の光周波数領域イメージング

気管支内OCTまたはOFDIは、標準的な気管支鏡アクセスポートに対応した細いフレキシブルカテーテルを使用して行われます。気管支鏡を気管気管支樹に沿って目的の気道まで進めます。その後、OFDIカテーテルを気管支鏡の処置チャンネル経由で気道内に挿入し、画像を収集します。

OFDIカテーテルの内部光学コアを回転させながら、同時に外部の透明シース内で後退させることで、3次元のOFDIデータを生成します。マサチューセッツ総合病院のSudor研究室では、末梢腫瘤のサンプリングに日常的に使用される標準的な経気管支針に対応した、針ベースのOFDIカテーテルを開発しました。気管支鏡を気道内に進め、標的となる腫瘤まで到達させます。

OFDIカテーテルを経気管針の中に安全に格納した状態で、針を腫瘤内に刺入します。その後、針を後退させ、OFDIカテーテルのみを留置します。気管内OFDIと同様に、経気管OFDIカテーテルの内部光学コアを回転させながら同時に外側の透明シース内で後退させることで、3次元OFDI画像を生成します。

in vivoで得られる組織病理学的な対照データは小さな生検断片のみで構成されており、大規模なOFDIデータセットとの相関を得ることが困難です。その結果、in vivo環境では肺病理の特有の画像上の特徴を容易に展開することができません。本プロトコルの全体的な目的は、ex vivo組織を用いて、OFDIと組織学の正確な1対1の相関を得ることであり、これはゴールドスタンダードである組織学に基づいて、OFDIで見られる特徴を正確に評価するために不可欠です。

特定のイメージング基準が策定され、1対1で対応させた組織学的評価によってex vivoで検証された後、その基準をin vivoイメージング研究に適用することができます。この手法の主な利点は、イメージングと組織学の直接的な相関が可能になり、画像特徴の解釈が向上することです。光学周波数領域イメージング（OFDI）システムを実験に備えるには、まずイメージングシステムをオンにし、次に適切なイメージングパラメータを設定して記録します。

カテーテルをロータリージャンクションとプルバックデバイスに取り付けます。このカスタムメイドのカテーテルの直径は0.8 millimetersです。カテーテルを回転させ、手袋を着用した指先を用いて、画像がフォーカスされており、SN比が十分であるかを確認し、画質をチェックします。

組織調製の操作を開始するために、ベンチトップに使い捨ての吸水パッドを敷き、その上に肺検体を置きます。患者から組織を入手する際のスケジューリングが困難であるため、本ビデオデモンストレーションではブタ組織を使用します。

肺門部から切除検体に入っている気管支を特定します。シリンジの先端を用いて、気道内の目に見える粘液を取り除きます。検体の外表面を触診し、気道または目的の病変を特定します。

プローブに沿って気道を展開し、標的とする病変が視認できるか、または綿棒で気道粘膜下で触知できるまで進めます。病変上の気道粘膜から血液や粘液を慎重に除去します。OFDIカテーテルを気道粘膜の上に配置し、画像を取得します。

これは、病変が気道粘膜の下層にあることを確認し、組織学的相関のための高品質な画像関心領域を特定するためのものです。気道内の関心領域を選択した後、イメージングしたいラインに沿って組織上の2点を選択します。この例では、気道の長軸方向と平行に点を選択します。

OFDIと組織学的検査の両方でインクの印を可視化させることは困難な場合があるため、両方の手法で印を確認できるよう、針による穿刺痕とインクの両方を使用します。2つの地点を選択したら、先細りのオープンボア針を組織標識用染料に浸し、ガーゼで針の外側に付着した余分なインクを丁寧に拭き取ります。針のボア内部にのみ標識用インクが残っている状態で、撮像ライン上の選択した地点において、気道粘膜に対して垂直に組織を穿刺します。同様の手順で気道粘膜上の2点目を標識しますが、このとき2点目が1点目から1.5 centimeters以内に収まるようにしてください。

インクが穿刺部位から粘膜表面に広がった場合は、綿棒を使用して余分なインクを慎重に拭き取ります。目的の結果に応じて、ここで示すように、2つの点は気道の円周方向に対して平行に打つこともあります。組織を画像化するには、OFDIカテーテルを各インクマークの上に配置して撮像し、マークがOFDIで確認できることを確認します。

マークは、組織構造内の局所的な乱れとして現れ、その上層には高度に散乱する粒子が見られ、下層には急速な信号減衰が認められます。これは穿刺部位にあるインク粒子に対応しています。このブタ気道のOFDI画像では、両方のインクマークがアスタリスクで示されています。カテーテルを気道粘膜表面にある2つのインクマークと平行に配置し、カテーテルの光学系が1つ目のインクマークより先の組織に重なるようにしてください。

