YFPを発現クリアマウス脳の多光子顕微鏡

固定組織の多光子顕微鏡観察は、通常、数百ミクロンという浅い浸透深さに制限されています。私たちは最近、安息香アルコールと安息香酸ベンゾイルの溶液を用いた光学透明化法を用いることで、固定したマウス臓器の数ミリメートルという深部まで多光子顕微鏡観察ができることを初めて実証しました。この初期の実証では、組織固有の蛍光をイメージングしました。

しかしながら、GFPなどの蛍光タンパク質を発現している組織に対して光学的な透明化法を用いることへの関心が高まっています。ここでは、マウス脳の1つのプロモーターで発現した黄色蛍光タンパク質の蛍光を保持するベンゾアルコール溶液を用い、透明化した脳組織を多光子顕微鏡で観察するためのプロトコルを提示します。イメージング前の臓器を光学的に透明化することで、透明化していない状態では困難であった多光子顕微鏡によるマウス臓器全体の高解像度イメージングが可能になります。

脳のイメージングは、水と脳組織を構成するタンパク質の屈折率の差によって生じるハイライト散乱の影響により、組織表面から300 micronsまでという制限があります。この制限を克服するため、器官を脱水し、水を組織を構成するタンパク質と同様の屈折率を持つ液体で置換します。この光学透明化プロセスにより、光散乱が大幅に低減され、組織表面からより深い部位のより優れたイメージングが可能になります。

Battaらによる画像は、固有蛍光と第二高調波発生を用いて、マウスのさまざまな臓器の組織学的な観察にこの手法をどのように適用できるかを示しています。最初の画像はマウスの精巣であり、組織表面から1.4 millimeters下で撮影されたものです。多光子顕微鏡の高解像特性により、拡大して精細に観察することで、精細管内で形成される個々の精子細胞を確認することができます。

右端に見えるように、組織表面から1.4 mm深さで撮影したマウス肺の画像を示します。この画像は2チャンネル多光子イメージングのデモンストレーションであり、エラスチン成分が赤色に、コラーゲンが緑色にラベル付けされており、拡大することで個々の繊維を容易に識別できます。最後に、組織表面から850 µm深さで撮影したマウス脳内部の高解像度画像を示します。脳の新皮質と海馬を拡大すると、個々のアストロサイトとニューロンの細胞体をはっきりと確認することができます。

しかし、YFPなどの蛍光タンパク質を含む器官を光学的に透明化する場合、badraの光学透明化プロトコルでは、これらの蛍光タンパク質の蛍光信号を維持することができません。本研究で提示するプロトコルは、YFPおよびニューロンの蛍光信号を維持しながら、マウス脳の全器官光学透明化およびイメージングを行うための新しい手法です。エタノール段階系列を用いて脳を脱水し、ベンゾアルコールベンゾエート（一般にBABとして知られる）の1:2溶液で透明化することで、蛍光タンパク質へのダメージが軽減され、その蛍光信号が維持されることが分かりました。マルチフォトンイメージングにあたり、まずYFPマウスの体重を測定し、次にケタミン・キシラジンを腹腔内投与して麻酔をかけます。

手術に進む前に、麻酔の外科的深度が確保されていることを確認する必要があります。5分ごとに、足指や尾を強くつねって反応があるかを確認してください。動物に反応が見られる場合は、ケタミン・キシラジンの追加投与が必要です。

麻酔後、マウスの各肢をラボテープで手術台に固定し、胸部を術野として露出させるために仰臥位に保持します。まず、胸郭の底部に沿って切開するため、剣状突起の下辺に切開線を入れます。切開時には、ハサミとピンセットを用いて皮膚を牽引しながら切開します。次に、マウスの胸骨の両側に沿って2本の切開を加え、組織のフラップを作成します。このフラップを止血鉗子で胸腔から遠ざけて保持し、心臓を露出させます。続いて、23ゲージの針を左心室に挿入し、血液を排出させるために右心房の筋壁に小さな切開を加えます。右心房を切開直後、右心房から血液が排出されなくなるまで、4 °Cのリン酸緩衝生理食塩水による灌流を開始します。

灌流中、シストリックポンプを使用し、針先から1.5〜2インチ先に液体が噴出するポンプ出力に設定します。すべての血液が排出されたら、灌流液を4°Cの4%パラホルムアルデヒド溶液に切り替え、マウスの体が明らかに硬くなるまで灌流を続けます。灌流後、マウスを手術台から取り出して断頭し、ピンセットと虹彩剪刀を用いて脳の摘出を開始します。

