地であるMs GG ggでB subtlesを培養し、バイオフィルムの形成を促進します。バイオフィルム形成後、バイオフィルム内の細胞を分散させ、パラホルムアルデヒドで固定します。本手順の最終ステップでは、蛍光顕微鏡およびフローサイトメトリーを用いて、微生物コミュニティの単一細胞から放出される蛍光信号を検出します。

最終的に、これらの結果は、産生および分泌に特化した細胞の状態を示しています。バイオフィルムを構成する細胞外マトリックスを産生する細胞は、マトリックス産生細胞への分化を促すシグナル分子である界面活性剤を分泌する細胞とは異なるサブポピュレーションです。Vita Itiesアッセイやマイクロアレイ解析を用いた転写発現の定量化などの既存の手法と比較した本手法の主な利点は、単一細胞レベルで遺伝子発現をモニタリングでき、特定の遺伝子を発現するように特化した特に小規模な細胞集団を可視化できる点にあります。

これらの遺伝子発現は、集団全体を分析したときには検出されません。B subtlesの標識には統合プラスミドが使用され、その例をここに示します。PTAAは、tassの産生に関与する遺伝子のプロモーターです。

制限酵素部位Eco RIおよびHind IIIを用いて、マトリックス蛋白質をベクターにクローニングします。これにより、CFPレポーター遺伝子の発現がptapAの制御下に入ります。B. subtilisの標識手順を開始するため、酵素消化によりインテグレーションプラスミドを直線化します。推奨される制限酵素はXho Iです。インテグレーションプラスミドの準備が整ったら、B. subtilis菌株168をコンピテンス誘導培地中にて37 °Cで5時間培養し、自然形質転換能を誘導させます。

線状化したプラスミドをコンピテントB. subtilis細胞の培養液に加え、37°Cで2時間インキュベートする。2時間後、スペクチノマイシンを含む寒天培地に細胞を塗布し、37°Cで一晩インキュベートする。B. subtilisの染色体には、バイオフィルムの形成に影響を与えずにレポーター融合遺伝子を組み込むことができる2つのニュートラル遺伝子座（AmyEおよびLAC A）が存在する。線状化したPKM 0 0 8プラスミドは、二重組み換えによってB. subtilisのゲノムに組み込まれる。

次のステップは、SPP 1ファージ導入プロトコルを用いて、標識株からバイオフィルムを形成可能な株へレポーターを導入することです。このビデオでは、プロトコルの重要な手順のみを示します。レポーター融合遺伝子を持つドナー株1 68を、TY培地を用いて37 °Cで、培養液が定常期初期に達するまで増殖させます。ガラスチューブ内で、200 µLの細胞に100 µLの希釈ファージストックを加えます。

その後、37 °Cで15分間静置します。次に、加熱したTYソフトアガーをチューブにピペッティングし、ボルテックスミキサーで十分に混合します。これを新しいTYプレート上に緩やかに塗り広げ、37 °Cで8～16時間培養して、ファージハローを形成させます。

ファージハローを回収するため、プレートに3 mLのTY培地を加え、ガラスピペットを用いて最上層の寒天を砕きます。寒天懸濁液を15 mLファルコンチューブに移します。ボルテックスで穏やかに混合して寒天を分散させた後、1000 Gで15分間遠心分離します。

上清を新しいチューブに移します。上清を22 µmのシリンジフィルターでろ過します。この上清を用いて、TY培地で培養したレシピエント株を感染させます。

10倍に希釈した培養液10 mLに、上清30 µLを加え、37 °Cで30分間インキュベートします。その後、5,000 RPMで7分間遠心分離し、ペレットを200 µLのTY培地で再懸濁させ、10 mMクエン酸ナトリウムを含むSPECTmycinプレートに塗布します。

37°Cで12～36時間インキュベートします。コロニーを1つ選択し、液体LB培地を用いて37°Cで一晩培養します。最後に、一晩培養した液 3 µLを固体バイオフィルム誘導培地にスポットします。

細胞を30°Cで72時間培養します。3日間の培養後、Ms.GG寒天培地の表面に形成されたバイオフィルムは、培地表面に複雑な形態構造を形成します。この手順を開始するために、つまようじまたはピンセットを使用して、MSGG寒天培地の表面からバイオフィルムを除去します。

バイオフィルムの整合性は、寒天の表面から剥がし取ることができる程度である必要があります。バイオフィルムを一枚の塊として 3 mL の PBS バッファーに入れ、穏やかに分散させます。シングルセル解析に先立ち、出力 3、振幅 0.7 秒の条件で 12 回パルス処理を行い、サンプルを固定します。

細胞懸濁液 300 µL を 1 mL の 4% パラホルムアルデヒド溶液に再懸濁し、室温で正確に 7 分間インキュベートします。 7 分間の固定後、PBS バッファーで細胞を 3 回洗浄します。最後に、蛍光顕微鏡観察の前に細胞を 300 µL の PBS バッファーに再懸濁します。

顕微鏡スライド上に0.8% agrosを200 µLピペッティングし、別のスライドで慎重に覆い、顕微鏡スライドを準備します。2分後、上のスライドをゆっくりと取り除き、下のスライド上のスポットにagrosの層を形成させます。agros層の表面に固定細胞を2 µL滴下し、顕微鏡用カバーガラスで覆います。

サンプルを蛍光顕微鏡のステージ上に置きます。実験に選択した条件下で蛍光を示さないネガティブコントロールに従って、励起時間を設定してください。露光時間は50から200ミリ秒の間にする必要があります。

