Name: シランカップリング剤を用いた石英系光バイオセンサーへの生物学的プローブの取り付け (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: 学ぶシランカップリング剤を用いた石英系光バイオセンサーへのビオチン取り付け法。共有結合による頑健なプローブ固定で、高感度と特異性を維持しながら長期保存可能なバイオセンサー開発に貢献します。

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作者は感謝し、このプロトコルが開発された時にサポートするために南カリフォルニア大学教授アンドレア·アルマーニを認める。この作品の最初の開発のための資金は、国立科学財団によって提供されました[085281と1028440]とNIHのディレクターの新イノベーター賞プログラムを通じて国立衛生研究所[1DP2OD007391-01]。追加情報はで入手できます。 <a href="http://web.missouri.edu/~hunthk/" target="_blank">http://web.missouri.edu/〜hunthk /</a> 。

1。背景ビオチンは、単純な、3段階のプロセス（ 図1）を介してこれらのデバイスの表面に付着されています。まず、表面をきれいにし、酸素プラズマまたはピラニア溶液のいずれかにデバイスを公開することにより、ヒドロキシル基を移入します。第二に、私たちは加水分解および縮合反応によりヒドロキシル基に第一級アミンで終端シランカップリング剤を添付する蒸着を使用しています。第三に、我々はN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）エステル化学を介して表面にビオチンを添付してください。我々は、これらの手法を選択するためのより多くのこれらの技術の開発に関する情報と同様に、私たちの動機の説明については、私たちの前の仕事に興味のある読者を指示します。8 これらの反応の成功は、同様にビオチンを添加した後、第一級アミンを添加した後、光や蛍光顕微鏡法によって評価することができます。一方、光学メートルicroscopyは、表面機能化プロトコルは、ミクロスフェアの表面に損傷を生じ、あるいは汚染、蛍光顕微鏡は、品質と均一性ビオチン分子の表面被覆率のほか、ビオチンの機能上のを確認するために使用されているかどうかを判断するために使用することができ（ストレプト）アビジンと結合する表面。表面上のアミンのカバレッジを評価するために、我々はフェアに安定した、共有結合、チオ尿素結合を形成する第一級アミンと反応し、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）の蛍光色素を使用していました。アビジンにコンジュゲートされたテキサスレッド蛍光色素、ビオチン - アビジン相互作用を介して表面にビオチンのグループにラベルを付けるために使用されています。両方のケースでは、染料は表面上の官能基と（受容体 - リガンド相互作用または共有結合のいずれかを介して）相互作用することができる選ばれました。 ここでは、3脱離基と一つの官能基を持つシランカップリング剤は、ブリッジの賭けを提供しています無機表面と有機プローブ分子を予期する。第一級アミンの機能は、安定なアミド結合を形成するためにNHSエステルと定量的に反応します。この例では、我々は、その吉側鎖NHSエステル基で修飾されたビオチンプローブ分子を使用しています。現実的には、へのプローブ分子は、NHSエステル基は、以下のプロトコルを使用して表面に追加することができます。さらに、これらのプロトコルは一般的であり、ビオチンと任意のシリカデバイスの表面を官能化することができます。 これらのプロトコルを使用して、プライマリの課題は、化学自体ではなく、シリカ微小球の処理に実際にではありません。プロトコルを通じて、ミクロスフェアは、鋭い先端がピンセットで軽く、その茎をgrapsingによって処理されるべきである、ということに注意してください。これはよく離れてミクロスフェア自体からピンセットを保持し、ステップ間の容易な輸送を可能にします。以下のプロトコルには多くのステップが明確にこの事実に対処するために設計されていますまたは。 2。ミクロスフェア作製<ol><li>ミクロスフェアのストレージ筐体を構築します。 <ol><li>これは通常サイズのスライドガラスの上にテープを、その両端がロールを形成するために満たした上で、スコッチテープのセクションに1を添付する。exactoナイフを使用して、正方形でxで1に段ボールの厚切りの¼をカット、段ボールへ。 </li><li>これは、ミクロスフェアは、周囲の環境から上昇し、分離することができるプラットフォームを作成し、その表面への損傷を防ぐことができます。 </li></ol></li><li>はさみを使用して、光ファイバのスプールから光ファイバの3インチのセクションを切る。 </li><li>無ニックファイバストリッパを使用して、単にシリカコアを残して、繊維の切断片の終わりの最後の0.5インチから保護ポリマーコーティングを取り除きます。優しくキムワイプで光ファイバを拭いて、メタノールで湿らせたキムワイプで残っているポリマーの表面を清掃してください。 </li><li>目のように、裸ファイバカッタを使用して、ストリップの端をトリミングする除去繊維の約1ミリメートルでは、光ファイバの端に残っている。 </li><li>垂直に取り除かエンドがダウンして直面しているような繊維を揃えるように注意しながら、CO 2レーザ光 ​​の経路に光ファイバの被覆をはがした端を置きます。 </li><li> CO 2レーザーの電源をオンにして、光ファイバの被覆をはがした端の表面にそれを指示します。レーザーは2秒で約3.5％​​の電力を使用して球体に光ファイバの被覆をはがした端を溶かします。 </li><li>ピンセットを使用して、慎重にマイクロスフェアのステム（光ファイバの非最低限の部分）を把握する。フェアハウジングにテープロールにステムを取り付けます。スライドガラスは、ペトリ皿の中で自分自身を保存することができます。これはマイクロの安全な保管が可能になります。 </li></ol> 3。ヒドロキシル基を有する表面を移入<ol><li>ピラニア溶液を使用する： <ol><li>ヒンジキャップ付き60mLのポリプロピレンバイアル中で、H、発煙量で（70:30をピラニア溶液を調製<sub&gt; 2 SO 4：H 2 O 2（30重量％））発煙硫酸の11.6 mLを、続いてバイアル瓶に過酸化水素5mlを追加します。注意：耐酸性手袋を着用してください。 </li><li>バイアルに、少なくとも1つのミクロスフェアを保持して、スライドガラスを転送します。ミクロスフェアは、液体に接触する必要がありますが、液体は段ボールに手を触れてはいけません。必要に応じて溶液の体積を調整します。 </li><li>静かにバイアルからスライドガラスを削除し、DDI H 2 Oを含む別のプラスチックバイアルに挿入しサンプルは5分のためのソリューションに座ってみましょう。 </li><li>静かにバイアルからスライドガラスを削除し、80℃オーブン°表面を乾燥させるCで10分間置きます。 </li></ol></li><li>酸素プラズマ処理を使用する： <ol><li>酸素プラズマチャンバーに少なくとも一つのミクロスフェアを含有するガラススライドを転送します。 </li><li> 200ミリトールに酸素分圧、および120 Wの2マイルのために酸素プラズマにサンプルを公開するためのパワーを設定nutes。 </li><li>プラズマチャンバーからスライドガラスを削除します。 </li></ol></li></ol> 4。表面にシランカップリング剤を取り付ける<ol><li>ヒュームフードの真空デシケーター内に、少なくとも一つのミクロスフェアを含む、スライドガラスを配置します。 </li><li>また、ドラフトでは、シランカップリング剤のボトルを（この例では、アミノプロピルトリメトキシシラン（APTMS）を使用した）を開き、デシケーター中で開かれたボトルを置きます。 </li><li>真空デシケータに蓋を交換し、アスピレーターまたは施設の真空ラインに出口ポートを接続します。 </li><li>家の掃除や水のラインをオンにし、真空デシケーターを避難させる。真空シールは蓋とベースの間に形成された後、反応のタイミングを開始します。これは、薄膜の表面にシランカップリング剤を入金します。 </li><li> 15分後、真空をオフにし、ゆっくりとデシケータに空気をできるようにポートを開きます。このカップリング剤では、15分unifoを形成するのに十分です。表面上の単分子層のrm。他のカップリング剤は、時間を調整する必要があります。 </li></ol> 5。表面にビオチンを取り付ける<ol><li>約1時間ビオチンを取り付ける前に、ヒンジキャップで60 mlのポリプロピレンバイアル中で無水ジメチルスルホキシド（DMSO）にN-hydroxylsuccinimideビオチン（NHS-ビオチン）の10 mM溶液を調製する。 <ol><li> NHS-ビオチンを冷保存されている場合は、それをマス前に室温に平衡化することができます。 </li><li>完全に溶媒中でNHS-ビオチン粉末を溶解するために1時間のためのソリューションを超音波処理してください。 </li></ol></li><li>下部にミクロスフェアを、別のプラスチックバイアルにマイクロスフェアを含有するガラススライドを転送し、バイアルの上部に生じている。 </li><li>スライドガラス（それはバイアルに追加されているようにソリューションがフェアに触れていない）の後ろに、バイアルの側面の下のプラスチックピペット、NHS-ビオチン溶液の適切なボリュームを使用して転送。 Aミクロスフェア表面を覆うようにDDに十分なソリューションを提供します。 </li><li>それぞれ、5 rpmと5度での速度と傾斜の角度で、室温で30分間現在ロッキングインキュベーターにDMSO溶液中で微小球とNHS-ビオチンを含むバイアル（傾斜トレイ）を配置します。 </li><li>静かにバイアルからスライドガラスを削除し、穏やかにDDIのH 2 Oで満たされた別のバイアルにスライドさせ前と同じ速度と傾斜角度で別の10分間の傾斜トレイにバイアルを置きます。新鮮な水で二回するたびにこの手順を繰り返します。これは、表面から余分なDMSOを除去することができ、表面に実際に移植しなかったすべての物理的に吸着ビオチンを削除します。 </li><li>バイアルからスライドガラスを削除し、すべての水滴が表面から除去され℃で10分間まで、または80℃オーブンに入れてください。 </li></ol> 6。アミン末端シリカの蛍光標識<ol><li> treatm後に存在するアミン基にラベルを付けるにはAPTMSとENTは、1 mLの無水DMSOに1mgのFITCを溶解することにより暗い部屋でFITC溶液を調製。 </li><li> 0.1 M炭酸水素ナトリウム緩衝液1 mLにFITC溶液50μLを加えることによって6.1のソリューションを希釈します。 </li><li>ヒンジキャップで60 mLのポリプロピレンバイアルに溶液を置き、ゆっくりとバイアルにガラススライド上に再び収容されたアミン末端ミクロスフェアを、スライドさせます。 </li><li>氷浴中でバイアルを配置し、サンプルは暗闇の中で最低4時間のためにFITC溶液と反応してみましょう。 </li><li>炭酸ナトリウム緩衝液における微小球の2つ、10分のリンスを介して過剰なフルオロフォアを削除します。前と同じように、バッファを持つヒンジキャップで60 mLのポリプロピレンバイアルを入力し、穏やかに解決策が唯一のフェアではなく、段ボール住宅を対象としていることに注意しながら、溶液中にスライドガラスをスライドさせます。アルミホイルでバイアルをカバーし、前と同じように、5度、5 rpmに設定し、チルトトレイ上にバイアルを配置します。 </li><li>静かにバイアルからスライドガラスを削除し、穏やかにDDI H 2 Oを充填し、アルミ箔で覆われた別のバイアルにスライドさせます。前と同じ速度と傾斜角度で別の10分間の傾斜トレイにバイアルを置きます。新鮮な水で二回するたびにこの手順を繰り返します。これは、表面から余分な染料を除去するのに役立ちます。 </li><li>静かにバイアルからスライドガラスを削除し、イメージングの前に10分間80℃で設定したオーブンで乾燥させます。 </li></ol> 7。ビオチンで終わるシリカの蛍光標識<ol><li>リン酸緩衝化生理食塩にテキサスレッドアビジンの10μg/ mLの溶液を調製します。 </li><li>ヒンジキャップで60 mlのポリプロピレンバイアルに溶液を加え、ゆっくりとマイクロは、単にソリューションで覆われているように、溶液中にビオチンで終わるミクロスフェアを含有するガラススライドをスライドさせます。 </li><li>暗所で室温で30分間反応する。 </li><li> 2を介して過剰なフルオロフォアを削除するには、10分には、すすぎPBS緩衝液中微小球のだ。 <ol><li>前と同じように、バッファを持つヒンジキャップで60 mLのポリプロピレンバイアルを入力し、穏やかに解決策が唯一のフェアではなく、段ボール住宅を対象としていることに注意しながら、溶液中にスライドガラスをスライドさせます。 </li><li>アルミホイルでバイアルをカバーし、前と同じように、5度、5 rpmに設定し、チルトトレイ上にバイアルを配置します。 </li></ol></li><li>静かにバイアルからスライドガラスを削除し、穏やかにDDI H 2 Oを充填し、アルミ箔で覆われた別のバイアルにスライドさせます。前と同じ速度と傾斜角度で別の10分間の傾斜トレイにバイアルを置きます。新鮮な水で二回するたびにこの手順を繰り返します。これは、表面から余分な染料を除去するのに役立ちます。 </li><li>穏やかに80℃で設定したオーブン°Cの撮像前に10分間でバイアルからスライドガラスを除去し、乾燥した。 </li></ol> 8。代表的な結果正しく官能フェアsは、光や蛍光顕微鏡を介して識別できます。表面機能化が正しく行われた場合の検出実験中に、その高感度を維持するために、官能基後の欠陥と汚染フリーのままとすれば、表面上のビオチン分子の均一緻密な取材と、表面になるはずです。光学顕微鏡は、蛍光顕微鏡は、表面被覆の品質と均一性を調べることができますが、後者をプローブに使用することができます。 図2では、我々は正しく官能微小球の例を示します。これらの画像は、官能基（ 図2a）に起因しない表面の損傷や汚染がないことを示し、ミクロスフェア表面にアミン基（ 図2b）またはビオチン基（ 図2c）のいずれかの均一な、一貫性のある範囲を示すことが。 ミクロスフェアは、正しく光マイクロイメージwiを官能されていない場合表面汚染、凝集または不均一なカバレッジ、および表面亀裂のような面で明らかな欠陥を、（ 図3）を示すでしょう。ここでは、表面に試薬の凝集に起因する表面汚染の一般的な例を参照してください。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3866/3866fig1.jpg" /> 図1シリカミクロスフェアの表面にプローブ分子を取り付けるための3ステップの反応スキームは<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3866/3866fig1large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3866/3866fig2.jpg" /> 図2シリカミクロスフェア。シリカ微小球の）光学顕微鏡写真は、酸素プラズマへの暴露を介してヒドロキシル基に移入し、b）シリカ微小球の蛍光顕微鏡写真は、一級アミン移入とFITC色素で標識された、シリカマイルのc）蛍光顕微鏡写真crosphereは、ビオチンが取り込まとテキサスレッド - アビジン複合体で標識された。 Soteropulos、CE、ハント、HK＆アルマーニから許可を得て転載、ウィスパリングギャラリーモードマイクロキャビティを用いた結合速度の測定です。APPL。 PHYS。 Lett 99、103703から103703（2011）。著作権2011年米国物理学会17 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3866/3866fig3.jpg" /> 図3。不適切な官能球の光学顕微鏡写真。ここでは、右上の表面にほこりを参照してください。と同様に、汚染表面をオフに延長することができます。さらに、光マイクロの右側には、表面に小さな窪みを示しています。

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</ol>

利害の衝突が宣言されません。

