Name: に対する抗生物質の有効性をテストするための人工痰培地の使用緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）肺嚢胞性線維症へのより適切な条件で (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: 学ぶ人工痰培地を用いたPseudomonas aeruginosaバイオフィルムに対する抗生物質感受性試験法。嚢胞性線維症患者の肺環境を模倣し、バイオフィルムと浮遊培養の抗生物質耐性差を評価する信頼性の高い手法です。

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<ol><li>Andrews, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BSAC+standardized+disc+susceptibility+testing+method+%28version+8%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antimicrob.+Chemother%22%5BJournal%5D)">BSAC standardized disc susceptibility testing method (version 8).</a> J. Antimicrob. Chemother. 64, 454-489 (2009).</li>
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<li>Fouhy, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusible+signal+factor-dependent+cell-cell+signaling+and+virulence+in+the+nosocomial+pathogen+Stenotrophomonas+maltophilia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Diffusible signal factor-dependent cell-cell signaling and virulence in the nosocomial pathogen Stenotrophomonas maltophilia.</a> J. Bacteriol. 189, 4964-4968 (2007).</li>
<li>Winstanley, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newly+introduced+genomic+prophage+islands+are+critical+determinants+of+in+vivo+competitiveness+in+the+Liverpool+Epidemic+Strain+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Newly introduced genomic prophage islands are critical determinants of in vivo competitiveness in the Liverpool Epidemic Strain of Pseudomonas aeruginosa.</a> Genome Res. 19, 12-23 (2009).</li>
<li>Carter, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+subtype+of+a+Pseudomonas+aeruginosa+cystic+fibrosis+epidemic+strain+exhibits+enhanced+virulence+in+a+murine+model+of+acute+respiratory+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">A subtype of a Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis epidemic strain exhibits enhanced virulence in a murine model of acute respiratory infection.</a> J. Infect. Dis. 202, 935-942 (2010).</li>
</ol>

