新生仔ラットの脳組織の混合グリア細胞培養物から主要なミクログリアの分離

脳の細胞の不均質性からプライマリミクログリアを分離すると、生理学的および病理学的条件の両方で彼らの役割を調査することが不可欠である。このプロトコルは、機械的な分離と高収率かつ高純度を提供する混合細胞培養技術、実行可能な主なミクログリア細胞について説明します。

この手順の全体的な目標は、新生児ラットの脳から初代ミクログリア細胞培養物を調製することです。これは、最初に脳を分離し、髄膜を取り除くことによって達成されます。第2のステップは、脳を均質化し、混合グリア培養物をT75フラスコにプレートすることです。

次に、アストロサイト単層が合流に達するまで、フラスコを10〜14日間インキュベートします。最後のステップは、フラスコを振って、アストロサイト単層の上で成長しているミクログリアを放出し、ミクログリアの精製培養を行うことです。最終的に、高純度の初代ミクログリアは、その後のin vitroシングルセル培養および共培養アッセイに使用することができます。

この手法がPerico gradient法のような既存の方法と比較した場合の主な利点は、名目上の機械的破壊によりミクログリアの機能不全や活性化が最小限に抑えられ、実験用のミクログリアを初期調製後数週間生成できることです。私は、Dr.Clifton Dau guardの研究室の大学院生であるTammy Teroと一緒にこの手順を実演します。このプロトコールで得られた高純度のミクログリア培養物は、正常な生理学的条件下でのミクログリア機能だけでなく、病理学的疾患条件下でのミクログリア機能を研究するためのin vitro実験にも使用できます。

ミクログリア、組織損傷に対する反応性、および炎症刺激は、神経学的損傷および神経変性疾患の状態に直接関連しています。一般に、この方法に不慣れな人は、初代ミクログリア培養物の線維芽細胞汚染を減らすために脳組織から髄膜を適時に除去する方法に慣れていないため、苦労する可能性があります。また、フラスコの振とうやミクログリア培養物の取り扱い中にアストロサイト単層を傷つけないように注意する必要があります。

手順の準備として、Chi LiviはL 15メディアから摂氏4度で、L 15メディアを含む60 x 15ミリメートルのシャーレの準備ができており、氷上に置きます。培地を摂氏37度に温め、すべての手術器具が滅菌されていることを確認してください。鋭利なハサミでP oneからP 5のラットの子犬の首を切った後、頭を70%エタノールに落とします。

5匹のラットの子犬の頭を採取した後、頭を生理食塩水に移します。耳の上の頭蓋骨の両側を慎重に切開し、脳を引き出して、氷上のL 15培地を含むペトリ問題の1つに引き込むことにより、各頭から全脳を取り出します。最初の5つの脳が氷上でL15に移されたら、すべての脳が収集されたときに、次の5匹の子犬も同じ方法で処理できます。

髄膜シートの端を鉗子でそっとつかみ、下にある皮質から慎重に剥がして、髄膜を取り除きます。髄膜を完全に除去し、できるだけ早く除去することが不可欠です。髄膜を取り除いた後、各脳を氷上のL15培地の新鮮なペトリ皿に移します。

10ミリリットルのピペットを使用して、プレートから脳組織と培地を滅菌済みの50ミリリットルの円錐管に吸引します。次に、摂氏4度で5分間、2、500 RCFで遠心分離します。遠心分離後吸引します。

その後、穿轍は滅菌済みの10ミリリットルピペットをリースに使用します。ペレットを4〜5ミリリットルの新鮮なL 15培地に懸濁し、培地とティッシュを10回上下にピペットで動かします。次に、100ミクロンの細孔細胞ストレーナーを新しい50ミリリットルの円錐管に置きます。

滅菌済みの5ミリリットルピペットを使用して組織懸濁液を上下にピペットで動かし、ピペットを細胞ストレーナーにフラッシュした状態で、細胞ストレーナーを介して材料を円錐管に分注します。ストレーナーを4〜5ミリリットルの新鮮な冷やしたL 15メディアですすいでください。次に、2, 500 RCFを摂氏4度の5分間遠心分離します。

処理されたラットの子犬の脳ごとに、各フラスコに12ミリリットルの戦前の培養培地を追加して、滅菌済みのT75フラスコを準備します。次に、ペレット化した細胞からサップナタントを吸引した後、細胞ペレットに5〜6ミリリットルの培地を加え、10ミリリットルのピペットで10回上下にピペットします。次に、等量の細胞懸濁液を各T75フラスコに移します。

