Name: 定量的リアルタイムPCR（定量PCR）による前立腺腫瘍におけるマイクロRNAの検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: 学ぶ 定量リアルタイムPCRによる前立腺がん組織におけるマイクロRNA発現の定量解析法。RNA抽出、逆転写、cDNA合成、サイバーグリーン蛍光法を用いて、がんと正常組織のmiRNA発現差を高感度に検出し、バイオマーカーとしての可能性を評価する。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この作品は、カナダの癌協会研究所、助成金なしで資金を供給された。 019038。

<html> 1。前立腺のサンプルコレクション<ol><li>前立腺全摘除術時の前立腺のサンプルを収集します。標本は解剖学的ランドマークを用いて配向されている。前立腺と精嚢は、次のように描かれています。右側の緑、左側の青。 </li><li>前立腺のランダムな横方向の中央部には、直腸表面に垂直に撮影し、液体窒素中で凍結し、-80°C 9で保存されています。 </li><li>検体のバンクスライスは、複写指向（、前方後方、右と左）、quadrisectedです。セクションは、クライオスタットを用いてカットされます。 </li><li>セクションは、H＆Eで染色し、染色したスライドとそれに対応する画像上の腫瘍対正常な領域を決定し、記述するために病理学者によって検討されています。マークされた領域は、RNAは、以降の手順で抽出され、そこから腫瘍組織を抽出する領域を示すためのガイドとして使用されます。 </li></ol>&quot;ブレーク&gt; 2。サンプルからmiRNAを含むトータルRNAを単離<ol><li>ドライアイスと線引きコピーを参照の上に置いて凍結前立腺サンプルは、前立腺腫瘍のごく一部（50〜100mgの間）に切り取る。 </li><li> TRIzol試薬1mLに前立腺腫瘍組織をホモジナイズする。次の手順で数量がTRIzol試薬を1mLの使用に基づいています。 </li></ol>注：ここでは、RNAを抽出するためのTRIzol試薬を使用している、小さなRNAを含むトータルRNAを分離するが、他のキットを使用することもできます。 <ol start="3"><li>室温で5分間均質化し、サンプルをインキュベートします。 </li><li>サンプルにクロロホルム0.2 mLを加え、15秒間激しく振る。室温で3分間サンプルをインキュベートし、4℃で15分間12,000 xgで遠心分離℃、 </li><li>新鮮なチューブに無色の上部の水相を転送し、イソプロピルアルコール0.5mLを追加します。室温で10分間サンプルをインキュベートし、4℃で10分間12,000 xgで遠心分離℃、 </li><li> RNAを含有するペレットを乱すことなく、上清を注意深く吸引除去する。 75％エタノール1mLをRNAペレットを洗浄します。渦4で7500 xgで5分間遠心分離による試料と再堆積℃に</li><li>慎重に上清を吸引し、RNAペレットが完全に乾いていないことを確認し、5〜10分間RNAペレットを乾燥させます。ペレットのサイズに適切なヌクレアーゼフリー水に再溶解する。光度計1000分光光度計（260 nmと280 nmにおける吸光度を測定して）を使用してRNAの濃度を測定します。 </li><li>アジレントバイオアナライザを用いたRNAサンプルの品質と整合性を確認します。 </li></ol> 3。 RNAの逆転写<ol><li> RNAの逆転写は、メーカーの指示（キアゲン社）によるとmiScript逆転写キットを用いて行った。このキットには含まれています転写酵素およびポリ（A）ポリメラーゼを逆にしてください。 miScript RTバッファーは、Mg 2 +、dNTPを、oligo-dTプライマー、ランダムプライマーが含まれています。 </li><li> cDNAを合成するために10 pgのRNAの1μgの間に使用します。 RNAの1以上のμgを使用している場合は、適切なボリュームに直線的に反応をスケールアップ。 </li><li> 20μlの最終容量に反応をもたらすために5X miScript RTバッファー（4μl）を、miScript逆転写ミックス（1μL）、およびRNaseフリー水を含むマスターミックスを調製する。また、マスターミックスのテンプレートRNA（最大1μg）を含む。 </li><li> 37℃で60分間サンプルをインキュベート°C、95℃で5分間インキュベートした直後にこのステップは、ブロックまたは水浴を加熱し、PCRマシンで実行することができます。サーモは、最も適切かつ正確な方法があります。短期的に氷の上にcDNAを保存し、-20℃、長期保存用。 </li></ol> 4。検量線を作成する<ol><li> exper前にターゲットのmiRNAとiment、標準曲線は、そのクロッシングポイント（CP）（ 図2）に対して、既知濃度のcDNAを使用して生成されます。 </li><li> 2倍、10倍、50倍、250倍、1250倍の希釈液、目的の遺伝子の実質的な発現を有することが知られているサンプルの元のcDNAのシリーズを準備します。 </li><li>第5章 &quot;miRNAを検出するためのリアルタイムPCR&quot;で指定されたcDNAは、段階希釈しない静的な40倍希釈であることを修正して、PCRを実行します。 </li><li>あなたの標準曲線を生成するためにRelQuantソフトウェア（Roche）を用いて分析を実行します。 </li></ol>注：新しい標準曲線は、目的の各遺伝子を生成する必要があります。 5。 miRNAの検出のためのリアルタイムPCR <ol><li> miRNAのリアルタイムPCRは、メーカーの指示（キアゲン社）によるとmiScript SYBRグリーンPCR KitおよびmiScriptのPrimer Assayを用いて行った。を含むマスターミックスを調製2倍のQuantiTect SYBRグリーンPCRマスターミックス、10倍miScriptユニバーサルプライマー、10倍miScriptプライマーアッセイ、およびRNaseフリー水。 20μlの体積反応用のマスターミックスを調製する。 </li><li>プライマーアッセイは、興味のmiRNAに特異的である。