Name: 吸引ピペット技術を用いた嗅覚受容ニューロンから記録匂い物質誘発性応答 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: 学ぶ吸引ピペット技術によるマウス嗅覚受容ニューロンからの匂い物質誘発性応答記録法。この手法は長時間の安定した電気生理学的記録を可能にし、嗅覚信号伝達機構の解明に貢献します。

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この作品は、NIH DC009613、ヒューマンフロンティア·サイエンス·プログラムとモーリーケアフェローシップ（JRに）によってサポートされていました。

1。録画設定記録室はエアテーブル上に取り付けられ、電気的にファラデーケージを使用してシールドされている位相差光学ニコンTE2000U Eclipseの倒立顕微鏡に搭載されている。プレキシガラスの記録室には2つのセクションが部分的障壁によって分離し、シラン化スライドガラス上に接着で構成されています。他の着臭剤にはまだ決着が使用されていない細胞の早期の曝露を最小限にするために記録中に刺激露光に使用されている間、チャンバの1つのセクションのセルを解決するために使用されます。録画設定をペレットピペットホルダ及び接地電極に取り付けられた吸引ピペット（下記参照）で構成されています。吸引ピペットはマイクロマニピュレーターを使用して配置されています。スティミュラス·ソリューションは、それぞれの正方形の管が0.7ミリメートル×0.7ミリメートルであることと、トリプルバレルガラス正方形の管を使用して適用されます。トリプルバレルガラスがマニピュレータに搭載された電動の高速ステップ灌流システム（SUTに接続されていたTER SF-77B、ワーナー·インスツルメンツ）や〜45°の角度で記録室に入った。トリプルバレルガラスの端はトリプルバレルガラスの最終面（開口部）がピペットの緊密な位置決めを可能にするために、垂直となるように再び45°の角度で面取りした。 標準哺乳類リンゲル液及び接地電極でいっぱい吸引ピペット電極電圧クランプモードでパッチクランプアンプの1GΩヘッドステージ（PC-501A、ワーナー·インスツルメンツ）に接続されている。アンプ（5kHzでローパスフィルタ）からのアナログ信号は、リアルタイムで信号を監視するためにデジタルオシロスコープに表示され、また信号がLow通過フィルタ処理されている8極ベッセルフィルタ（クルーン-ハイト）に接続されている50 Hzで。両方の信号は（5 kHzと50 Hzのローパスフィルタ）データ取得のためにPCに接続されているA / Dコンバータ（ケンブリッジ電子設計マイクロ1401 mkIIの）に供給される。データは、信号3 ACQを使用して記録されている10kHzのサンプリング周波数でuisitionソフトウェア（ケンブリッジ·エレクトロニック·デザイン）。信号は最初のレコードに2つの異なる帯域幅重畳活動電位とその後単独で現在の受容体と一緒に現在の受容体（ 図2参照 ）で記録されます。灌流システムはリンガー（コントロール）ソリューションと匂い物質刺激または所望の組成の任意の解決策の間で急速に切り替えるために使用して、PCおよびシグナル3ソフトウェアによって制御されます。ソリューションは60ミリリットルの注射器に含まれており、流量は医療グレードの静脈フローレギュレータによって制御されます。一般的に、流量は1ml /分に設定されています。 記録ピペットで吸引は、次の方法で制御されます。ピペットホルダーのサイドポートが順番に高さ調節可能なオイルタンクに接続されているオイルラインに接続されている。貯水池を上げるか、下げるとPの先端を介して、そのピペット圧力、したがってリンガーの流れを確実にipetteは最小限とわずかに正である。追加の吸引または圧力が記録ピペットの先端に孤立ORNの細胞体を吸うためにもう一方の端でマウスピースと貯水池の空域に接続されたチューブを介して適用することができます。 実験は密接に細胞の本来の生理的状態をシミュレートするために、37℃で行われる。