プロトコルに記載されているように、我々はこれによって官能化プロセス全体を通して茎シリカミクロスフェアを輸送するためにハウジングのプラットフォームを作成しました。このハウジング·プラットフォームは、官能化プロセス全体で使用される様々な容器の壁に接触するミクロスフェアに起因する表面の汚染や損傷に対する解決策として作成されました。私たちは常に官能プロセス中に別の容器に個々の微小球を着脱から生じた主な難しさを実現しました。それは茎の上に保持することによりピンセットでそれぞれ個別に移動するときにオブジェクトに対してミクロスフェアをブラッシングを避けるために大変でした。スライドガラス上の各微小球の位置を安定化させることにより、我々は、単にスライドガラスではなく、微小球の幹細胞を処理することにより、別のコンテナの中と外微小球の数を移動することができました。このように、我々はこれらのdevの多くを官能化することができました同時に氷、私たちは無傷で、官能ミクロスフェアの作成〜90％の成功率で、その結果、不適切な取り扱いによって汚染や表面の損傷を排除した。 プロトコルで述べたように、我々は、これによっ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>メタノール</td><td>フィッシャー</td><td> 67-56-1 </td><td> ACSグレード</td></tr><tr><td>硫酸</td><td>フィッシャー</td><td> 8014-95-7 </td><td>発煙</td></tr><tr><td>過酸化水素</td><td>フィッシャー</td><td> 7722-84-1 </td><td> 30重量％ </td></tr><tr><td>アミノプロピルトリメトキシシラン</td><td>フィッシャー</td><td> 13822-56-5 </td><td></td></tr><tr><td> NHS-ビオチンEZリンカ</td><td>ピアース</td><td> 20217 </td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド</td><td>フィッシャー</td><td> 67-68-5 </td><td>無水</td></tr><tr><td>フルオレセインイソチオシアネート</td><td>ピアース</td><td> 46425 </td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>フィッシャー</td><td> 7647-14-5 </td><td>粉は集中する</td></tr><tr><td>炭酸水素ナトリウム緩衝</td><td>フィッシャー</td><td> NC0099321 </td><td></td></tr><tr><td>テキサスレッド - アビジン結合物</td><td>ピアース</td><td> A820 </td><td></td></tr><tr><td>光ファイバ</td><td>ニューポート</td><td> F-SC </td><td></td></tr><tr><td>ファイバストリッパー</td><td>繊維機器の販売</td><td> NN-175 </td><td>ノーニク175 UMストリッパー</td></tr><tr><td>キムワイプ</td><td>フィッシャー</td><td> 06666A </td><td></td></tr><tr><td>ベアファイバカッタ</td><td> Ilsintech </td><td>その他のcl-03A </td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡用スライドガラス</td><td>フィッシャー</td><td> 12-550B </td><td></td></tr><tr><td>ポリプロピレンバイアル</td><td>フィッシャー</td><td> 03から341-75A </td><td> 60mLの、ヒンジキャップ</td></tr><tr><td>インキュベートロッカー</td><td&gt; VWR </td><td> 12620-910 </td><td></td></tr><tr><td>減圧デシケーター</td><td>フィッシャー</td><td> 08から594-15B </td><td></td></tr></tbody></table>

シランカップリング剤を用いた石英系光バイオセンサーへの生物学的プローブの取り付け

Attaching Biological Probes to Silica Optical Biosensors Using Silane Coupling Agents

