定量的リアルタイムPCR（定量PCR）による前立腺腫瘍におけるマイクロRNAの検出

本実験の目的は、定量リアルタイムPCRを用いて、前立腺がん組織および正常前立腺組織におけるマイクロRNA分子の発現レベルを定量化することです。まず、前立腺組織から全RNAを抽出することでこれを達成します。これには、miRNA、マイクロRNA、およびその他の低分子RNAが含まれます。

次に、RNAを逆転写してcDNAを生成します。その後、このcDNAを鋳型としてSYBR Greenを用いたリアルタイムPCRを行い、マイクロRNAの発現をリアルタイムで増幅および定量します。これにより、定量リアルタイムPCRに基づく、さまざまな前立腺サンプルにおけるマイクロRNAの相対的発現量が得られます。

他の手法と比較した本手法の主な利点は、感度、精度、再現性に優れているだけでなく、迅速かつ費用対効果が高いことです。microRNAの発現は、がん化プロセスに深く関与する遺伝子と相関することが多いため、本手法はがん生物学分野における重要な課題の解明に利用できます。したがって、QPCRを用いてmicroRNAの発現を評価し、それが臨床的変数とどのように相関するかを確認することが可能です。

これらのバイオマーカーは、診断および予後予測の両方のツールとして利用できる可能性があります。これらは前立腺がんの診断に役立つだけでなく、どの前立腺がんが浸潤性の高いものであるかを判断するのに役立つと考えられます。さらに、これらのバイオマーカーが治療薬となる可能性もあります。

本手法は前立腺腫瘍の発生に関する洞察を提供できるだけでなく、他の癌や疾患にも適用可能です。切除時に前立腺サンプルを採取し、解剖学的指標を用いて検体の向きを決定します。前立腺と精嚢を、右側を緑色、左側を青色として次のように染色します。

直腸表面に垂直に組織の横断正中面をランダムに採取し、サンプルを凍結して-80°Cで保存します。コピーを取り、標本の切片の方向を揃えて4等分します。病理医に相談し、対応する画像上で腫瘍領域と正常領域を特定します。

RNAを抽出して単離するために、標記された領域をガイドとして腫瘍組織を特定します。まず、凍結した前立腺サンプルをドライアイス上に置き、指定されたコピーを参照します。前立腺腫瘍の小さな一部を切り出します。

前立腺腫瘍組織を1 mLのtriol試薬中でホモジナイズします。ホモジナイズしたサンプルを5分間インキュベートします。室温で、サンプルに0.2 mLのクロロホルムを加え、15秒間激しく振盪します。

サンプルを室温で3分間インキュベートし、次いで4°Cで12,000 ×gにて15分間遠心分離します。無色の上層水相を新しいチューブに回収し、0.5 mLのイソプロピルアルコールを加えます。サンプルを室温で10分間インキュベートし、次いで4°Cで12,000 ×gにて10分間遠心分離します。

RNAを含むペレットを乱さないように、上清を注意深く吸引します。75% ethanolを1 mL加え、RNAペレットをボルテックスした後、4 °Cで7,500 ×gにて5分間遠心分離し、沈殿させます。再度、上清を吸引し、RNAペレットを5〜10分間乾燥させます。この際、完全に乾燥させないように注意してください。

ペレットをヌクレアーゼフリー水に溶解し、分光光度計を用いてRNA濃度を測定します。バイオアナライザーを使用して、RNAサンプルの品質と完全性を確認します。メーカーの指示に従い、逆転写キットを用いてRNAをcDNAに逆転写します。

標準曲線を作成するために、目的遺伝子が十分に発現していることが分かっているサンプルから、元のCD NAの一連の希釈系列を調製します。20 µLの反応量に基づき、2 x quant. Detect cyber green PCR master mix、10 x microscript universal primer、10 x microscript primer assay、およびRN a's free waterを用いてマスターミックスを調製し、リアルタイムPCRを実施します。

標的遺伝子用と、今回のリファレンス遺伝子であるRNU six B用の2組のプライマーを用意します。各cDNA希釈液を2 µLずつ個別のライトサイクラー用キャピラリーチューブに分注し、マスターミックスを18 µL加えます。キャピラリーアダプターを使用して遠心分離します。キャピラリーをキャピラリーベースのリアルタイムPCR装置にセットし、以下のPCRプログラムで実行します。95 °Cで15分間加熱し、続いて94 °Cで15秒間のサイクルを50回繰り返します。

55 °Cで30秒間、および70 °Cで30秒間加熱します。キャリブレーターとして使用するサンプルを選択し、その正規化目標量を1に設定します。他のすべてのサンプルにおけるmicro RNAの相対的な発現量をキャリブレーターと比較し、増幅曲線を作成します。

PCR反応には、molecular biochemicals light cyclerソフトウェアバージョン3.5の定量化（quantification）タブを使用します。反応を定量し、データをテキストファイルにエクスポートしてください。その後、データをREL quant解析ソフトウェアにインポートし、定量結果を算出します。

標的遺伝子、参照遺伝子、および標準曲線のデータの別々のファイルをインポートします。標的遺伝子と参照遺伝子の両方についてキャリブレーターの位置を指定し、サンプルの位置も指定します。データは、各サンプルの標的遺伝子対参照遺伝子の比を、キャリブレーターの標的遺伝子対参照遺伝子の比で除した値として算出されます。

特定のmicro RNAおよびハウスキーピング遺伝子について以前に作成した標準曲線を用い、濃度が未知のmicro RNA標的の定量データを外挿するための参照標準として使用します。3つのサンプルを1つのグループとして解析し、トリプリケート（3連）の平均濃度および標準偏差を算出します。

3連系（トリプリケート）のうち1つが他のセットと不一致である場合、プログラムによって除外されます。ここでは、前立腺サンプルのA-Q-P-C-R分析の例を示します。リファレンス遺伝子U sixの発現レベルを示すグラフでは、約20サイクルで指数増幅が始まっており、一方でターゲット遺伝子MIR 98の発現は25サイクル付近で増幅の遅延が見られました。

本実験のデータはテキストファイルとしてエクスポートされ、解析ソフトウェアを用いて分析されました。キャリブレーターおよびサンプルを含むキャピラリーの位置を指定します。この手法に習熟すれば、適切に実施することで1日で完了させることが可能です。本手法の信頼性はRNAの品質に依存します。

したがって、RNAは非常に分解されやすいため、取り扱いには細心の注意を払うことが重要です。