再構成する10倍miScriptプライマーアッセイに、簡単にバイアルを遠心し、550μlのTEバッファー（pH 8.0）を追加します。 -20℃でボルテックス混合するために一時的にバイアル、小さいボリュームにアリコートプライマー、およびストア2つのプライマーを必要とされています。標的遺伝子とリファレンス遺伝子用のプライマーRNU6Bは、リファレンス遺伝子usedasです。 </li><li> -20℃でのcDNA 40倍と店舗余分なアリコートを希釈する</li><li> cDNAは、PCRのテンプレートとして機能します。 40倍希釈したcDNA2μlのを使用し、20μlのライトサイクラーキャピラリー（ロシュ）に分配する。 </li><li>各キャピラリーにマスターミックス18μlを追加し、キャピラリアダプタを使用して遠心します。 </li><li>そのようなサイクラー3のようなキャピラリーベースのリアルタイム·サイクラーに毛細血管を配置します。32キャピラリーカルーセル形式で5リアルタイムPCRシステム。 </li><li>次のようにPCRサイクリング·プログラムを実行します。 2倍のQuantiTect SYBRグリーンPCRマスターミックスでHotStarTaq Polymeraseを有効にするには、95℃でプレインキュベート15分間°C。 の50サイクルが続いています。 変性、15秒、94°C; アニーリング、30秒、55°C; 拡張子、30秒、70℃ </li><li>キャリブレーターになるサンプルを選択し、1に正規化され、その目標額を設定します。キャリブレータを他のすべてのサンプル中のmiRNAの相対的発現を比較します。 </li></ol>注：研究の中では、同じキャリブレーションサンプルは、結果の一貫性を維持するために使用されるべきである。 6。データの分析<ol><li> PCR反応の増幅曲線は、分子生化学のライトサイクラーソフトウェアバージョン3.5（ロシュ社）はグラフと数値で示されている。 、 &quot;定量化&quot;タブで反応を定量化するndはテキストフ​​ァイルにデータをエクスポートします。 </li><li>定量結果を生成するためにRelQuant解析ソフトウェア（ロシュ）にデータをインポートします。標的遺伝子、リファレンス遺伝子、および検量線のデータに別々のファイルをインポートします。 </li><li>ターゲットとリファレンス遺伝子の両方のキャリブレータの位置を指定します。また、サンプルの位置を指定します。データは、キャリブレータの比率を参照するには、ターゲットで割った値の異なるサンプルの比率を参照するターゲットとして表されます。以前に特定のmiRNAとハウスキーピング遺伝子用に生成された標準曲線は、未知の濃度のmiRNAのターゲットの定量的なデータを外挿するための参照標準として使用されます。 </li><li>三は、サンプルの複製され、グループとして分析し、濃度と三重の標準偏差が計算されることを意味しています。三連の1セットの残りの部分と矛盾している場合は、プログラムによって除外されます。 </li></ol> 7。代表的な結果 &lt;pのクラス= &quot;jove_content&quot;&gt;前立腺サンプルのqPCR解析の例を図3に示されています。結果はグラフィカルにだけでなく、数値的に描かれています。標的遺伝子は、miR-98の発現は約25℃のサイクル遅延増幅を示したリファレンス遺伝子の発現レベルを示すグラフ、U6は、周期約20℃で指数関数的増幅を開始します。この実験から得られたデータはテキストフ​​ァイルとしてエクスポートし、RelQuant解析ソフトウェアで解析した。キャリブレータとサンプルを含む毛細血管の位置が指定されています。 図4は、キャリブレータを1に設定し、校正器に対する相対他のサンプルの発現方法を示します。 <img src="/files/ftp_upload/3874/3874fig1.jpg" alt="図1"/> 図1。miScript逆転写反応とリアルタイムPCRの様々な手順を実行します。 <img src="/files/ftp_upload/3874/3874fig2.jpg" alt="図2"/> 図2標準曲線は、2倍、10倍、50倍、250倍、1250倍オリジナルのcDNAサンプルの希釈系列を使用して生成されます。 <img src="/files/ftp_upload/3874/3874fig3.jpg" alt="図3"/> 図3。ロシュ·ダイアグノスティックスのライトサイクラーソフトウェアは、グラフィカルとテキストによる実験の全体の情報が表示されます。定量的リアルタイムPCR増幅プロットは、異なるサンプルからの蛍光の増加を示しています。 <img src="/files/ftp_upload/3874/3874fig4.jpg" alt="図4"/> 図4のデータは、RelQuantライトサイクラー解析ソフトウェアを用いて定量した。通常は、3つのグループとして分析され、明確に矛盾した結果を生成するサンプルを除外し、三重の濃度と標準偏差が計算されることを意味されるサンプルのレプリケートされます。

<ol><li>Reinhart, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs in plants.</a> Genes Dev. 16, 1616-1616 (2002).</li>
<li>Xu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+microRNA+Mir-14+suppresses+cell+death+and+is+required+for+normal+fat+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Drosophila microRNA Mir-14 suppresses cell death and is required for normal fat metabolism.</a> Curr. Biol. 13, 790(2003).</li>
