3次元自己組織化ペプチドハイドロゲル中のヒト神経前駆細胞の栽培

本手順の全般的な目的は、三次元環境で培養したヒト神経前駆細胞の神経分化解析を迅速化することです。これは、まず自己組織化ペプチドベースのハイドロゲルであるpure matrixで細胞を培養し、次に三次元スキャフォールドから細胞を回収することによって達成されます。

3番目のステップとして、最終段階で細胞の免疫植物化学染色を行います。その後、フローサイトメトリー解析によって細胞数を計測します。最終的に、フローサイトメトリー解析を用いて、それぞれ神経分化マーカーまたはアポトーシスマーカーを検出することで、神経分化率またはアポトーシス率を決定できます。

この手法を用いることで、神経分化の定量化が大幅に迅速化され、Optaneデータがより広範なベースおよび顕微鏡写真技術に活用されます。細胞を純粋なマトリックスに埋め込むため、まず、4ウェル細胞培養プレートの2つのウェルに、滅菌済みの直径13 mmのガラスカバースリップをそれぞれ配置します。その後、プレートをクリーンベンチに保管し、後で使用します。次に、 freshly prepared trypsinを2.5 mL添加し、ヒト神経前駆細胞（H NPCs）を剥離させます。

ベンゾン溶液を培養皿に加え、細胞懸濁液を37 °C、5% carbon dioxide条件下でインキュベートします。5分後、トリプシン阻害剤ベンゾン溶液を用いて反応を停止させます。その後、剥離した細胞を室温で3000 ×gにて5分間遠心分離し、得られたペレットを5 mLの10% sucrose溶液で再懸濁し、同様の遠心分離条件で細胞懸濁液を洗浄します。

上清を捨てた後、ペレットをショ糖溶液に懸濁し、最終細胞濃度を1×10⁶ cells/mLにします。次に、可能な限り速やかに、60 µLの細胞懸濁液と溶液1を混合し、この懸濁液120 µLを溶液2の入ったコニカルチューブに移して慎重に混合します。その後すぐに、混合液100 µLを4ウェルプレート内の各カバーガラス上に層状に加えます。最後に、各ウェルに細胞培養液200 µLをゆっくりと加えます。

2〜3分後、ウェルに細胞培養液をさらに 200 µL 加え、マトリックスの自己構築を開始させます。クリーンベンチの加温エリアで、細胞を 37 °C で1時間インキュベートします。マトリックスが構築された後は、細胞培養プレートを可能な限り動かさないようにし、1000 µL ピペットを用いて、マトリックスの乾燥を防ぐため、培養液の大部分（すべてではない）を除去します。

次に、マトリックスを500 µLの新鮮な培地で10分間洗浄します。最後に、洗浄用の培地を除去します。さらに500 µLの培地を加え、培養プレートをインキュベーターに入れます。

可能であれば、染色実験の初日に構造物を誤って揺らさないよう、マトリックスを専用のインキュベーターで保管してください。1000 µL ピペットを用いてマトリックスから培地を除去し、その後、スキャフォールドを PBS で 5 分間 1 回洗浄します。

次にPBSを除去し、各ウェルにパラアルデヒドを400 µL添加してマトリックスを固定し、室温で30分間インキュベートします。スキャホールドの固定後、500 µLのPBSで5分間洗浄します。その後、構造体をブロッキングバッファー中で6～9時間インキュベートし、2～3時間ごとにバッファーを交換します。最後に、新鮮なブロッキングバッファーを用いて4 °Cで一晩インキュベートし、翌日にブロッキングバッファーを除去します。

抗体溶液をウェルに加え、マトリックスを再び4 °Cで一晩インキュベートします。次に、一次抗体溶液を除去し、500 µLのPBSでスキャフォールドを8時間洗浄します。その際、2時間ごとにPBSを交換し、その後、新鮮なPBSを用いて4 °Cで一晩洗浄します。一晩の洗浄後、PBSを除去し、二次抗体溶液を用いて室温・暗所で4時間スキャフォールドをインキュベートします。

次に、サンプルをPBSで1回につき1時間、4〜6回洗浄し、その後、構造体を新鮮なPBSとともに4°Cの暗所で一晩インキュベートします。次に、マトリックスを封入する準備として、顕微鏡スライドにMOE all dab coを50 µL添加します。その後、各スライドにカバーガラスを慎重に載せます。

