Name: 新生仔ラットの脳組織の混合グリア細胞培養物から主要なミクログリアの分離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: 学ぶ新生仔ラット脳からの一次ミクログリア分離法。混合グリア培養と振盪法を用いて高純度の細胞を取得し、神経炎症や神経変性疾患におけるミクログリア機能のin vitro研究に応用できます。

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1。新生仔ラットの脳組織の解剖<ol><li>チルリーボビッツのL-15培地（レイボビッツL-15 + 0.1％BSA + 1％のペン/連鎖球菌）に4℃暖かい培地（DMEM + 10％FBS + 1％ペニシリン/ストレプトマイシン）37℃氷の上でエアコンL-15メディアの4-5 mlの4 60X15ミリメートルのペトリ皿を準備します。 100％エタノールを持つすべての手術器具を滅菌する。 </li><li> 70％エタノールでP2新生児ラップ子犬をすすぎます。 （P1-P5歳新生児仔ラットは、このプロトコルで使用することができます。） </li><li>迅速に滅菌鋭いハサミで子犬ラットを刎ねると、70％エタノールにすぐに頭をドロップします。 5仔ラットの合計繰り返した後食塩水に頭を転送します。 </li><li>氷上で5ミリリットルL-15溶液（レイボビッツL-15 + 0.1％BSA + 1％ペン/連鎖球菌） - 4のペトリ皿に頭と場所から全体の頭脳を削除します。 </li><li> 1.4リットルの残りの子犬のために - 手順1.2を繰り返します。 </li><li>脳から髄膜を除去し、DESを転送氷の上でL-15溶液（レイボビッツL-15 + 0.1％BSA + 1％のペン/連鎖球菌）の4-5 mlの新しいペトリ皿に赤外LEDの脳組織（ すなわち 、大脳皮質、小脳、全脳、など）。 </li></ol> 2。混合グリア細胞集団の準備<ol><li>ハサミや刃で脳組織を損傷することなく、滅菌50 mlコニカルチューブに10 mlのピ​​ペットで組織を転送します。 </li><li> 4℃で5分間2500 RCFで円錐形の遠心</li><li>上清を吸引除去する。新鮮なL-15培地（レイボビッツL-15 + 0.1％BSA + 1％のペン/連鎖球菌）の4-5 mlを追加します。 </li><li>滅菌した10 mlのピ​​ペットでピペットは、組織の上下に10回。 </li><li>新鮮な50 mlコニカルチューブにセルストレーナー（100μm以下の細孔）を配置します。上下にピペット組織は一度滅菌5mlのピペットを用いて、セルのストレーナーにフラッシュピペットを用いて、コニカルチューブに細胞ストレーナーを通して材料を分配する。 </li><li>新鮮なL-15培地（レイボビッツL-15 + 0.1％BS 4-5 mlのセルストレーナーを洗浄します+ 1％のペン/連鎖球菌）。 </li><li> 4℃で5分間で2,500 RCFで緊張した細胞と円錐形の遠心分離</li></ol> 3。混合グリア細胞培養のメッキとメンテナンス<ol><li>処理された各ラット子犬の脳については、各フラスコに培養培地（DMEM + 10％FBS + 1％ペニシリン/ストレプトマイシン）の12 mlを加えて1滅菌T-75フラスコを準備します。 </li><li>ペレット化した細胞からの上清を吸引除去し、細胞ペレットに培地の5-6 mlを加える。 10 mlのピ​​ペットで10回ピペッティングします。 </li><li>それぞれのT-75フラスコに細胞懸濁液の等量を転送します。 </li><li> 1-3週間の合計で37℃5％CO 2インキュベーター内でフラスコをインキュベートします。 </li><li>フラスコは、最初の5日間インキュベートし、5日目に、新鮮な培地12 mlを各フラスコに培地を交換し、インキュベーターに戻す必要があります。その後、3日ごとに、合流を達成するために新鮮な培地を12 mlの各フラスコ内の培地を交換してください。これは何されている必要があり細胞が付着フラスコの底に触れることなく、非常に慎重にね。 </li></ol> 4。プライマリミクログリアの分離とめっき<ol><li>混合グリア培養が完全にコンフルエントになったら、インキュベーターからフラスコを削除し、環境大気とのガス交換を防ぐためパラフィルムでフラスコのキャップをカバーしています。 </li><li> 37℃で1時間に100 RPS（ラボコンパニオンSI-600、Jeioテック）でフラスコを振る℃に</li><li>フラスコ表面に星状膠細胞層を中断せずに10 mlのピ​​ペットを用いてすべてのフラスコから培地を収集します。 50 mlコニカルチューブにメディアを配置します。インキュベーターにフラスコと戻りフラスコに新鮮な培地を追加します。 </li><li> 4℃で5分間で2,500 RCFでコニカルチューブを遠心分離</li><li>すべてのコニカルチューブから上清を吸引除去する。細胞ペレットは、高純度のミクログリア細胞である。ミクログリアメッキ培地（DMEM + 10％FES + 1％ペニシリン/ストレプトマイシン）を1mlに再懸濁したペレット。 </li><li>を使用して再懸濁した培地で細胞密度を数える血球。 </li><li>ミリリットル当たりの密度2×10e5細胞を達成するために、ミクログリアメッキメディアの適切なボリュームを追加します。実験的な解析に適したプレート。 </li><li>ミクログリアは一晩にアタッチすることができます。 </li></ol> 5。代表的な結果高純度の主ミクログリア培養の結果、上記のプロトコル。としてマクロファージ/ミクログリア細胞特異的マーカー（Iba1）の免疫組織化学によって決定される、メッキミクログリア培養は&gt; 90％純粋（ 図2）です。さらに、アストロサイト、オリゴデンドロサイトとニューロン細胞特異的マーカーを染色すると、最小限の汚染（ 図2）を示しています。混合グリア細胞培養を確立した後、ミクログリアは4つの連続した​​回まで振とうすることにより単離することができる。初期ミクログリアの分離は、約2.2×106細胞/ mlまたは10フラスコ当たり約9万個の細胞が得られると予想される収量は、それぞれの連続した​​SHAとともに減少するKE。この方法により単離されたミクログリアが貪食能力など、一酸化窒素の生産として機能し、神経毒性（ 図3）13 から14を調査するために首尾よく使用されています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3814/3814fig1.jpg" /> 図1混合グリア細胞培養、プライマリミクログリアの分離を準備するためのプロトコルの概要。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3814/3814fig2.jpg" /> ミクログリア（IBA-1、赤）、アストロサイト（GFAP、緑）、ニューロン（NeuN、赤）とオリゴデンドロサイト（CC1、赤）は、特定のマーカーを用いて免疫組織化学的分析によって検証として高純度のミクログリアの図2。分離。 DAPI（青）で培養中の細胞のDNAを染色も表示されます。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3814/3814fig3.jpg" /> 図3ミクログリアは、メソッドdescriで分離されたベッドは、貪食アッセイ、機能アッセイと神経毒性の研究に限定を含むではなく、多くのアッセイで使用されています。これらの研究で、我々が制御するために露出したミクログリア（IBA-1陽性、緑）、（）またはLPS（B）が扱われているメディアを発見した、定量することができる蛍光標識ラテックスビーズ（赤）、それらの貪食を増加させる（ C）。さらに、LPS（1ng/ml）治療は、ミクログリア（D）で一酸化窒素の産生を増加させることができます。最後に、トランスウェルインサート区切りまたは直接ミクログリア - ニューロン培養の両方を介して、我々は、乳酸脱水素酵素（LDH）放出（E、F）によって測定されたLPSとともにインキュベートしたミクログリアが神経細胞死を誘導できることを見出した。

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</ol>

利害の衝突が宣言されません。

このプロトコルは定期的に研究実験のための純粋で健康的なミクログリアを製造するために利用されていますが、手順の重要な部分の間に技術的な側面を慎重に検討は、単離されたミクログリアの変動を最小限に抑えることができます。まず、タイムリーで働く新生児の仔ラットの脳組織の解剖中に組織への酸素および虚血性損傷を最小限にする必要があります。しかし、髄膜の存在がこれらの培養条件下で、その急速な増殖速度に起因する重要な線維芽細胞の汚染に貢献していきますので、完全に、解剖時に脳から髄膜の被覆を除去するためにも重要です。 混合グリア細胞培養の準備中に組織材料の第二に、穏やかな処理は細胞の損傷、死亡、または過度のミクログリアの活性化を制限することも重要です。