温度は、溶液を含有するステンレス鋼管が10を通過されるときに通過するセラミック抵抗から構成されてカスタムメイドの加熱ユニットによるソリューションを渡すことによって制御される。温度は熱電対温度計（フルーク）を使用して監視されています。 2。ソリューション哺乳類リンゲル液（MM）：140のNaCl、5mMのKCl、1 MgCl 2を 、2のCaCl 2、0.01 EDTA、10mM HEPES、10mMグルコース。 pHはNaOHで7.5に調整した。 10パーセント希釈のリンゲル液は、接合電流を測定するために使用された。 OdoraNTソリューション：アセトフェノンとオイゲノールを20mM DMSOストックからリンゲル液で毎日調製した。 3。電極を作る<ol><li>サッターのP-97マイクロピペットプラーの毛細血管unfilamentedホウケイ酸ガラスを置き、長いテーパーでマイクロピペットを引き抜きます。 </li><li>接眼レンズとステージ上に取り付け可動ダイヤモンドナイフでレチクルを装着し、順番にあるニコンE200のEclipseの顕微鏡に搭載されたカスタムメイドのマイクロピペットホルダーにピペットを転送します。 </li><li> 20倍対物レンズ下にピペットの先端を観察し、レチクルをガイドとして使用して、穏やかにスクライブピペットは10μm幅（外径）である場合、カスタムメイドのダイヤモンドナイフを使用して90°の角度でピペット。 </li><li>先端に向かってさらにダイヤモンドナイフを動かして、徐々にダイヤモンドナイフで先端に圧力をかける。ピペットチップは、それがスクライブされた時点ではきれいに破ってはならない。 </li></ol>あるいは、3.1へのステップを3.4を組み合わせることができ、それがこのような大規模な先端径ときれいにカットエッジで確実にピペットを引くのは難しい証明することができますが、ピペットは、ピペットの先端をカットすることなく、直接所望の寸法で引っ張ることができます。 <ol start="5"><li> 40X目的の下で、電気的に加熱されたフィラメントを用いた5μmの内径にピペットの先端を磨いて発射。完了したら、マイクロピペットは、マウスORNsからの電流を記録するために使用する準備ができました。リンゲル液で満たされたときに開いてピペット抵抗は1MΩ前後となるはずです。 </li></ol> 4。嗅覚受容ニューロンの分離<ol><li>制度ガイドラインと規則に従ってマウスを生け贄に捧げる。 、ヘッドを取り外し剥がれ皮膚が頭蓋骨を覆うと内側に正中線に沿って頭を二等分する。 </li><li>解剖顕微鏡下で2つの半頭を置き、鼻中隔をやってのけると嗅覚の甲を削除します。グルコースcでシャーレ内のすべての組織を置く哺乳類リンゲル液をontaining。 </li><li> 2甲から、基礎となる軟骨オフ嗅上皮をむき、250μlのリンガーを含むエッペンドルフチュー​​ブに組織を移す。私達は私達の記録室のサイズのセルの右密度を得るために2甲から組織を使用しています。 ℃で後で使用するために4時に残りの組織を保管してください。 </li><li>渦、中程度の速度で1秒間二回短く嗅上皮を含むエッペンドルフチュー​​ブ。このステップでは、上皮からORNsの機械的解離につながる。 </li><li>録音室で解離ORNsを含むリンゲル液を置きます。細かい鉗子を用いて懸濁液中にも存在する組織の大部分を削除します。 </li><li> ORNsはリンガーで連続灌流を開始する前に20分間静やレコーディングに進みましょう。 </li></ol> 5。録音<ol><li>録音室にオイルラインに接続されており、regul吸引電極を下げる石油貯留層の高さは、ピペットの先端でわずかに陽圧を確立するために食べました。これは、ピペットから（正圧）または（負圧）に向かって遠ざかっ例えば細胞の破片を観察することによって行うことができます。細胞破片とピペットの先端を汚染しないようにしよう。 </li><li> 20-40Xの倍率を使用して、その代表的なバイポーラ·形態によって認識することができる孤立ORNの録音室をスキャンします。 ORN細胞体の近接に記録電極を移動します。穏やかに細胞体がピペットの先端に入るようにしゃぶり始める。慎重に、かつ徐々に全体の細胞体を浴溶液にさらされる樹状突起や繊毛を残し、吸引ピペットの先端に引き込まれるまで吸引を引き続き適用されます。吸い込まORNsとピペットの形状のイメージについては7,11を参照してください。全く吸引が適用されていません一度、ORNは、ピペットの中で移動したり、出ていないことを確認します。そうだとすれば、それに応じてオイル溜まりの高さを調整します。 </li><li>使い方マニピュレーターは、チャンバの記録部に定住ORNsを含むセクションから吸引ピペットを移動します。溶液交換のための3銃身の筒の前に吸引ピペットを慎重に配置します。 ORNは、このように混合乱流を避ける層流にさらされていると高速溶液交換を達成するように、吸引ピペットは十分近い3銃身の管の開口部に配置しなければなりません。溶液交換を吸引ピペットの先端を流れる液のパラレル·ストリームの間のインタフェースを踏むことによって達成されます。溶液交 ​​換の時間経過は、典型的には、異なるイオン組成の解の間のセル（ 図2参照 ）ステッピングによって誘発接合電流から測定された約20 msである。ソリューションは、重力によって配信されます。 </li></ol> &lt;スパンクラス= "pdflinebreak"&gt; 6。代表的な結果<img alt="図1。" src="/files/ftp_upload/3862/3862fig1.jpg"> 嗅球における図1）バイポーラ受容ニューロン。 B）の繊毛におけるシグナル伝達機構は、最終的に現在の流入を興奮につながる。その後の脱分極は細胞体における活動電位の発生をトリガーします。 <img alt="図2。" src="/files/ftp_upload/3862/3862fig2.jpg"> 図2は、溶液交 ​​換の速度と信頼性を示しています。ピペットは、通常から100ミリと異なるイオン濃度が記録されたから得られる電流接合のための10％希釈リンガーに足を踏み入れた。黒のトレースはaveのです5試験の激怒、赤はそのSDをトレースします。溶液交換時にSDにはほとんど変化がトライアルからトライアルに溶液交換の信頼性といずれかのソリューション·ストリーム内の過剰雑音の欠如を示しています。 <img alt="図3。" src="/files/ftp_upload/3862/3862fig3.jpg"> 図3は、吸引ピペット技術を用いて、ORNからオイゲノール誘発性応答を示しています。記録上のバーで示されるようORNは1秒間100μMのオイゲノールにさらさ​​れていた。 図。 3A（黒のトレース）は、現在の受容体は幅0でろ過した-現在使用中の受容体を表示するには、50 Hzの図。 （APは、矢印で示されている）も、活動電位を表示するには、5000 Hzの（赤いトレース） - （b）は、現在0の広い帯域でフィルタリングし、同じ記録を示しています。挿入図は、応答の開始時に、より明確にAPを視覚化するために拡大スケールで同じトレースを示しています。 <img alt="図4。" src="/files/ftp_upload/3862/3862fig4.jpg" files>オイゲノール応答性ORNの図4。用量反応家族（）。オイゲノールを0.3μMから100μMの範囲の濃度で使用された、刺激の持続時間は1秒であったとトレースは0でろ過された - 50 Hzです。着臭剤濃度の漸進的増加は、匂い物質への暴露が終了しましたら、またもっとゆっくり終了し、より大型で高速応答、につながった。 ORNsは中間着臭剤濃度（ 図4B）で長時間刺激時の振動応答パターンを表示することができます。ここacetephenone（3μM）応答ORNは8秒間刺激した。刺激の発症小さく、繰り返し応答の一連の高速性と過渡応答のピークの後に観察されています。 50 Hzの - 記録帯域は0でした。