利害の衝突が宣言されません。

本研究では、P.を複製するためにASMに基づくin vitroモデルで小説を使用CFの肺4内の緑膿菌バイオフィルムの状態。モデルは、抗菌剤の小規模、高スループットのテストのために正常に変更された。 このアッセイの重要な手順は次のとおりです。 <ol><li> ASMメディアや保守性不稔性の一貫した準備。我々は、各コンポーネントは、再現性のある結果を毎回達成するために追加される方法を最適化することに長い時間を捧げてきました。 ASMのろ過が遅いですが、ムチンのコンポーネントを破損する恐れがありオートクレーブ、より好ましい。他の11で示唆したように、これはかなりの選択圧、ドライブの変異を課すプロファージの溶解16を誘導し、大幅に複数の細菌の遺伝子の発現を変更することがありますので、私たちは、抗生物質の添加をお勧めしません。 </li><li>アッセイは、ボリューム入出力に応じて最適化する必要がありますfはASMが使用されます。振とう速度は小さいボリュームのために増加しており、短いフィルムのライフサイクルが観察される。 </li></ol>小規模ASMバイオフィルムモデルの明白なアプリケーションでは、バイオフィルムの抗菌薬感受性（BSMIC 90） ​​のより現実的な判断である。嫌気性および微好気性のニッチは、CFの肺内に存在し、酸素が ​​成熟したバイオフィルム2、17の奥深くに制限されているという証拠がある。ここでは示している10月14日臨床P. ASMでの微好気性条件下ではトブラマイシンに対する感受性の低下- CF患者の喀痰から緑膿菌分離株は、かなり（≥128倍4）を示す。本研究の結果は、トブラマイシンなどの抗生物質が、P.に対してあまり有効であることが示唆された従来の感受性試験の方法によって示されるよりもCFの肺における緑膿菌感染症。これらの結果は、バイオ10の抗菌薬感受性に関する先行研究を反映しています。小スケールASMアッセイは、より良い治療の決定を通知するために意味のある抗生物質感受性データを生成するためのシンプルなハイスループットプラットフォームを提供します。アッセイは、全人口を代表できない場合があり、スクリーニングに拾われ、単一のコロニーで、従来の抗生物質感受性試験と同じ方法で制限されています。しかし、我々は非表面接続されたバイオフィルムの成長と微好気条件（II）を使用して適用されるアプローチは、（i）、明確な代替手段と、既存のメソッドへの潜在的な改善を表していると信じています。我々は、このアッセイはPを勉強するための適切なモデルであると結論緑膿菌のバイオフィルム集団。臨床現場での更なるテストは、抗生物質に対する感受性は、バイオフィルム成長P.に基づいてかどうかを確かめるだろう緑膿菌は、潜在的に改善し、微生物学的および臨床転帰を持つ別の抗生物質の選択肢につながる可能性があります。古典的なバイオフィルムモデルを用いた同様の調査がBSMIC値が生じることが示された抗生物質治療5,17別の勧告に。 抗感染薬の有効性のテストに加えて、ASMシステムは、P.の多様化を理解することを目的としたものと研究のための動物モデルへの格安、簡単かつ再現可能な代替手段を表し、 緑膿菌の集団。我々は、P.の自然集団における広範囲の不均一性を観察した緑膿菌は、CF患者の痰18、19から回収された。同様の表現型および遺伝子型の多様化は、それCF肺疾患の in vitroモデルで魅力的、ASM 4（と私たちの未発表データ）の成長中に観察することができます。 ASMモデルの相対的なシンプルさは、それが簡単に長期の適応実験はP.に抗生物質やその他のストレスの影響を監視することで、例えば、目的とした設計になります緑膿菌の人口発散。さらに、他の細菌性病原体がで成長させることができるASM。たとえば、2007年は、S.によるバイオフィルム形成を研究するためにASM Fouhy ら使用しているmaltophillia 20。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>魚の精子からのDNA </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> 74782 </td></tr><tr><td>ブタ胃、II型からムチン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> M2378 </td></tr><tr><td> L-アラニン</td><td>アクロスオーガニック</td><td> 102830250 </td></tr><tr><td> L-アルギニン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> A5006 </td></tr><tr><td> L（+） - アスパラギン一水和物</td><td>アクロスオーガニック</td><td> 175271000 </td></tr><tr><td> L（+） - アスパラギン酸</td><td>アクロスオーガニック</td><td> 105041000 </td></tr><tr><td> L-システイン</td><td>シグマAdrich </td><td> 168149 </td></tR&gt; <tr><td> L（+） - グルタミン酸</td><td>アクロスオーガニック</td><td> 156211000 </td></tr><tr><td> L-グルタミン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> G3126 </td></tr><tr><td>グリシン</td><td>アクロスオーガニック</td><td> 220911000 </td></tr><tr><td> L-ヒスチジン</td><td>シグマAdrich </td><td> H8000 </td></tr><tr><td> L-イソロイシン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> I2752 </td></tr><tr><td> L-ロイシン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> L8000 </td></tr><tr><td> L（+） - リジン一塩酸塩</td><td>アクロスオーガニック</td><td> 125222500 </td></tr><tr><td> L-メチオニン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> M9625 </td></tr><tr><td> L-フェニルアラニン</td><td>アクロスオーガニック</td><td> 130310250 </td></tr><tr><td> L-プロリン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> P0380 </td></tr><tr><td> L-セリン</td><td>アクロスオーガニック</td><td> 132660250 </td></tr><tr><td> L-スレオニン</td><td>アクロスオーガニック</td><td> 138930250 </td></tr><tr><td> L（ - ）-トリプトファン</td><td>アクロスオーガニック</td><td> 140590250 </td></tr><tr><td> L-チロシン</td><td>アクロスオーガニック</td><td> 140641000 </td></tr><tr><td> L-バリン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> V0500 </td></tr><tr><td>ジエチレントリアミン五酢酸</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> 32318 </td></tr><tr><td> NaClを</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> S/3160/60 </td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td> BDH </td><td> BDH0258 </td></tr><tr><td&gt; KOH </td><td> BDH </td><td> BDH0262 </td></tr><tr><td>卵黄エマルジョン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> 17148 </td></tr><tr><td> ME 2ダイヤフラム真空ポンプ</td><td> Vacuubrand </td><td> 696126 </td></tr><tr><td> Steritopフィルター（孔径0.22μmの、ネックサイズ：45ミリメートル） </td><td>ミリポア</td><td> SCGPT10RE </td></tr><tr><td>ルリア - ベルターニ培地</td><td>シグマ</td><td> L2897 </td></tr><tr><td> 96ウェルマイクロタイタープレート</td><td>ザルスタット</td><td> 82.1581 </td></tr><tr><td> 24ウェル組織培養処理プレート</td><td>いわき市</td><td> 3820-024 </td></tr><tr><td> CampyGenガス発生パック</td><td>オキソイド</td><td> CN0025 </td></tr><tr><td>微好気性室</td><td>オキソイド</td><td> HP0011 </td></tr><tr><td>トブラマイシン硫酸</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> T1783 </td></tr><tr><td>セルラーゼ、 アスペルギルスニジェールから</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> 22178 </td></tr><tr><td>レザズリン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> 199303 </td></tr><tr><td> Citrate.H 2 0 </td><td> BDH </td><td> BDH0288 </td></tr><tr><td> Fluostarオメガマイクロプレートリーダー</td><td> BMG-LABTECH </td><td> SPECTROstarオメガ</td></tr></tbody></table>