培地を追加する場合、注意がアストロ月に損傷を与えないように注意する必要がありますolayer。ミクログリアを分離するためにフラスコを振とうしながらさらに、揺れの周波数を調整するスロッシングやメディアの気泡の形成を防止するために必要があるかもしれません。これらのイベントは、星状膠細胞の混入を増やすか、文化への細胞の損傷を引き起こす可能性があります。実験でこ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> 60ミリメートルX 15ミリメートルのペトリ皿</td><td>フィッシャーブランド</td><td> 0875713A </td><td></td></tr><tr><td>シャープ解剖はさみ</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 14094から11 </td><td></td></tr><tr><td>デュモン＃曲線7bの鉗子標準のヒント、11センチメートル</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11270から20 </td><td></td></tr><tr><td>デュモン＃5鉗子標準のヒント、ストレート、11センチメートル</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11251から10 </td><td></td></tr><tr><td> 50 mlコニカル遠心チューブ</td><td> VWR </td><td> 89039-656 </td><td></td></tr><tr><td> 5ミリリットル血清ピペット</td><td>グルニエバイオOne </td><td> 606180 </td><td></td></tr><tr><td> 10ミリリットル血清ピペット</td><td>グルニエバイオOne </td><td> 607180 </td><td></td></tr><tr><td> 100μmの滅菌ナイロンセルストレーナー</td><td>ファルコン</td><td> 35から2360 </td><td></td></tr><tr><td> 75センチメートル2組織培養フラスコ</td><td>コー​​ニング</td><td> 430641 </td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコの最小必須培地（DMEM） </td><td> GIBCO（インビトロジェン社） </td><td> 31053-028 </td><td></td></tr><tr><td>リーボビッツのL-15培地</td><td> GIBCO（インビトロジェン社） </td><td> 11415064 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎仔血清</td><td> GIBCO（インビトロジェン社） </td><td> 16000-036 </td><td></td></tr><tr><td>胎児のウマ血清</td><td>フィッシャー</td><td> SH3007402 </td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン - ストレプトマイシン</td><td> GIBCO（インビトロジェン社） </td><td> 15140163 </td><td></td></tr><tr><td> 100％エタノール</td><td>ワーナー·グラハム·カンパニー</td><td> 64-17-5 </td><td></td></tr><tr><td>リン酸塩は、食塩水、10X、pH7.4を緩衝</td><td>質生物学、株式会社。 </td><td> 119-069-131 </td><td>無菌の蒸留水で1X </td></tr><tr><td>バイオハザードバッグ</td><td> VWR </td><td> 14220-028 </td><td></td></tr><tr><td> Haemocytometer </td><td> Hausser科学</td><td> 1492 </td><td></td></tr><tr><td> cellBIND表面を有する6ウェル細胞培養プレート</td><td>コー​​ニング</td><td> 3335 </td><td></td></tr></tbody></table>