このような人気のあるビアコアシステム（表面プラズモン共鳴（SPR）技術に基づいて）のような生物学的環境では、バイオセンサープラットフォームとのインタフェースするためには、例えば、表面の汚れを防ぐことができ、様々な表面改質技術、使用して、調整する表面の疎水性/親水性、電子、さまざまな環境に適応し、最も頻繁に、興味のある目標に向かって特異性を誘導する1-5これらの技術は、複雑な環境における実世界のアプリケーションに、それ以外の高感度バイオセンサーの機能を拡張し、そのような血液、尿、排水分析など。2,6-7は、ビアコアなどの商用バイオセンシング·プラットフォームは、よく理解しているが、そのような表面修飾を行うための標準技術は、これらの技術は他の標準化された方法で翻訳されていないラベルこのようなギャラリーモード（WGM）光共振器ウィスパリング、フリーバイオセンシングプラットフォーム、。8-9 &lt;<html> / P&gt; WGM光共振器は、超低濃度での種の様々な種類のラベルフリー検出を実行するための有望な技術を表す6,10-12これらのプラットフォームの高感度は、そのユニークな幾何光学の結果は以下の通りです。WGM光共振器に閉じ込め、循環特定の、積分の共振周波数での光SPRプラットフォームと同様13、光の場は完全にセンサーデバイスに限定されていませんが、evanesces、この&quot;エバネッセント尾&quot;はその後、周囲の環境中の化学種と相互作用することができる。この相互作用はわずかで、その結果、変更するには、光電界の実効屈折率を引き起こすが、検出可能な、デバイスの共振周波数にシフトします。光電界が循環するので、環境内の軽微な変更については、信号の固有の増幅をもたらし、環境を何度も対話し、非常に高い感度をすることができます。2,14-15 テント&quot;&gt; WGM光共振器は、いくつかのジオメトリで製造することができますが、複雑な環境で標的検出を実行するには、これらのプラットフォームは、表面改質を介してプローブ分子（結合対の通常の半分、例えば、抗体/抗原）2と組み合わせる必要がありますから材料系の様々なシリカミクロスフェアは、最も一般的です。これらのミクロスフェアは、一般的にマイクロスフェアの官能と検出の実験中に処理できるようにするための &quot;幹&quot;を提供する光ファイバの端に製造されています。シリカ表面の化学的性質は、5月それらの表面にプローブ分子を添付するために適用されるが、平面基板に生成された伝統的な技法は、これらの三次元構造のためにしばしば十分ではないとしてミクロスフェアの表面への変更（ほこり、汚れ、表面欠陥、ムラコーティング）それらの検出能力に深刻な、否定的な結果を持つことができます。ここでは、容易なアプローチを実証するシリカ表面にビオチンを付加することによって、無機表面と生物学的環境を埋めるためにシランカップリング剤を用いたシリカ微小球のWGM光共振器の表面機能化のために。8,16我々 は 、このレポートでセンサー·システムとしてのシリカ微小球のWGM共振器を使用していますが、プロトコルは一般的であり、ビオチンを持つシリカデバイスの表面を官能化することができます。

バイオセンサーは、複雑な生物学的環境とのインタフェースと表面改質を介してセンサに接続されている高度に特異的なプローブと高感度センサーを組み合わせることにより、ターゲットの検出を実行します。ここでは、センサと生物学的環境を埋めるためにシランカップリング剤を使用して、ビオチンを有するシリカ光センサーの表面官能基を示しています。

生物学的環境とのインターフェースを構築するために、広く普及しているBiacoreシステム（表面プラズモン共鳴（SPR）に基づく...）などのバイオセンサープラットフォームが用いられています。

本手順の全体的な目的は、デバイスの感度を低下させることなく、共有結合プロセスを通じてシリコマイクロ球光学共振器の表面をビオチンでコーティングすることである。これは3段階のプロセスによって達成される。まず、酸素プラズマまたはpihaエッチングによる水酸化を行い、続いて蒸着法によるslanカップリング剤のエマネーションを行う。その後、NHSエステル化学を用いて、ビオチンのバレリン側鎖を共振器表面の一次アミンに結合させることでビオチン化を行う。最終的に、この手法により、標的分子に対して高い感度と特異性を併せ持つ光学バイオセンサが作製されます。さらに、末端にアミノ基を持つシリカの蛍光標識や、アビジン-ビオチン複合体形成法を用いることで、幅広い潜在的ターゲットに対応したバイオセンサプラットフォームへと拡張することが可能です。