OFDIプルバックの収集を行い、OFDIプルバック画像を確認して、2つのインクマークが共に画像に写っていること、および組織を採取する前にモーションアーティファクトがないことを確認します。画像プルバックで最初に現れたインクマークから0.3 centimeters離れた気道粘膜組織に、緑色のインク点で印を付けます。これは、イメージングスキャンの開始位置を方向付けするためのものです。

次に、2つの黒色インク標識と緑色インク標識を含む組織を除去します。標準的な組織処理カセットに収まるように組織をトリミングします。組織を組織処理カセットに入れ、10%formalinで48時間以上固定します。

その後、組織はプロトコルの本文に記載されている通りに処理します。機械換気下のブタ気道から得られたこれらのin vivo画像に、OFDIの代表的な結果を示します。パネルAは近位気道のOFDI断層像であり、パネルBは遠位気道のOFDI断層像です。

パネルEは、左側の近位から右側の遠位にかけての気道のOFDI縦断面であり、パネルCはパネルEの赤色でハイライトされた領域を高倍率で示したものです。パネルDはパネルEの緑色でハイライトされた領域の高倍率画像です。カテーテルの直径は0.8 millimetersであり、目盛りは0.5 millimeter刻みを表しています。OFDI画像において気道壁の異なる層や肺胞付着部が識別可能ではありますが、直接的にレジストレーションされた組織学的所見がなければ、OFDI信号の解剖学的相関を正確に解釈することは困難です。Eは上皮、lpは固有層、SMは粘膜下層、Cは軟骨、aは肺胞付着部を示しています。

ここで実演したプロトコルを用いることで、OFDIと組織学的な所見との正確な相関が得られます。この豚気道のOFDI画像は、H&E染色された組織切片の組織学的所見と正確に相関しています。アスタリスクは、呼吸上皮に見られる黒色インクの印を示しています。

気道の層構造は、H&E染色およびTriROME染色で可視化できます。ここには、OFDI画像の高倍率像と、それに対応するH&EおよびTriROME染色を施した組織像が示されています。Eは呼吸上皮、elは緻密なコラーゲンおよび弾性組織、SMは平滑筋、Cは軟骨輪、Gは唾液腺組織、Dは上皮に進入する唾液管を示しています。平滑筋は不連続に点在する束として現れるため、OFDIでは識別できません。

同様に、組織マーキングを用いることで、ヒト気道におけるOFDIと組織学的所見の正確な相関が示されています。このヒト近位気道のOFDI画像では、2つのインクマークが可視化されており、アスタリスクで示されています。これは、H&E染色およびトリクローム染色を施した組織切片の組織学的所見と正確に相関しており、ここではH&E染色を示しています。

OFDI画像の高倍率像および対応する組織像において、アスタリスクで示された呼吸上皮に黒色のインク痕が確認できます。挿入図には、H&E染色およびトリクローム染色の像を示しています。Eは呼吸上皮、lpは固有層、Gは唾液腺組織、Cは軟骨環、pcはヒト気道の軟骨膜を示しています。

典型的な層構造が認められます。緩い結合組織の間には、パネルCおよびFに示す赤色に染色された平滑筋の束が点在していますが、これらは連続した帯状に形成されていないため、OFDIでは明確な層として観察されません。これら2つの画像は、ヒト末梢気道のOFDIの結果と、正確に相関させたhおよびdの組織学的所見を示しています。

呼吸上皮に見られる黒いインクの印はアスタリスクで示されており、肺胞付着部はaで示され、信号強度の高い格子状の肺胞壁と信号欠損のある肺胞腔として観察されます。固有層内の血管腔も、矢印で示される緩やかなシャドーイングを伴う信号欠損構造として観察されます。Eは上皮、LPは固有層を示します。

OFDI固有の高速なデータ取得能により、広範囲のイメージングが可能になります。データを横断像と縦断像の両面から観察することで、組織に関するさらなる構造情報を得ることができます。この手法を用いてイメージング上の特徴が確立されれば、それらの特徴を、対応する組織学的評価が行われていないイメージング領域の解釈に利用することが可能です。

本手法は、直接的にレジストレーションされた組織学的手法を用いて、イメージングの特徴を解釈する方法を提供します。本手法はOFDIと肺組織を用いて実証されましたが、多くのイメージング技術や組織型に適用可能です。本手法によって正常組織および疾患組織のイメージング特徴が確立されれば、直接的な相関組織が得られないin vivoイメージングの解釈に、それらの特徴を応用することができます。