蛍光共鳴エネルギー移動によるリガンド - 受容体相互作用のリアルタイム監視

次の実験の全体的な目標は、リガンド受容体と蛍光共鳴エネルギー移動との相互作用を監視することです。ここで紹介する手法は、PDAの紫外可視電子吸収スペクトルにおけるPDA BLUESHIFTの興味深い特性を利用しています。分析物がPDAに結合した受容体と相互作用した後、最初にポリマーDアセチレンまたはPDAが合成され、PDAリポソームが調製されます。

次に、Rドミンタグ付きBSAがPDAリポソーム表面に結合します。次に、蛍光共鳴エネルギー移動が測定されます。リポソーム結合BSAロッドドミンの発光スペクトルは、PDAの吸収スペクトルと重なります。

これにより、フレット機構の共振要件を満たしています。したがって、リガンドと受容体との間の相互作用を示すデータを得ることができる。Elizaのような既存の方法に対するこの手法の主な利点は、この方法が非常にシンプルで安価であることです。

蛍光は本質的に熱量測定よりも感度が高いため、非常に低いサブナノモルまたはより低い濃度で検出限界を持つことができます。この技術の意味するところは、細菌やウイルスのセンシングにまで及び、これらの微生物を非常に低濃度で選択的に感知することができるためです。この手法を思いついたのは、2010年に脅威訪問PALラインセンサーの有効性を発見したときでした。

ドナーとアクセプターという2つの分子があり、両方の分子が互いに結合しているとします。次に、ドナーにある程度のエネルギーを与えると、ドナーは基底状態から励起状態に励起され、このエネルギーはアクセプターに転送されます。したがって、基底状態のアクセプターはこのエネルギーを受け入れ、蛍光抵抗エネルギー移動で励起されます。

同じことが起こりますが、蛍光に関しては、ドナーが励起されますが、エネルギーはアクセプターに伝達され、アクセプターが蛍光を発するものです。これは、2つの電球が一緒になっていて、一方の電球に電気を与えているのに、もう一方の電球は電気なしで吹いているようなものです。ここでは、フレットの距離依存性を示したいと思います。

フレットは、ドナーとアクセプターが互いに非常に接近しているとき(約10ナノメートル)にのみ機能します。ここでドナー分子を興奮させましょうが、ご覧の通りアクセプター分子は遠いです。そのため、ドナーにある程度のエネルギーを与えても、アクセプター分子には伝わりません。

だからFフレッドは機能しません。したがって、Fフレッドは距離に依存します。ヒドロキシCIN助剤、Dアセチレン、またはN-H-S-P-C-D-Aは、リポソームの調製に不可欠な成分です。

この手順全体を通して、PDA溶液を光から保護する必要があります。すべての容器にアルミホイルを包み込み、化学薬品のヒュームフードで合成を開始します。丸底のフラスコに、10 12ペンテコステ派のジイン酸、末端のヒドロキシCINアミド、および1つの3ジメチルアミノプロピルを組み合わせます。

丸底フラスコに20ミリリットルの乾燥クロロメタンの最終容量に入った3つのカルビミドエチル塩酸塩。溶液を室温で2時間攪拌します。フラスコがしっかりと閉じていることを確認してください。

次に、フラスコをロータリーエバポレーターに移して溶媒を取り除きます。溶媒が除去されると、乾燥した薄膜がドラフトの下に残ります。25ミリリットルのダチルエーテルと25ミリリットルの水からなる溶液を丸底フラスコに加え、約1分間静かに渦巻きます。

残渣を再構成するには、溶液を分離漏斗に移し、数回反転させて混合します。エチルエーテル層と水層が分離したら、スピゴットを開けてビーカーの水性層を取り除きます。次に、分離漏斗に25ミリリットルの水を加えて混ぜます。

前と同じように抽出プロセスを繰り返し、合計3回の抽出を行います。最後の抽出に続いて各抽出からの有機層を組み合わせ、有機層を1グラムの硫酸マグネシウムで30分間乾燥させます。ワットマンフィルターを使用して、濾紙を等級付けし、溶液をろ過します。

次に、回転蒸発によってエチルエーテルを除去し、N-H-S-P-C-D-Aの白色固体粉末を得る。次に、2〜3ミリグラムの粉末をNMRチューブ内の重水素化クロロホルムに移します。ここに示すように、核磁気共鳴を使用してN-H-S-P-C-D-Aを分析します。