<ol><li>Reisert, J., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on%3A+Information+and+coding+in+mammalian+sensory+physiology%3A+Response+kinetics+of+olfactory+receptor+neurons+and+the+implications+in+olfactory+coding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Perspectives on: Information and coding in mammalian sensory physiology: Response kinetics of olfactory receptor neurons and the implications in olfactory coding.</a> J. Gen. Physiol. 138, 303-310 (2011).</li>
<li>Kaupp, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+signalling+in+vertebrates+and+insects%3A+differences+and+commonalities%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Olfactory signalling in vertebrates and insects: differences and commonalities.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11, 188-200 (2010).</li>
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<li>Reisert, J., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+recording+of+receptor+current+and+intraciliary+Ca2%2B+concentration+in+salamander+olfactory+receptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous recording of receptor current and intraciliary Ca2+ concentration in salamander olfactory receptor cells.</a> J. Physiol. 535, 637-645 (2001).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もない。

<p class="jove_content"&gt;吸引ピペット技術が同時にORNから臭気誘起遅い受容体電流と高速二相性活動電位を記録するために使用される電気生理学的な手法である。細胞の形質膜が破られていないので、この方法は、付臭剤応答が細胞内因子の細胞質イオン濃度または希釈の変化に起因する変更されていないことを確実に邪魔されずに細胞内の環境を残します。細胞は、長期間（マウスの中の蛙と1時間で最大4時間）のから録音することができます。細胞体は記録ピペットの内側にあるので、この手法のもう一つの利点は、刺激が唯一ORNの先端部に配信されていること、そうであるように繊毛や樹状ノブ（IEです<em生体内で&gt;</em&gt;）このように、セル全体が露出した場合に発生する可能性の非特異的効果を排除。セルは比較的よくピペット、高い溶液流量の先端に安定座っにより保護されていますので、高速なソリューションの変更を達成することができるとしても、高流量が簡単にシールが失われる可能性がありタイトなシール記録構成に比べ。細胞内のアクセスが得られていないので、逆に、この技術は研究電位依存性電流をEGにセル電圧クランプするために使用することはできません。それが緩んシール技術であるため、また、録音は様々なソ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 材料の名称 </td><td> タイプ </td><td> 会社 </td><td> カタログ/ 型番 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td>空気テーブル</td><td>機器</td><td>ニューポート</td><td></td><td></td></tr><tr><td>空気ポンプ</td><td>機器</td><td>ニューポート</td><td> ACGP </td><td></td></tr><tr><td>ピペットプラー</td><td>機器</td><td>サッター</td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラス</td><td>機器</td><td> WPI </td><td> 1B150-4 </td><td></td></tr><tr><td>ニコン倒立顕微鏡エクリプス</td><td>機器</td><td>ニコン</td><td> TE2000U </td><td> Hgランプ、GFPフィルターや目標少なくとも20Xと5X装備</td></tr><tr><td>アンプのPC-501A </td><td>機器</td><td>ワーナー</td><td> 64から0008 </td><td>ヘッドステージ1GΩ </td></tr><tr><td>ダイヤモンドナイフ</td><td>機器</td><td>カスタムメード</td><td></td><td></td></tr><tr><td>デジタイザMikro1401、A / D </td><td>機器</td><td>ケンブリッジ·エレクトロニック·デザイン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>フィルタユニット3382 </td><td>機器</td><td>クルーンハイト法人</td><td></td><td></td></tr><tr><td>信号</td><td>ソフトウェア</td><td>ケンブリッジ·エレクトロニック·デザイン</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ag / AgCl電極ペレット成形</td><td>機器</td><td> WPI </td><td> 64から1297 </td><td></td></tr><tr><td>ピペットホルダ</td><td>機器</td><td>ワーナー</td><td> 64から0997 </td><td>カスタムは、適合するように変更 ヘッドステージ</td></tr><tr><td>記録室</td><td>機器</td><td>カスタムメード</td><td></td><td></td></tr><tr><td>極微操作装置 MP85-1028 </td><td>機器</td><td>サター·インストゥルメント</td><td>極微操作装置 MP85-1028 </td> &lt;TD&gt; </td></tr><tr><td>鉱油</td><td>ソリューション</td><td>シグマ</td><td> 330779-1L </td><td></td></tr><tr><td>オシロスコープのTDS 1001 </td><td>機器</td><td>テクトロニクス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>三連発四角いガラス管</td><td>機器</td><td>ワーナー</td><td> 64から0119 </td><td> 5センチメートル長い0.6ミリメートルのID、 </td></tr><tr><td>バルブ</td><td>機器</td><td>リー·カンパニー</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Valvelink 8.2 </td><td>機器</td><td>科学自動化</td><td></td><td></td></tr><tr><td> SF-77B潅流高速ステップ</td><td>機器</td><td>ワーナー</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