物理吸着などの既存の表面機能化手法に対する本手法の主な利点は、プローブ分子が共有結合で固定されるため、センサの堅牢性と信頼性が向上することです。これにより、長期間の保存後でも使用可能であり、機能化後も高い感度を維持することができます。一般的に、この手法に不慣れな方は、機能化プロセスにおけるマイクロサイズデバイスの取り扱いの難しさから苦労することがあります。取り扱い技術が不十分であることは、センサーの光学性能を低下させ、センサー表面に汚染を発生させる最も簡単な要因となります。ハサミを使用して、厚さ1/4インチの段ボールを1インチ四方の正方形に切り出します。これを標準的なガラススライドにテープで固定し、丸めたスコッチテープの1インチ幅のセクションを段ボールに取り付けます。これにより、マイクロスフェアを周囲の環境から持ち上げて隔離できるプラットフォームが作成され、ハサミによる表面への損傷を防ぐことができます。スプールから光学ファイバーを3インチの長さで切り出します。次に、ノニックファイバーストリッパーを使用して、カットしたファイバー端の末端0.5インチから保護ポリマーコーティングを除去し、シリカコアのみを残します。メタノールで湿らせたキムワイプでファイバーを優しく拭き、表面に残ったポリマーを洗浄します。ベアファイバークリーバーを用いて、ストリップした端をトリミングし、ファイバー末端にストリップ部分が約1mmだけ残るようにします。光ファイバーのストリップした端を、垂直方向に注意しながら二酸化炭素レーザーの光路に配置します。ストリップした端が下を向くようにファイバーを調整します。二酸化炭素レーザーの電源を入れ、光ファイバーの被覆を除去した端面に照射します。約3.5%の出力で2秒間照射すると、レーザーによってファイバーの端面が融解し、球状になります。ピンセットを用いて、マイクロスフィアのステム部分を慎重に把持します。ステムをマイクロスフェアハウジング上のテープロールに固定します。ガラススライドはペトリ皿に保管でき、これによりマイクロスフェアをヒンジキャップ付きの60 milliliterポリプロピレン製バイアルに安全に保管することが可能です。バイアルに3 millilitersの過酸化水素を加え、続いて7 millilitersの発煙硫酸を加えることでピラニア溶液を調製します。少なくとも1つのマイクロスフェアを保持しているガラススライドをバイアルに移します。マイクロスフェアが液体に接している必要がありますが、液体がカードボードに触れないようにしてください。必要に応じて、溶液の量を調整します。球体をピラニア溶液に15分間浸した後、ガラススライドをバイアルからゆっくりと取り出し、脱イオン蒸留水が入った別のプラスチックバイアルに入れます。バイアルを傾斜トレイに置き、角度5度、傾斜速度5 RPMで5分間処理します。ガラススライドをバイアルからゆっくりと取り出し、80 °Cのオーブンに10分間入れます。表面を乾燥させるため、少なくとも1つのマイクロスフェアを含むガラススライドを真空デシケーターに入れます。カップリング剤（A-P-T-M-Sなど）のボトルを開け、開いた状態のボトルをデシケーター内に配置します。真空デシケーターの蓋を閉め、排気口をアスピレーターまたは施設内の真空ラインに接続します。ハウス真空ポンプ、真空ポンプ、または水ラインをオンにし、真空デシケーター内を排気します。蓋とベースの間に真空シールが形成されたら、反応の計時を開始します。これにより、シランカップリング剤が薄膜として表面に堆積します。15分後、真空ポンプを停止し、ポートをゆっくりと開いてデシケーター内に空気を導入します。このカップリング剤の場合、表面に均一な単分子層を形成するには15分で十分ですが、他のカップリング剤では時間を調整する必要がある場合があります。ビオチンを結合させる約1時間前に、ヒンジ付きキャップ付きの60 milliliterポリプロピレンバイアルを用いて、無水ジメチルスルホキシド中での10 millimolar N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）ビオチン溶液を調製します。このプロトコルで最も困難な点は、成功を確実にするためにマイクロスフィアを適切に扱い、球体表面の汚染を防ぐことです。球体を保持するためのスライド装置を作製することに加え、表面に残った粒子を分散させるために、あらかじめビオチン溶液に超音波処理を施します。