フラスコを5%二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度で1〜3週間インキュベートし、最初のプレーティング後最初の5日間は細胞を邪魔されずに放置します。5日後、各フラスコのコンディショニング培地を12ミリリットルの新鮮な培地と交換して、合流させます。これは、細胞が付着するフラスコの底に触れずに非常に慎重に行う必要があります。

混合グリア培養物が完全に合流したら、インキュベーターからフラスコを取り出します。フラスコキャップをパラムで覆って環境空気とのガス交換を防ぎ、フラスコを100RPSおよび摂氏37度に設定された振とうインキュベーターに1時間置き、10ミリリットルのピペットを使用して、アストロサイト層を乱すことなくフラスコから培地を収集し、50ミリリットルの円錐管に分注します。フラスコに新鮮な培地を追加し、インキュベーターに戻します。

チューブを2, 500 RCFで摂氏4度の5分間遠心分離した後、仰臥位を吸引し、細胞を1ミリリットルのミクログリアめっき培地に再懸濁します。次に、ヒトサイトメーターと標準的な手順を使用して細胞をカウントします。細胞数を決定したら、細胞を達成するために適切な量のミクログリアプレーティング培地を追加します。

ミリリットルプレートあたり5個の細胞に10の2倍の濃度が実験とインキュベーターへの復帰に適切です。ミクログリアが一晩で付着するのを可能にするため。細胞は、赤く見えるミクログリアマーカーであるIBAに特異的な抗体で免疫染色されています。

この顕微鏡画像で示されているように、新しいNAニューロンマーカーの抗体を使用した免疫染色の顕微鏡画像が示すように、ニューロン細胞による培養物の汚染は最小限に抑えられています。スライドは、すべての細胞核を青色に染色するためにDPIでカウンター染色されています。この画像は、GFAPとアストロサイトマーカーによる免疫染色を示しています。

アストロサイトが緑色に見えます。ここでは、オリゴデンドロサイトマーカーであるCC1に特異的な抗体で免疫染色したミクログリア培養の画像を示します。オリゴデンドロサイトは赤く見えます。

このヒストグラムは、各細胞タイプの定量化の結果を示しています。めっきされたミクログリア培養物は90%以上純度であることがわかります。この蛍光顕微鏡画像は、IBAの免疫染色されたミクログリア培養を示しています。

赤い部分は蛍光標識されたラテックスビーズです。ここに示されているミクログリア培養物は、1ミリリットルあたり1ナノグラムのリポ多糖類で処理されており、ミクログリア細胞は蛍光標識ラテックスビーズの食作用を有することがわかる。ここでは、食作用アッセイの結果がヒストグラムで表示されます。

LPSによる治療後に食作用の増加が見られます。この図は、LPSの添加後にミクログリア培養でも一酸化窒素の産生が増加することを示しています。最後に、直接またはトランウェルインサート分離されたミクログリアニューロン培養物の両方が、乳酸デヒドロゲナーゼ放出によって測定されるように、LPSとのインキュベーション後に細胞死が増加しやすいです。この技術の最初の部分を習得すると、T75へのプレーティングまで、フラスコは1時間半で完了し、完全な手順は2週間以内に実行できます。

このプロトコルの最適化における別の考慮事項は、時間の期間を決定することです。混合グリア培養物は、高純度培養物の確立後、プレーティング用の初代ミクログリアを単離する前に維持する必要があります。この手順を使用すると、一酸化窒素産生、サイトカインおよびケモカイン放出、および位相活性のin vitro測定でミクログリア機能を評価することができ、ルーチンの実験室アッセイを使用してすべて測定できます。

したがって、この手順の開発により、神経科学の分野の研究者は、均質な細胞環境でのミクログリア活性を調査し、さまざまな神経学的条件下でのそれらの役割を調査する能力を持っています。このビデオを見れば、新生児ラットの脳から初代ミクログリア細胞培養を調製する方法を十分に理解できるはずです。まず脳を単離して髄膜を除去し、次に脳を均質化してフラスコにめっきすることで、アストロサイトの単層が合流するまでフラスコを10〜14日間インキュベートします。

最後のステップは、フラスコを振って、アストロサイト単層の上で成長しているミクログリアを放出し、ミクログリアの精製培養を行うことです。