吸引ピペット技術を用いた嗅覚受容ニューロンから記録匂い物質誘発性応答

Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique

動物は鼻腔に位置化学感覚系を介してそれらの周りに臭気環境をサンプリングする。化学感覚シグナルには、食べ物の選択、捕食動物、同種と認識メイトや他の社会的に関連する手がかりとして複雑な動作に影響を与えます。嗅覚受容ニューロン（ORNs）が嗅上皮に埋め込まれた鼻腔の背の部分に位置しています。これらのバイポーラニューロンは嗅球（ 図1参照 、もともと一般生理学のジャーナルで発表Reisert＆趙1）に軸索を送って、嗅覚をカバー粘液にどこ繊毛上皮から放射国境に単一の樹状突起を延ばす上皮。チャネル（ 図1） -繊毛は、最終的に毛様体伝達チャネル、環状ヌクレオチド依存性（CNG）をチャネルとCa 2 +活性化Clを通る電流の流入を興奮につながるシグナル伝達機構が含まれています。その後depolarizationは、細胞体2から4で活動電位の発生をトリガーします。 このビデオでは、ORNsから匂い物質誘発性の応答を記録するための &quot;吸引ピペット技術&quot;の使用方法について説明します。このメソッドは当初、桿体5から記録するために開発され、この方法の変形例は、マウスの錐体6から記録するように修正jove.comで見つけることができます。吸引ピペット技術は後でまたORNs 7,8から録音するように適合された。簡単に言えば、嗅上皮と細胞単離の解離後、ORNの全体の細胞体は、記録ピペットの先端に吸引される。デンドライトと繊毛は浴溶液にさらされると、例えば匂い物質または薬理ブロッカーアプリケーションを有効にするソリューションの変更することがアクセス可能な状態のままです。この構成では、細胞内環境へのアクセスが得られません（無細胞全体の電圧クランプ）と細胞内の電圧が変化すること自由に残っています。これは、すべて繊毛と細胞体9によって発射速い活動電位を起点遅い受容体電流の同時記録をOWS。これらの2つの信号間の動態の違いは、それらが異なるフィルタ設定を使用して分離することができるようになります。この手法は、任意の野生型またはノックアウトマウスで使用することができますまたはもORNsの特定のサブセットを標識するためにGFPを発現ORNsから選択的に記録するために、例えば与えられた嗅覚受容体やイオンチャネルを発現している。

嗅覚受容ニューロン（ORNs）が受容体に最初のターンで嗅球の2次ニューロンに伝達される活動電位を引き起こすことを、現在の匂い信号を変換します。ここでは同時に匂い物質誘発性受容体マウスORNsから現在の活動電位を記録するための吸引ピペットのテクニックについて説明します。

動物は、鼻腔内に位置する化学感覚系を通じて、周囲のにおい環境をサンプリングしている。化学感覚信号は、複雑な...