に対する抗生物質の有効性をテストするための人工痰培地の使用<em&gt;緑膿菌（pseudomonas aeruginosa）</em&gt;肺嚢胞性線維症へのより適切な条件で

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Pの分離株に適用した場合にin vitroで抗菌薬感受性試験での関連性についての懸念が高まっている嚢胞性線維症（CF）患者から緑膿菌 。既存の方法は好気的及びplanktonically成長した単一または少数の単離に依存しています。所定のカットオフは、細菌が敏感であるか、または任意の抗生物質を1に耐性があるかどうかを定義するために使用されます。しかし、CF、P.の慢性肺感染症の中に緑膿菌の集団は、バイオフィルム内に存在し、環境が2大部分は好気性であるという証拠があります。診断テスト中に肺の中の細菌とそれらの間に条件の厳しい違いは、信頼性、さらにはこれらのテスト3の妥当性に疑問を呼びかけている。 人工痰媒体（ASM）は、アミノ酸、ムチンと遊離DNAを含む、CF患者の痰の成分を含有する培養培地である。P.緑膿菌&lt;自己凝集バイオフィルムの構造と人口発散4,5,6の形成とCFの感染時にASMを模倣し成長に/ em&gt;に成長。本研究の目的は、Pの抗菌薬感受性を検討するためのマイクロタイタープレートアッセイを開発することでした緑膿菌は、微好気性、好気条件の両方に適用可能であるASM、成長に基づいています。 ASMアッセイは、マイクロタイタープレート形式で開発されました。P.は、緑膿菌のバイオフィルムは、24時間ごとに異なる濃度で前の抗菌剤とのインキュベーションの3日間用に開発させた。バイオフィルムの破壊後、細胞生存率はレサズリンで染色することによって測定した。このアッセイは、15種類のPのトブラマイシンの付着細胞の最小発育阻止濃度（SMIC）を確認するために使用された好気性および微好気条件とSMICの値の下で緑膿菌分離株は、標準的な培養液成長で得られたものと比較した。があったしながら、それらのプランクトンと比較すると、ASMで育った菌株の増加MIC値のいくつかの証拠が、最大の違いは、ASM、システム内のトブラマイシンに向かって&gt; 128倍に多くの抵抗の増加を示した微好気性条件でテスト細菌で見つかったとき好気的条件下で行われたアッセイと比較されます。 現在の感受性試験の方法と臨床転帰の間に関連性の欠如は、3つの現在の方法の妥当性を疑問視しています。 in vitroモデルのいくつかは、P.を研究するために以前に使用されている緑膿菌バイオフィルム7、8。 ASMバイオフィルムは、CFの肺9で観察されたもの似ているのに対し、しかしながら、これらの方法は、表面に接続されたバイオフィルムに依存しています。さらに、粘液の減少酸素濃度は、Pの動作を変更することが示されている緑膿菌 2および10抗生物質感受性に影響を与えます。したがって、ボイジャー微好気条件下でのG ASMは、抗菌薬感受性を勉強するのより現実的な環境を提供することがあります。

現在の診断抗菌薬感受性試験では、栄養豊富な、好気的条件下での分離株のプランクトンの成長に依存しています。ここでは、嚢胞性線維症の肺のより代表的な好気性および微好気性条件の両方の下で緑膿菌バイオフィルムの抗菌薬感受性を検討する別の人工痰媒体を採用しています。

に対する抗生物質の有効性をテストするための人工痰培地の使用<em&gt;緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）</em&gt;肺嚢胞性線維症へのより適切な条件で

嚢胞性線維症患者から分離されたPseudomonas aeruginosa株にin vitro抗菌薬感受性試験を適用した際の妥当性について、懸念が高まっています。