新生仔ラットの脳組織の混合グリア細胞培養物から主要なミクログリアの分離

Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue

ミクログリアは、哺乳類の脳における全細胞集団の約12%を占めています。ニューロンやアストロサイトが神経系の主要な細胞型であると考えられていますが、ミクログリアは、組織内のデブリや病原体を監視し、食作用を通じて実質内の恒常性を維持することで、正常な脳生理において重要な役割を果たしています1,2。ミクログリアは、神経変性疾患、外傷性脳損傷、神経系の感染症を含む、多くの損傷および疾患条件下で活性化されます3。これらの活性化条件下で、ミクログリアは食作用を亢進させ、形態的および増殖的な変化を起こし、活性酸素種および活性窒素種、炎症性ケモカインおよびサイトカインを能動的に分泌して、しばしばパラクリンまたはオートクリンループを活性化させます4-6。このようなミクログリアの反応は神経疾患の病態形成に寄与するため、ミクログリアに焦点を当てた研究が求められています。
	脳の細胞異質性のため、in vivo実験において高純度で十分な量のミクログリア試料を得ることは技術的に困難です。ミクログリアの神経保護機能および神経毒性機能に関する現在の研究では、研究に十分な収量で、純粋かつ健全なミクログリアを一貫して生成するための日常的な技術的手法が求められています。本テキストおよびビデオでは、さまざまなダウンストリームアプリケーションに向けて、混合グリア培養物から純粋な一次ミクログリアを単離するプロトコルを紹介します。簡潔に述べると、本手法では、新生ラット幼仔の解離脳組織を用いて混合グリア細胞培養物を調製します。混合グリア培養物がコンフルエントに達した後、短時間の振盪によって培養物から一次ミクログリアを機械的に単離します。その後、単離されたミクログリアを高純度で播種し、実験研究に使用します。
	本手法の原理およびプロトコルは、既報の文献に記載されています7,8。さらに、初代ミクログリアを単離するための代替手法も十分に記載されています9-12。ホモジナイズした脳組織を密度勾配遠心分離することで、初代ミクログリアを得ることができます12。しかし、この遠心分離は中程度の時間（45分）を要し、細胞への損傷や活性化を招く可能性があるほか、ミクログリアおよびその他の細胞集団が濃縮される原因となります。また、培養中の長時間（16時間）の振盪によって、様々な生物種から初代ミクログリアを単離するプロトコルも利用されています9-11。振盪後、培地の上清を遠心分離してミクログリアを単離します。このより長い2段階の単離方法は、ミクログリアの機能や活性化を乱す可能性があります。当研究室では、主に以下の理由から次のミクログリア単離プロトコルを採用しています。(1) 初代ミクログリアは、不死化したげっ歯類ミクログリア細胞株よりも in vivo の生物学的特性をより忠実に再現できること、(2) 機械的な破壊を最小限に抑えることで、潜在的な細胞機能不全や活性化を最小限に留められること、(3) 混合グリア細胞培養の継代を行うことなく、十分な収量が得られることです。
	本プロトコルでは、ミクログリアを単離するために新生児ラットの脳組織を使用している点に注意してください。より高齢のラットを用いてミクログリアを単離した場合、単離したミクログリアの収量、活性化状態、および機能的特性に大きな影響を及ぼす可能性があります。加齢がミクログリアの機能不全、神経炎症の増大、および神経変性疾患に関連しているという証拠があるため、加齢が重要なパラメータとなる神経変性疾患におけるミクログリアの役割をより深く理解するために、これまでの研究では成体ミクログリアを ex vivo で使用してきました。しかし、ex vivo のミクログリアを長期間培養し続けることはできません。したがって、本プロトコルは培養下での初代ミクログリアの寿命を延ばすものですが、これらのミクログリアは成体ミクログリアとは異なる挙動を示すため、in vitro での研究結果を in vivo の環境に適用させる際には慎重に検討する必要があります。

脳の細胞の不均質性からプライマリミクログリアを分離すると、生理学的および病理学的条件の両方で彼らの役割を調査することが不可欠である。このプロトコルは、機械的な分離と高収率かつ高純度を提供する混合細胞培養技術、実行可能な主なミクログリア細胞について説明します。<em&gt; in vitroで</em&gt;研究と下流のアプリケーションに最適です。

ミクログリアは、哺乳類の脳における総細胞集団の約12%を占めています。ニューロンやアストロサイトが主要な...