溶媒にNHSビオチン粉末を完全に溶解させるため、溶液を1時間超音波処理してください。マイクロスフェアが載ったガラススライドを別のプラスチック製バイアルに移し、マイクロスフェアがバイアルの底に、スライドのステム部分がバイアルの上側にくるように配置します。プラスチック製ピペットを用い、バイアルにNHSビオチン溶液を適切な量分注します。この際、溶液がマイクロスフェアに直接触れないよう、ガラススライドの後方のバイアル壁面を伝わせるように滴下してください。マイクロスフェアの表面が完全に浸るまで十分な量の溶液を加えます。MICROSPHERE、NHSビオチン、およびDMSO溶液が入ったバイアルをロッキングインキュベーターに設置し、室温で30分間、速度5 RPM、傾斜角5度で振盪させます。バイアルからガラススライドを慎重に取り出し、脱イオン蒸留水で満たした別のバイアルへ静かにスライドさせます。そのバイアルを傾斜トレイに置き、同じ速度と傾斜角でさらに10分間振盪させます。前述と同様に、毎回新しい水を用いてこのステップを2回繰り返します。これにより、表面から過剰なDMSOが除去され、表面に実際にグラフトされなかった物理吸着したビオチンが取り除かれます。バイアルからガラススライドを取り出し、80 °Cのオーブンに10分間、または表面からすべての水滴が消失するまで置きます。プロトコルに従い、末端が修飾されたシリカの蛍光標識を行い、蛍光標識化したビオチン末端シリカを調製します。まず、リン酸緩衝生理食塩水を用いて 10 µg/mL の Texas Red Aden 溶液を調製します。溶液をヒンジキャップ付きの60 milliliterポリプロピレン製バイアルに加え、ビオチン末端化マイクロスフィアが載ったガラススライドを、マイクロスフィアが溶液にちょうど浸かるようにゆっくりと滑り込ませます。その後、バイアルをアルミホイルで包み、室温・暗所で30分間反応させます。その後、PBSバッファーでマイクロスフィアを10分間のすすぎで2回洗浄し、過剰なfluoro fourを除去します。前述と同様に、60 mLのポリプロピレン製バイアルにバッファーを満たし、ガラススライドを溶液中にゆっくりと移します。その際、溶液がマイクロスフィアのみを覆い、カードボードハウジングにはかからないように注意してください。バイアルをアルミホイルで覆い、傾斜角度5度、回転数5 RPMに設定したティルトトレーに置き、10分間処理します。バイアルからガラススライドを慎重に取り出し、脱イオン蒸留水で満たしアルミホイルで覆った別のバイアルの中にゆっくりとスライドさせます。同じ速度と傾斜角度のティルトトレーにバイアルを置き、さらに10分間処理します。この工程を、毎回新しい水を用いて2回繰り返します。これにより、表面の余分な染料を除去できます。最終工程として、通常はバイアルからガラススライドを取り出し、イメージング前に80 °Cに設定したオーブンで10分間乾燥させます。表面機能化が正しく行われていれば、蛍光顕微鏡で観察した際に、表面にビオチン分子が均一に高密度で被覆されているはずです。さらに、高い感度を維持するためには、機能化後も表面に欠陥や汚染物質がない状態である必要があります。ここでは、光学顕微鏡で視覚化した検出実験における、正しく機能化されたマイクロスフィアの例を示します。これらの画像は、機能化による表面の損傷や汚染がなく、マイクロスフィアの表面がアミン基またはビオチン基で均一に被覆されていることを示しています。マイクロスフィアの機能化が正しく行われていない場合、光学マイクロスフィアの画像には、表面汚染、凝集、被覆の不均一性、あるいは表面の亀裂などの明らかな欠陥が現れます。ここに示されている例は、表面での試薬の凝集に起因する表面汚染の一般的な例です。このビデオを視聴することで、あらゆるシリカ光学共振器の表面をビオチンで機能化する方法について十分に理解できたはずです。本手法はシリカデバイス全般に適用可能な汎用的な手法であるため、多種多様なシリカセンサプラットフォームに幅広く応用できるはずです。この技術の開発を通じて、バイオフォトニクスの分野の研究者は、高感度かつ高特異的なバイオセンサプラットフォームを構築するための新しい手法や、新しいプローブセンサの組み合わせをより容易に探索できるようになるでしょう。

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