頭蓋骨を、後方から前方に向かって小さな断片ごとに除去します。ハサミを用いて頭蓋骨を2〜4 mm間隔で細かく切り込みながら、ピンセットで骨を脳から慎重に少しずつ剥がし、脳の上面全体が露出するまでこの操作を繰り返します。その後、サージカルスパチュラを用いて脳を頭蓋骨から摘出し、固定のために4%パラホルムアルデヒドが入ったガラス瓶に入れ、6時間固定します。

本デモンストレーションでは主にYFPを発現するマウス脳のイメージングに焦点を当てますが、本手順の透明化能力を最大限に示すため、マウス個体、後肢、および小腸切片の光学的に透明化も行います。後固定後、脳およびその他の組織をPBSで2回洗浄します。その後、組織サンプルを室温で、50%、70%、90%、および100%のエタノールによる一連のインキュベーションにより脱水します。

各インキュベーションは2時間行い、その後、固定組織から効率的に脱水するために、100%エタノールで12時間の二次インキュベーションを行います。脱水後、最後の100%エタノール溶液を捨て、組織サンプルをエタノールとBABの等量混合溶液に2時間浸し、その後、100% BAB透明化溶液に浸します。

BABに浸漬した後、脳およびその他の組織サンプルは4〜5時間以内に目に見えて透明になります。ここでは、光学的に透明化させるプロセスの最初の6時間のタイムラプスビデオを示します。スキップ箇所は、エタノールとBABの1:1溶液を100% BAB溶液に置換したタイミングを示しています。

6時間後、すべての臓器に透明化の兆候が見られます。例えば、最高の透明化結果が得られた場合、マウスの後肢の骨がはっきりと視認できるようになります。脳は、強い光を遮断した室温条件下で6日間透明化させます。脳が透明化し、イメージングの準備が整ったら、サノアクリルまたは瞬間接着剤を用いてペトリ皿の底面に固定します。

接着剤が乾燥した後、脳をBABに浸し、イメージングのためにペトリ皿を対物レンズの下に配置します。イメージングには、励起波長を710から990ナノメートルの範囲で調整可能なMI tieチタンサファイアレーザーを組み込んだ多光子顕微鏡を使用します。YFP信号を生成するために使用する励起波長は886ナノメートルです。

次に、広視野イメージングが可能なNIK icon 5x対物レンズを用いて、反射蛍光信号をキャプチャします。反射蛍光信号は535/50バンドパスフィルターでフィルタリングされ、高量子効率の光電子増倍管（OMNI Matsu社製）を用いて収集されます。画像はScanImageソフトウェアを用いて、解像度2048×2048ピクセル、スキャン速度1ラインあたり2ミリ秒で処理され、高解像度のYFP画像が生成されます。

イメージングが完了した後、脳をP twoディッシュから取り出し、今後のイメージングに備えてBABに保存して遮光します。ここで示す代表的な画像およびビデオは、光学的に透明化することで可能となった高解像度マルチフォトニングイメージング能力を実証しています。全脳イメージングにより、海馬および新皮質の異なる層にあるYFP標識ニューロンを、組織表面から2 mmの深さまで鮮明に視認することが可能です。

ここでは、海馬の異なる解剖学的層を明らかにするために、脳から0.8〜2 mmの深さで撮影された、全口領域の1.2 mmイメージスタックのビデオを示します。以下は、2 mm深のイメージスタックから抽出された、Bergmanと呼ばれる1.94 mmの冠状断面の代表的な画像であり、海馬の異なる層がラベル付けされています。新皮質を拡大すると、組織表面から1.02 mm下まで、新皮質第5層錐体ニューロンの個々の軸索と神経細胞体がはっきりと判別できます。

ここでは、組織表面から 700 から 1020 µm の深さで撮影された第5層ニューロンのイメージスタックを示します。以下は、そのスタックの中から脳内 774 µm の位置で撮影した代表的な画像です。この同じイメージスタックを用いて、Image J ソフトウェアによりニューロン領域の 3D 再構成が行われました。

マルチボット顕微鏡の高い解像能により、個々のニューロン全体の画像を表示することも可能です。ここでは、樹状突起のプロセスが明確に視認できる、新皮質第5層ニューロンの再構築図を示します。以上で、YFPを発現するマウス脳全体の光学的に透明化した試料に関するプレゼンテーションを終了します。

この手法の実施は比較的簡単であり、これまで示した通り、マウス脳の多くの異なる領域や構造の観察およびイメージングに使用できます。ご視聴ありがとうございました。研究の成功をお祈りいたします。