この手順の全体的な目的は、新生ラットの脳から初代ミクログリア細胞培養物を調製することです。まず、脳を単離して髄膜を除去します。次に、脳をホモジナイズし、混合グリア培養物をT 75フラスコに播種します。次に、アストロサイトの単層がコンフルエントになるまで、フラスコを10〜14日間インキュベートします。最後のステップとして、フラスコを振ってアストロサイト単層の上に増殖しているミクログリアを遊離させ、精製されたミクログリア培養液を得ます。最終的に、高純度の初代ミクログリアを、その後のin vitro単一細胞培養および共培養アッセイに使用することができます。Perico勾配法などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、機械的な破砕を最小限に抑えることでミクログリアの機能不全や活性化を最小限にし、最初の調製から数週間にわたって実験用のミクログリアを生成できることです。ここでは、Clifton Dau guard博士の研究室の大学院生であるTammy Teroとともに、この手順を実演します。本プロトコルで得られる高純度のミクログリア培養物は、正常な生理学的条件下および病理学的疾患条件下におけるミクログリアの機能を研究するためのin vitro実験に使用できます。組織損傷および炎症性刺激に対するミクログリアの応答性は、神経学的損傷や神経変性疾患の状態に直接的に関連しています。一般的に、この手法に不慣れな方は、一次ミクログリア培養における線維芽細胞の混入を抑えるために、脳組織から髄膜を迅速に除去する方法に苦慮することがあります。さらに、フラスコの振とうやミクログリア培養の取り扱いの際、アストロサイトの単層を損傷させないよう注意が必要です。手技の準備として、L 15培地を4°Cに冷却し、L 15培地を入れた60 × 15 mmのペトリ皿を用意して氷上に置きます。培養液を37°Cに温め、すべての手術器具が滅菌されていることを確認します。鋭いハサミでP1からP5のラット新生仔の斬首を行い、頭部を70%エタノールに浸します。5匹のラット幼仔の頭部を採取した後、頭部を生理食塩数に転送します。耳の上の頭蓋骨の両側に慎重に切開を加え、脳を慎重に引き出して、氷上のL 15培地を含むペトリ皿の1つに回収することで、各頭部から全脳を摘出します。最初の5つの脳を氷上のL 15培地に転送した後、同様の手順で次の5匹の幼仔を処理し、すべての脳を回収します。ピンセットで髄膜シートの端をそっと掴み、下の皮質から慎重に剥がして髄膜を除去します。髄膜を完全に、かつ可能な限り迅速に除去することが不可欠です。髄膜の除去後、それぞれの脳を氷上の新鮮なL 15培地が入ったペトリ皿に移します。10 mLピペットを使用して、プレートから脳組織と培地を無菌の50 mLコニカルチューブに吸引します。次に、4 °Cで2,500 RCFにて5分間遠心分離します。遠心分離後、上清を吸引します。次に、滅菌済みの10 milliliterピペットを用いて、沈殿物を回収します。沈殿物を4〜5 millilitersの新鮮なL 15培地で懸濁させ、培地と組織をピペッティングで10回上下に混ぜ合わせます。続いて、100 micron孔径のセルストレーナーを新鮮な50 milliliterコニカルチューブに取り付けます。滅菌済みの5 mLピペットを用いて組織懸濁液をピペッティングし、その後、ピペットをセルストレーナーに密着させ、セルストレーナーを通してコニカルチューブに分注します。ストレーナーを4〜5 mLの冷やした新鮮なL 15培地で洗浄します。次に、4 °Cで2,500 RCFにて5分間遠心分離します。処理したラット新生仔の脳1つにつき、12 mLの予熱済み培地を各T 75フラスコに加えて滅菌フラスコを準備します。次に、ペレット化した細胞から上清を吸引除去した後、細胞ペレットに5〜6 mLの培地を加え、10 mLピペットで10回ピペッティングします。その後、等量の細胞懸濁液を各T 75フラスコに分注します。フラスコを5% carbon dioxide インキュベーターにて37 degrees Celsiusで1〜3週間インキュベートし、初回の播種後最初の5日間は細胞を静置させます。5日後、コンフルエンスに達するように、各フラスコの条件化培地を12 millilitersの新鮮な培地に交換します。