各視野について、蛍光画像および明視野画像を取得します。フローサイトメトリー解析に向けて細胞を調製するため、固定した細胞サンプルを穏やかな超音波処理で分散させます。細胞溶解を起こさずに凝集塊を単一細胞に分散させるため、出力5、振幅0.7秒の条件で12パルスを2シリーズ行います。

光学顕微鏡を用いて細胞分散の効率を確認します。次に、サンプルをPBSバッファーで100倍に希釈します。YFP蛍光の解析には、BD FACS Canto II フローサイトメーターを使用します。

CFP蛍光には、488 nmのレーザー励起と530/30フィルターを組み合わせて使用します。405 nmのレーザー励起と408/40フィルターを組み合わせた状態で、2つの陰性コントロールを用いてフローサイトメーターの校正を行います。フローサイトメーターで検知される粒子のサイズに対する陰性コントロールとして、細胞を含まないPBSバッファーのサンプルを使用してください。

蛍光レポーターを含まないサンプルを、フローサイトメーターの校正後の蛍光感度のネガティブコントロールとして使用してください。各サンプルの蛍光レポーターでラベル付けしたサンプルをフローサイトメーターにセットし、フローレートを303,000 events per secondとして、少なくとも50,000イベントを解析します。B. subtilisをバイオフィルム誘導培地のプレートで培養し、30 °Cで3日間インキュベートした後、MSGGバイオフィルムの形成が観察されます。

バイオフィルムは、関与する細胞の異なるサブポピュレーションを示す複雑な形態学的構造を呈しています。例えば、細胞外マトリックスとバイオフィルムの産生により、コロニーの表面にしわが形成されます。この図は、蛍光顕微鏡を用いて、単一の標識株における細胞分化を可視化した例を示しています。

この株は蛍光レポーターPtap, A CFPを保持しており、青色に染色されたマトリックス産生細胞のサブポピュレーションにおいて発現します。このサブポピュレーションは、バイオフィルムを構成する細胞外マトリックスを産生および分泌します。次の画像は、レポーターPtap, A CFPおよび追加のレポーターP Surfactin YFPを保持する二重標識株を蛍光顕微鏡で可視化した結果です。

この2番目のレポーターにより、マトリックス産生細胞の分化に向けたシグナル伝達カスケードを誘発するシグナル分子サーファクチンを分泌する細胞サブポピュレーションのモニタリングが可能になります。ここでは、レポーターptapを保持する単一標識株を用いた2Dフローサイトメトリーの結果が示されており、マトリックス産生細胞は青色に、サーファクチン産生細胞は黄色に擬似着色されています。ここにYFBを提示します。

蛍光タンパク質遺伝子を持たない未処理のコントロール株では、ptapを保持する細胞に低相対蛍光を持つ単一の集団が認められました。非バイオフィルム形成誘導条件下では、YFPによってマトリックス産生細胞のサブポピュレーションを区別することはできず、集団全体が低相対蛍光を示しました。対照的に、バイオフィルム形成誘導条件下では、低相対蛍光の右側にショルダーとして、高相対蛍光を持つ細胞のサブポピュレーションが検出されました。

3Dフローサイトメトリーから得られたピークの結果をここに示します。モニターしたチャネルの蛍光信号は、X軸にYFP、Y axisにCFPとして提示されています。左上のパネルは、背景蛍光のコントロールとして、蛍光タンパク質遺伝子を持たない株を示しています。右上のパネルでは、黄色い枠で囲まれたYFP蛍光チャネルにおいて、サーファクチン産生菌のサブポピュレーションを検出するために単一標識株が使用されました。

左下のパネルでは、マトリックス産生細胞のサブポピュレーションを検出するために、別の単一標識株が使用されました。青い枠で囲まれたCFP蛍光チャネルでは、二重標識株を用いてマトリックス産生細胞と界面活性剤産生細胞のサブポピュレーションをモニタリングしており、その結果がこの右下のパネルに示されています。

蛍光リポーターを高レベルで発現している2つの細胞サブポピュレーションが検出されています。各ポピュレーションを枠で囲むことで、これら2つの分化した細胞サブポピュレーション間において、リポーターの発現に重複がないことを示しています。この最後の図は、3Dフローサイトメトリーによるマトリックス産生細胞と共食い細胞のサブポピュレーションの定量結果を示しています。

右上のパネルでは、単一標識株を用いてカニバル（共食い個体）のサブポピュレーションを検出しています。黄色い枠で囲まれたYFP蛍光チャンネルにおいて、このカニバルのサブポピュレーションは、マトリックス産生個体のサブポピュレーションと協調的に分化することが説明されています。左下のパネルでは、別の単一標識株を用いて、CFP蛍光チャンネルでマトリックス産生個体のサブポピュレーションを検出しています。

右下のパネルにおいて、青枠で囲まれた二重標識株の結果では、YFPと緑枠で囲まれたCFPの両方を発現する単一の蛍光細胞サブポピュレーションが示されました。これら2つのレポーターが同時に発現していることは、同一のサブポピュレーションにおいて両方の細胞分化経路が協調的に活性化されていることを示しています。このビデオを視聴することで、蛍光顕微鏡やフローサイトメトリーなどの細胞集団解析を用いて、微生物バイオフィルムを構成する異なる細胞サブポピュレーションを可視化および定量化する方法について十分に理解できたはずです。