この手順の全体的な目的は、マウスの嗅覚受容体ニューロンから、におい物質によって誘発される応答を記録することです。まず、嗅上皮を切り出し、マウスの嗅覚受容体ニューロンを単離します。次に、単離した嗅覚受容体ニューロンを、倒立顕微鏡に設置された記録チャンバー内に配置します。マイクロマニピュレーターで記録電極と溶液交換装置を保持します。次に、特定した嗅覚受容体ニューロンを吸引ピペット電極の先端に吸引します。最後のステップとして、細胞を吸引したピペットを溶液交換装置の前に配置し、ニューロンを匂気物質にさらします。最終的に、嗅覚受容体ニューロンの機能を調べるために吸引ピペット記録法が用いられます。ホールセル電位固定法などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、迅速かつ精密な溶液置換を行いながら、長時間の記録が可能であることです。記録用ピペットの形状が重要であり、またソケット細胞をピペットの先端に安定して配置させる習得が困難であるため、この手法を視覚的に提示することが極めて重要です。まず、マイクロピペットプラーを用いて、UNFIラミネートホウケイ酸ガラスキャピラリーをロングテーパー状に延伸し、マイクロピペットを作製します。次に、このピペットを正立顕微鏡に装着した特製のマイクロピペットホルダーに移します。この顕微鏡の接眼レンズにはレティクルが組み込まれており、ステージには可動式のダイヤモンドナイフが装着されています。次に、20倍の対物レンズでピペットの先端を観察します。レッドルをガイドとして使用してください。特製のダイヤモンドナイフを用い、外径10 µmのピペットを90度の角度で静かに切削します。ダイヤモンドナイフをさらに先端方向へ移動させます。徐々に圧力を加えると、切り込みを入れた箇所でピペットチップがきれいに折れます。次に、40倍の対物レンズ下で、電気加熱フィラメントを用いてピペットの先端を内径5 µmまで火炎研磨します。完了後、このマイクロピペットはマウスのornから電流を記録するための準備が整ったことになります。次のステップでは、マウスを安楽死させ、頭部を摘出します。次に、頭蓋骨を覆っている皮膚を剥ぎ取り、続いて正中線に沿って頭部を二等分します。その後、2つの半頭部を解剖用実体顕微鏡に移します。鼻中隔を引き抜き、嗅甲介を除去します。組織を、グルコースを含む哺乳類用リンガー液を入れたペトリ皿に配置します。その後、2つの鼻甲介から、下層の軟骨から嗅上皮を剥離します。組織を、250 µLのリンガー液が入ったエプンドールチューブに移します。その後、残りの組織を4 °Cで保存し、後で使用します。嗅上皮を含むEORチューブを、中速で1秒間、2回短くボルテックスします。この工程により、上皮からNSが機械的に解離されます。次に、解離させたORNを含むリンゲル液を顕微鏡に搭載した記録チャンバーに入れます。微細ピンセットを用いて、懸濁液中の大きな組織片を取り除いてください。ORNを20分間静置した後、リンゲル液による連続灌流を開始し、本手順の記録へと進みます。ピペットにリンゲル液を満たしてください。ピペットをピペットホルダーにセットし、ホルダーをパッチクランプアンプのヘッドステージに取り付けます。次に、オイルラインをピペットホルダーのサイドポートに接続します。その後、ピペットを記録チャンバー内に降ろします。オイルリザーバーの高さを調節し、ピペットチップにわずかな正圧がかかるように設定してください。これは、細胞残骸がピペットから遠ざかるか、または近づくかを観察することで確認できます。ピペットの先端に細胞残骸が付着しないように注意してください。次に、20倍から40倍の倍率で、典型的な双極性の形態を持つ単独のORNを記録室内で探索します。次に、記録電極をORN細胞体のすぐ近くに移動させます。オイルリザーバーに接続されたエアラインを軽く吸引し、細胞体がピペットの先端に入るようにします。吸引ピペットの先端に細胞体全体が吸い込まれ、樹状突起と繊毛がバス溶液に露出するまで、注意深くゆっくりと吸引し続けてください。吸引ピペットを、沈殿したORNが含まれるセクションから、チャンバーの記録セクションへ移動させます。溶液交換用の3管式チューブの前へ、慎重に吸引ピペットを配置してください。ORNが層流にさらされ、混合による乱流を避けられるよう、吸引ピペットは3管式チューブの開口部に十分近づけて配置する必要があります。溶液交換を行うには、溶液チェンジャーの3管式チューブから流出する平行な溶液流の境界を、吸引ピペットの先端にわたって移動させ、溶液交換の質と信頼性をモニタリングします。異なるイオン組成の溶液間で細胞を移動させることで誘発される接合電流を測定できます。溶液交換のタイムコースは通常20 milliseconds程度です。嗅覚受容ニューロンをにおい物質溶液にステップ導入すると、ここでにおい物質誘発反応を誘発させることができます。記録上のバーで示されている通り、ORNを100 µMのオイゲノールに1秒間曝露させました。上段のパネルでは、受容体電流のみを表示するために、受容体電流を0から50 Hzの帯域幅でフィルタリングしています。下段のパネルは、活動電位も表示させるため、同じ記録を0から5,000 Hzの広帯域でフィルタリングしたものです。ここでは、オイゲノール応答性ORNの用量反応を示します。オイゲノールの濃度は0.3 µMから100 µMの範囲で使用しました。刺激時間は1秒とし、トレースは0から50 hertzでフィルタリングした。臭気物質の濃度が漸次的に上昇するにつれて、反応の立ち上がりはより大きく速くなり、また終了までの時間もより緩やかになった。臭気物質への曝露が終了すると、中程度の濃度による長時間の刺激において、ORNSは振動的な反応パターンを示すことがある。ここでは、アセトフェノン応答性ORNを8秒間刺激しました。刺激開始直後に速く一過性のピーク応答が見られます。この手順を試みる際、一連のより小さな繰り返し応答が観察されます。嗅覚受容体ニューロンは慎重に扱い、十分な忍耐を持って操作することが重要です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

electroolfactogram（EOG）記録は、嗅上皮のレベルでの嗅覚機能を評価するための有益な、簡単に行動し、信頼性の高い方法です。このプロトコルは、録音の設定、マウスの組織の準備、データ収集、および基本的なデータ解析を説明します。...