この操作は、細胞が付着しているフラスコの底部に触れないよう、非常に慎重に行う必要があります。混合グリア培養細胞が完全にコンフルエントになったら、フラスコをインキュベーターから取り出します。周囲の空気とのガス交換を防ぐため、フラスコのキャップをパラフィルムで覆い、100 RPS、37 °Cに設定した振盪インキュベーターに1時間置きます。1時間経過後、10 mL ピペットを使用して、アストロサイト層を乱さないようにフラスコから培地を回収し、50 mL コニカルチューブに分注します。フラスコに新しい培地を加え、インキュベーターに戻します。チューブを4°Cで2,500 RCFで5分間遠心分離した後、上清を吸引し、細胞を1 mLのミクログリア播種用培地で再懸濁します。次に、血球計算盤と標準的な手順を用いて細胞数をカウントします。細胞数が確定したら、適切な量のミクログリア播種用培地を加え、目的の細胞密度にします。1 mLあたり2×10⁵個の細胞濃度になるように調整し、インキュベーターに戻します。これにより、マイクログリアを一晩付着させます。細胞は、赤色に発色するマイクログリアマーカーであるIBA1特異的抗体を用いて免疫染色されています。赤色に表示されるNeuN神経細胞マーカーに対する抗体を用いた免疫染色の顕微鏡画像からわかるように、培養物における神経細胞の混入は最小限です。スライドはDPIで対比染色されており、すべての細胞核が青色に染色されています。この画像は、GFAPおよびアストロサイトマーカーによる免疫染色を示しています。アストロサイトは緑色に表示されています。ここでは、オリゴデンドロサイトマーカーであるCC1特異的抗体を用いて免疫染色したミクログリア培養液の画像を示します。オリゴデンドロサイトは赤色に表示されています。このヒストグラムは、各細胞型の定量結果を示しています。播種されたミクログリア培養細胞の純度が90%以上であることがわかります。この蛍光顕微鏡画像は、IBA1で免疫染色したミクログリア培養細胞を示しています。赤色の領域は蛍光標識されたラテックスビーズです。ここに示されているミクログリア培養物は 1 ng/mL のリポポリサッカライドで処理されており、ミクログリア細胞が蛍光標識ラテックスビーズを食作用で取り込んでいることがわかります。ここでは、食作用アッセイの結果をヒストグラムで表示しています。LPS処理後に食作用の亢進が見られます。この図は、LPS添加後のミクログリア培養において一酸化窒素産生も増加することを示しています。最後に、直接共培養およびトランスウェルインサートで分離されたミクログリア・ニューロン共培養のいずれにおいても、LPSとのインキュベーション後に乳酸脱水素酵素（LDH）放出で測定される細胞死の増加が認められます。本手法の第一段階を習得すれば、T 75フラスコへの播種までの工程を1.5時間で完了でき、全手順を2週間以内に終えることが可能です。このプロトコルの最適化におけるもう一つの検討事項は、所要時間を決定することです。高純度の培養系を確立した後、一次ミクログリアを播種して単離する前に、混合グリア培養を維持する必要があります。この手順を用いることで、一酸化窒素産生、サイトカインおよびケモカインの放出、ならびに相性活性のin vitro測定により、ミクログリアの機能を通常のラボアッセイで判定および測定することが可能です。このように、本手順の開発により、神経科学分野の研究者は均一な細胞環境においてミクログリアの活性を探索し、さまざまな神経学的条件下での役割を調査することが可能になります。このビデオを視聴することで、新生ラットの脳から一次ミクログリア細胞培養を調製する方法について十分に理解できるはずです。まず脳を単離して髄膜を除去し、次に脳をホモジナイズしてフラスコに播種した後、アストロサイトの単層がコンフルエントになるまで10日から14日間、フラスコをインキュベートします。最終ステップとして、フラスコを振盪してアストロサイト単層の上に増殖しているミクログリアを剥離させ、精製されたミクログリア培養液を得ます。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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