この実験の目的は、定義された人工痰培地を用い、嚢胞性線維症の肺における慢性感染を模した条件下で、pseudomonas Aerogenバイオフィルムに対する抗菌薬の有効性を評価することです。細菌バイオフィルムは24ウェルマイクロタイタープレート内で育成させます。次に、バイオフィルムを抗生物質にさらします。続いて、抗生物質処理した培養物をセルラーゼを用いて分散させ、代謝染料のsrinとともにインキュベートします。この染料は生存細胞によって青色から桃色に還元されます。ウェルの吸光度を測定することで、バイオフィルム細胞の最小発育阻止濃度（B-S-M-I-C）を決定し、生理的条件に近い状態での抗生物質感受性を定量化できます。浮遊培養に基づく最小 억제濃度（MIC）の決定などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、痰の全成分を含む特殊な培地で細菌を育成させることで、バイオフィルムの形成が促進される点にあります。これらのバイオフィルムは、抗生物質に対して非常に高い耐性を示します。培地を調製するために、まず1本目のボトルに250 millilitersの滅菌水を入れ、同様のボトルを2本用意します。攪拌しながら、4 gの魚精子DNAを250 mLの滅菌水に徐々に加えます。室温で溶液を攪拌し、DNAを溶解させてから2本目のボトルに移します。5 gの豚胃由来タイプ2ムチンを徐々に加え、攪拌します。DNAおよびムチン溶液の準備が整ったら、アミノ酸を100 millilitersの滅菌水に溶解させます。ただし、L tyrosineとL cysteineについては、それぞれ25 millilitersの水、または25 millilitersの0.5 molar 水酸化カリウムに溶解させてください。次に、5.9 milligramsのDTPA、5 gramsの塩化ナトリウム、および2.2 gramsの塩化カリウムを100 millilitersの水に溶解させます。これらすべての溶液を1 literのボトルに合わせ、5 millilitersの卵黄乳剤を加えた後、水を用いて混合液の全量を850 millilitersまで調整します。1 M Trisを用い、pHを6.9に調整した後、滅菌用培地の最終容量を水で1 Lまで合わせます。真空ブランドME 2二段式ダイヤフラム真空ポンプと、ネック径45 mm、孔径0.2 µmのMillipore Stericupフィルターユニットを用いてろ過滅菌を行います。ろ過工程は2日間に分けて実施可能です。ASM培地は4 °Cで最大1ヶ月間保存できます。まず、LB培地で overnight 培養した Pseudomonas aeruginosa 培養液を希釈し、ODを 0.05 に調整します。次に、細菌を SM 培地プレートで 1:100 にさらに希釈します。24ウェル組織培養プレートの 21 ウェルに、希釈した細菌培養液を 1 ウェルあたり 1.8 mL ずつ分注し、残りの 3 ウェルにはブランクの陰性対照として同量の SM 培地を分注します。24ウェルプレートを固定し、バイオフィルムを形成させるため、CampiGen ガス発生パックを用いた大型嫌気ジャー内などの微好気条件下に置きます。シェーカーを75 RPMに設定し、37 °Cで3日間培養します。3日後、バイオフィルムが細菌細胞を含むゼラチン状の塊として現れ、ピペッティングでは分散できなくなります。バイオフィルムが形成されたら、各ウェルに連続希釈した異なる濃度の抗生物質を200 µLずつ添加します。テストする薬剤濃度ごとに少なくとも4つの複製を設置し、陰性対照として使用するためにバイオフィルムを含む4つのウェルを未処理のままにしておいてください。その後、抗生物質での培養に続き、さらに24時間プレートをインキュベートします。バイオフィルムを分解させるため、クエン酸バッファーで100 mg/mLに希釈したセルラーゼを1ウェルあたり100 µL使用し、37 °C、好気的条件、150 RPMに設定したシェーカーで1時間インキュベートします。このインキュベーション後、培地中に細胞の凝集体が見られる場合は、ピペッティングによってさらにバイオフィルムを分散させることができます。次に、バイオフィルムから遊離した細胞の生存率を定量するため、各ウェルに100 µLのrezinを加え、細胞を1〜2時間インキュベートします。37 °Cにおいて、生存している細胞のみが青色のzarin染料を代謝し、ピンク色の蛍光形態へと変化させます。インキュベーション後、サンプルを96ウェルプレートに移し、励起波長540 nmおよび蛍光波長590 nmを用いてウェルの蛍光を測定します。細菌の生存率および薬剤感受性を定量化するために、まず、ブランクコントロールの背景蛍光を他のウェルから差し引きます。次に、各濃度の平均蛍光値を未処理コントロールの平均蛍光値で除し、100を掛けて阻害率を算出します。B-S-M-Y-Cは、これらの電子顕微鏡写真に示されるように、代謝活性を90%阻害する抗生物質濃度として定義されます。バイオフィルム内で増殖した細胞は、プランクトン状態で培養された細菌とは大きく異なります。特に、緑色で示されたバイオフィルム内の細胞の周囲には、黄色で示される大量の細胞外マトリックスが存在しますが、プランクトン状のコロニーでは見られません。また、本実験において、バイオフィルム内の細菌は通常、抗生物質に対してより高い耐性を示します。青色で示されたpseudomonas aerogenのプランクトン培養におけるトブラマイシンの最小発育阻止濃度は、約4 µg/mLであると決定されました。対照的に、赤色で示されているように、バイオフィルム内の細菌は100%が512 micrograms per milliliterの抗生物質まで生存しました。このビデオを視聴することで、定義された人工痰培地で細菌を培養する方法について十分に理解できたはずです。また、嚢胞性線維症の肺に近い、より現実的な環境において細菌の増殖を抑制するために必要な最小発育阻止濃度を決定するための、抗生物質感受性試験を実施できるようになるはずです。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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