に対する抗生物質の有効性をテストするための人工痰培地の使用

この実験の目的は、定義された人工痰培地を用い、嚢胞性線維症の肺における慢性感染を模した条件下で、pseudomonas Aerogenバイオフィルムに対する抗菌薬の有効性を評価することです。細菌バイオフィルムは24ウェルマイクロタイタープレート内で育成させます。

次に、バイオフィルムを抗生物質にさらします。続いて、抗生物質処理した培養物をセルラーゼを用いて分散させ、代謝染料のsrinとともにインキュベートします。この染料は生存細胞によって青色から桃色に還元されます。ウェルの吸光度を測定することで、バイオフィルム細胞の最小発育阻止濃度（B-S-M-I-C）を決定し、生理的条件に近い状態での抗生物質感受性を定量化できます。

浮遊培養に基づく最小 억제濃度（MIC）の決定などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、痰の全成分を含む特殊な培地で細菌を育成させることで、バイオフィルムの形成が促進される点にあります。これらのバイオフィルムは、抗生物質に対して非常に高い耐性を示します。培地を調製するために、まず1本目のボトルに250 millilitersの滅菌水を入れ、同様のボトルを2本用意します。

攪拌しながら、4 gの魚精子DNAを250 mLの滅菌水に徐々に加えます。室温で溶液を攪拌し、DNAを溶解させてから2本目のボトルに移します。5 gの豚胃由来タイプ2ムチンを徐々に加え、攪拌します。

DNAおよびムチン溶液の準備が整ったら、アミノ酸を100 millilitersの滅菌水に溶解させます。ただし、L tyrosineとL cysteineについては、それぞれ25 millilitersの水、または25 millilitersの0.5 molar 水酸化カリウムに溶解させてください。次に、5.9 milligramsのDTPA、5 gramsの塩化ナトリウム、および2.2 gramsの塩化カリウムを100 millilitersの水に溶解させます。これらすべての溶液を1 literのボトルに合わせ、5 millilitersの卵黄乳剤を加えた後、水を用いて混合液の全量を850 millilitersまで調整します。

1 M Trisを用い、pHを6.9に調整した後、滅菌用培地の最終容量を水で1 Lまで合わせます。真空ブランドME 2二段式ダイヤフラム真空ポンプと、ネック径45 mm、孔径0.2 µmのMillipore Stericupフィルターユニットを用いてろ過滅菌を行います。ろ過工程は2日間に分けて実施可能です。ASM培地は4 °Cで最大1ヶ月間保存できます。

まず、LB培地で overnight 培養した Pseudomonas aeruginosa 培養液を希釈し、ODを 0.05 に調整します。次に、細菌を SM 培地プレートで 1:100 にさらに希釈します。24ウェル組織培養プレートの 21 ウェルに、希釈した細菌培養液を 1 ウェルあたり 1.8 mL ずつ分注し、残りの 3 ウェルにはブランクの陰性対照として同量の SM 培地を分注します。24ウェルプレートを固定し、バイオフィルムを形成させるため、CampiGen ガス発生パックを用いた大型嫌気ジャー内などの微好気条件下に置きます。

シェーカーを75 RPMに設定し、37 °Cで3日間培養します。3日後、バイオフィルムが細菌細胞を含むゼラチン状の塊として現れ、ピペッティングでは分散できなくなります。バイオフィルムが形成されたら、各ウェルに連続希釈した異なる濃度の抗生物質を200 µLずつ添加します。テストする薬剤濃度ごとに少なくとも4つの複製を設置し、陰性対照として使用するためにバイオフィルムを含む4つのウェルを未処理のままにしておいてください。

その後、抗生物質での培養に続き、さらに24時間プレートをインキュベートします。バイオフィルムを分解させるため、クエン酸バッファーで100 mg/mLに希釈したセルラーゼを1ウェルあたり100 µL使用し、37 °C、好気的条件、150 RPMに設定したシェーカーで1時間インキュベートします。このインキュベーション後、培地中に細胞の凝集体が見られる場合は、ピペッティングによってさらにバイオフィルムを分散させることができます。

次に、バイオフィルムから遊離した細胞の生存率を定量するため、各ウェルに100 µLのrezinを加え、細胞を1〜2時間インキュベートします。37 °Cにおいて、生存している細胞のみが青色のzarin染料を代謝し、ピンク色の蛍光形態へと変化させます。インキュベーション後、サンプルを96ウェルプレートに移し、励起波長540 nmおよび蛍光波長590 nmを用いてウェルの蛍光を測定します。

細菌の生存率および薬剤感受性を定量化するために、まず、ブランクコントロールの背景蛍光を他のウェルから差し引きます。次に、各濃度の平均蛍光値を未処理コントロールの平均蛍光値で除し、100を掛けて阻害率を算出します。B-S-M-Y-Cは、これらの電子顕微鏡写真に示されるように、代謝活性を90%阻害する抗生物質濃度として定義されます。バイオフィルム内で増殖した細胞は、プランクトン状態で培養された細菌とは大きく異なります。

特に、緑色で示されたバイオフィルム内の細胞の周囲には、黄色で示される大量の細胞外マトリックスが存在しますが、プランクトン状のコロニーでは見られません。また、本実験において、バイオフィルム内の細菌は通常、抗生物質に対してより高い耐性を示します。青色で示されたpseudomonas aerogenのプランクトン培養におけるトブラマイシンの最小発育阻止濃度は、約4 µg/mLであると決定されました。

対照的に、赤色で示されているように、バイオフィルム内の細菌は100%が512 micrograms per milliliterの抗生物質まで生存しました。このビデオを視聴することで、定義された人工痰培地で細菌を培養する方法について十分に理解できたはずです。また、嚢胞性線維症の肺に近い、より現実的な環境において細菌の増殖を抑制するために必要な最小発育阻止濃度を決定するための、抗生物質感受性試験を実施できるようになるはずです。