最後に、蛍光顕微鏡を用いて、ここで示している神経マーカーであるbeta three tubulinの発現により緑色に染色されたH NPCsに類似した個々の顕微鏡写真を取得します。500 µLのHBSSで1分間スキャフォールドを洗浄した後、1000 µLピペットを使用してスキャフォールドを15 mLコニカルチューブに移します。次に、1000 µLピペットで細胞溶液を数回再懸濁してマトリックスを機械的に崩壊させ、その後、スキャフォールド溶液を室温で3000 ×gで5分間遠心分離し、ピペットで上澄みを除去した後、ペレットを500 µLのtrypsin benzine溶液中でピぺッティングにより数回上下に混ぜて再懸濁します。

次に、細胞を37 °Cでインキュベートします。5分後に1 mLのトリプシンインヒビターで反応を停止させます。細胞懸濁液を同様の遠心条件で遠心分離した後、Benza nase溶液を数回ピペッティングして混合します。

HBSSバッファー2 mLで2回細胞を洗浄し、マトリックスの残渣を除去します。最後に、細胞懸濁液を70 µmのセルストレーナーに通して凝集物を除去し、同様の条件下で遠心分離を行い、細胞を細胞培地で回収します。まず、分散させた細胞を1%パラホルムアルデヒドで室温にて15分間、シェーカーを用いて固定します。

その後、細胞を遠心分離して回収し、ペレットを洗浄緩衝液で再懸濁します。次に、細胞を4°C、350 ×gで10分間遠心分離し、得られたペレットを25 µLの抗体溶液で再懸濁します。細胞懸濁液を、シェーカーを用いて室温で2時間インキュベートします。

次に、サンプルの直接的に300 µLのpon bufferを加え、同じ遠心分離条件で細胞懸濁液を2回洗浄します。2回目の洗浄後、25 µLの二次抗体を加え、室温・暗所で1時間細胞をインキュベートします。その後、サポニンバッファーでさらに2回細胞を洗浄し、ペレットを500 µLの洗浄バッファーで再懸濁してフローサイトメトリー分析に供します。

この図では、カプセル化されたH NPCsと純粋なマトリックスが示されています。細胞は球状に成長し、球体の直径が数百ミクロンに達することもある密集した構造を形成し、球体間に配置されています。白の矢印で示されているように、細胞によって構築された突起の束が観察されます。個々の細胞を認識することは困難ですが、ラミニンを添加した純粋なマトリックスにカプセル化された細胞は、この図に見られるように、より密度の低い構造で成長し、より均一に分布しています。黒の矢印で示されているように、密度の低い領域では個々の細胞さえ認識可能です。ここでは、ラミニン添加の純粋なマトリックス内で4日間分化したH NPCsを、ニューロンマーカーの発現について緑色に染色しています。

陽性細胞の割合を評価するために、Beta three tubulinを示しています。全細胞数は、ここで青色に染色されたDAPIによる細胞核の数を数えることで決定できます。この顕微鏡写真は、蛍光顕微鏡で撮影されたZスタック画像の全投影図です。

マトリックスから遊離した細胞は、この図に示すようにカバースリップ上などに再播種し、さらなる機能研究に利用することができます。この顕微鏡写真は、前述の遊離処置を施した後、3日間培養した3D培養細胞を示しています。赤色で染まったβ3-tubulinの染色は、未染色の細胞をネガティブコントロールとして用いた場合、3Dスキャフォールド内で保持されていた細胞と同等の形態を示すことがわかります。

ここでの黒い枠で示されるゲート（GA）は、その後のβ3-tubulin陽性細胞の解析のために設定されました。このドットプロットでは、陽性細胞はx軸右側の黒い枠内に現れ、点線の枠内にある中間集団は、おそらく細胞デブリを表していると考えられます。最後の図に、手動による細胞計数とフローサイトメトリーによる計数の比較を示します。白抜きの黒い正方形で示されるように、フローサイトメトリー解析では、塗りつぶされた黒い三角形で示される手動計数で通常的に数えられるよりも、はるかに高い割合で陽性細胞を検出することができます。

このビデオを視聴することで、3DスキャフォールドにおけるエッジMPCの培養に適切なメトリクスを利用する方法、およびフローサイトメーター解析のためにスキャフォールドから細胞を回収する方法について十分に理解することができます。