新しいNMRのピークは2.842に見られます。丸底フラスコで調製するには、PCDAをP-C-D-A-N-H-Sに1つ、2つのジアリストSNグリセロール、3つのホスホコリン、20ミリリットルのジクロロメタンに8対1で攪拌しながら溶解します。次に、ワトマン濾紙を漏斗の中に入れ、溶液を注いで骨材を取り除きます。

丸い底のフラスコに集めます。フラスコをロータリーエバポレーターに移し、溶媒を完全に蒸発させてモノマーの薄膜を生成します。真空を使用して、薄膜を一晩乾燥させます。

翌日、50ミリリットルの脱イオン水を加えて、0.65〜1ミリモルのリポソーム溶液を作ります。次に、溶液を新しい50ミリリットルのビーカーに移し、得られた懸濁液を76°Cのプローブエーターで約18分間超音波処理します。溶液を漏斗内のワットマン濾紙に慎重に通して脂質凝集体を取り除き、フラスコに集めます。

溶液を摂氏4度で一晩置くと、モノマーの自己組織化が促進されます。翌日の溶液は、光学的に透明で、自己組織化ジアアセチレンモノマーリポソームを254ナノメートルの紫外線を約2分間照射して重合する必要があります。空気中のペン光線UV光源を使用すると、透明な溶液は紫外線にさらされると青くなります。

リポソーム溶液は、室温で少なくとも2週間安定であり、冷蔵するとより安定します。BSAロッドドミンをリポソーム表面に結合するには、BSAロッドドミンをPBSに溶解して最終濃度の1.2マイクロモルのBSAロッドドミン溶液にし、前のセクションで調製した10ミリリットルのリポソーム溶液に2ミリリットルのBSAロッドドミンを室温で加えます。タンパク質のリジン残基からNHS基によって活性化されたカルボン酸にアミン基が結合する古典的な反応が追跡されています。

N-H-S-P-C-D-Aは、NHSアミン反応を使用してタンパク質分子をリポソームと共有結合するために設計されました。NHSは、アミンカルボン酸反応を前進方向に駆動する優れた脱離剤です。適切な条件下でのこの反応の収率は定量的であるべきです。

遊離BSAロッドドミンを除去するには、スペクトル細孔、分子量カットオフ100、000のバイオテックセルロースエステル膜を脱イオン水で15分間脱イオン水に入れ、1リットルのビーカーで透析を行い、分子量約66、000の分子量を持つ非反応性BSAルミンを除去します。ダルトンは溶液を慎重に透析膜に移し、800ミリリットルに浸します。暗闇の中で脱イオン水、48時間後の2、8、14、24、36時間後に水を交換し、最終溶液をアルミホイルで覆われたバイアルに移します。

バイアルを摂氏4度で保存し、フレットBSAを使用してタンパク質の結合をモニターします。ロッドドミンは、重合前後のタグ付きリポソームを、単離されたドナーとアクセプターについてここで見られるように、UV Vおよび蛍光分光法で分析しました。フレット効率はドナーアクセプター距離に大きく依存し、J.電子吸収の出現によるr domineとPDAの間のフレットのために、発光の消光が観察されます。

光重合後の青色PDAのスペクトル。ここで、未重合リポソームとロッドドミンのフレット効率はゼロです。これは、可視領域の非重合リポソームのスペクトルオーバーラップがゼロであるためです。このビデオで説明したように調製したロッドドミンとPDAリポソームの間のフレットをモニターするために、UN重合および重合ビオチンタグ付きリポソームを紫外可視分光法と蛍光分光法を用いて分析しました。

ここで見ることができるように、反ルミンSR1 0 1の放出は重合後に約45%減少し、溶液へのストレプトアビジンの添加によるフレットによる放出消光を示唆しています。J値で示されるスペクトルの重なりは、ここで見られるように減少します。ストレプトアビジン濃度の増加に伴い、フレット効率が低下しました。

ビオチンストレプトアビジン相互作用後のsofo Rドミン発光スペクトルおよびPDA吸収スペクトルのJ値の減少により、ストレプトアビジン添加後にRドミン発光が増加しました。このことは、分子レベルでは、ビオチンストレプトアビジンの相互作用がPDAの有効結合長に微妙な変化をもたらし、その結果、青色のPDA型がより熱力学的に安定した赤色のPDA型に減少することを示唆しています。このビデオを見た後、この手順に従って、脅威を使用してリガンドプリセプターの相互作用を選択的に監視する方法を十分に理解しているはずです。

イライザのような他の方法は、タンパク質の選択的結合のような追加の質問に答えるために実行できます。