空気相Electroolfactogram記録を用いたマウス嗅覚神経細胞の分析応答

このビデオは、穴あきパッチクランプ技術を使用して、マウスの嗅覚ニューロン(OSN)の電気生理学的記録を示しています。蛍光色素にタグされた匂い受容体を持つOSNを含む嗅上皮は、マウスから単離され、記録チャンバーに固定されます。記録ピペットはOSNの樹状突起ノブに固定され、ピペット内のナイスタチンがメンブレンを穿孔して細胞との電気的接続を形成します。最後に、別のピペットを使用して臭気刺激剤を送達し、パッチを当てた細胞の電気生理学的活性を記録する。...

マウスの嗅覚ニューロンの穿孔パッチクランプ記録

プロトコルビデオは、マウスの鋤鼻器官(VNO)の感覚ニューロンからの電気生理学的記録のための全細胞パッチクランプの確立について説明しています。蛍光標識された感覚ニューロンを備えた冠状VNOスライスを記録セットアップに配置します。標識されたニューロンは、化学刺激に応答して電気生理学的記録のために、全細胞構成の記録ピペットでパッチされます。...

鋤鼻感覚ニューロンからの電気生理学的記録のための全細胞パッチクランプの確立

このビデオでは、生きたショウジョウバエを電気生理学的研究のためにチューブに取り付けています。電極はセンシラムの基部に配置され、ハエの嗅覚受容体ニューロンによるフェロモンに対する特定のニューロン応答を記録します。...

揮発性臭気物質に応答したショウジョウバエSensillaの電気生理学的記録

我々は、無脊椎動物の嗅覚経路の最初の3つの段階で臭気誘発反応を特徴づける細胞外マルチユニット記録技術のバリエーションを示しています。これらの技術は簡単にだけでなく、他の神経系において、アンサンブル活動を調べるために適合させることができます。...

ローカスの神経活動を特徴づけるためにマルチユニット記録方法（<em&gt; Schistocercaアメリカーナ</em&gt;）嗅覚回路

嗅覚ニューロンの生理学的特性の分析には、まだ技術的な限界があります。ここでは、遺伝子標的マウスの嗅上皮の無傷の準備で穴あきパッチクランプを介してそれらを記録します。この技術により、特定の嗅覚受容体を発現するニューロンの特定のリガンドに対する膜特性と応答の特性評価が可能になります。...

無傷の神経上皮におけるマウス嗅細胞の穿孔パッチクランプ記録：同定された嗅覚受容体を発現するニューロンの機能解析

トコジラミは、触角の嗅覚感覚に収容された嗅覚受容体ニューロンに依存して、環境中の記号化学物質を検出します。シングルセンシラム記録を利用して、セミオケミカルに対するトコジラミの反応を評価する方法を示し、関連するコーディングプロセスを探求します。...

情報化学物質にトコジラミの嗅覚ニューロンの応答を検出するために単一感覚子録音を使用しました

嗅覚受容体の機能を特徴づける deorphanization...

生細胞測定の嗅覚受容体活性化アッセイを用いた、リアルタイム キャンプ

このプロトコールの全体的な目標は、長鎖クチクラフェロモンに応答するショウジョウバエの嗅覚受容体ニューロンからの単一感覚記録のための低揮発性の付臭剤を提示する方法を示すことである。...

からの電気生理学的記録<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;低揮発性の臭気物質に対するトリコイドセンシラ

生理的には、嗅覚受容体は匂い分子気相に吸入によってアクティブ化されます。ただし、ほとんどの in vitro システムは、液相嗅覚刺激を利用します。嗅覚刺激による気相匂い物質受容体活性化のリアルタイムでの in vitro...

気相で、嗅覚による嗅覚受容体活性化の In Vitro モニタリング リアルタイム

嗅覚神経からの細胞外多単位記録は、海洋魚の嗅覚感受性を評価するための敏感で堅牢で再現性の高い方法である。それは一次感覚入力を記録し、外部の分量に依存しない。...

テレオストの嗅覚神経からの細胞外多単位記録

学ぶ吸引ピペット技術によるマウス嗅覚受容ニューロンからの匂い物質誘発性応答記録法。この手法は長時間の安定した電気生理学的記録を可能にし、嗅覚信号伝達機構の解明に貢献します。

吸引ピペット技術を用いた嗅覚受容ニューロンから記録匂い物質誘発性応答

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