<li>Bueno, M. J., Perez, deC. astro, I,, Malumbres, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cell+proliferation+pathways+by+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Control of cell proliferation pathways by microRNAs.</a> Cell Cycle. 7, 3143-3143 (2008).</li>
<li>Friedman, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Most+mammalian+mRNAs+are+conserved+targets+of+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs.</a> Genome Res. 19, 92(2009).</li>
<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+genomics%2C+biogenesis%2C+mechanism%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116, 281-281 (2004).</li>
<li>Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+and+consequences+of+microRNA+dysregulation+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Causes and consequences of microRNA dysregulation in cancer.</a> Nat. Rev. Genet. 10, 704(2009).</li>
<li>Coppola, V., De, M. R., Bonci, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+and+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr.+Relat.+Cancer%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs and prostate cancer.</a> Endocr. Relat. Cancer. 17, 1-1 (2010).</li>
<li>Gordanpour, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-221+Is+down-regulated+in+TMPRSS2%3AERG+fusion-positive+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">miR-221 Is down-regulated in TMPRSS2:ERG fusion-positive prostate cancer.</a> Anticancer Res. 31, 403-403 (2011).</li>
<li>Nam, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+TMPRSS2%3AERG+fusion+gene+predicts+cancer+recurrence+after+surgery+for+localised+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Expression of the TMPRSS2:ERG fusion gene predicts cancer recurrence after surgery for localised prostate cancer.</a> Br. J. Cancer. 97, 1690(2007).</li>
<li>Ambs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+profiling+of+microRNA+and+messenger+RNA+reveals+deregulated+microRNA+expression+in+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer.</a> Cancer Res. 68, 6162(2008).</li>
<li>Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microRNA+miR-34a+inhibits+prostate+cancer+stem+cells+and+metastasis+by+directly+repressing+CD44%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">The microRNA miR-34a inhibits prostate cancer stem cells and metastasis by directly repressing CD44.</a> Nat. Med. 17, 211(2011).</li>
</ol>

利害の衝突が宣言されません。

正常組織10に比較した場合、いくつかのmiRNAの異常な表現が一貫して前立腺腫瘍で発見されており、これらのmiRNAのいくつかは、前立腺癌11に対する潜在的な新規治療薬として名指しされている。したがって、miRNAの異常な発現レベルは、有用な診断および/または予後バイオマーカーにすることができます。ここで紹介するリアルタイム定量PCR手法は、前立腺腫瘍組織におけるmiRNAレベルの正確な定量化のためのアッセイを提供する。使用miScript PCRシステムは、成熟miRNAの間に一塩基の違いを検出することができます。 miScriptのmiRNA qPCRアッセイは、しかし、異なるmiScript前駆体アッセイが利用可能なステムループ前駆体のmiRNAの検出を目的としていません。 この手法の信頼性は、濃度、整合性のため、入力RNAの品質に依存し、RNAの純度は、Real-Time PCRの前にテストする必要があります。また、リボヌクレアーゼは非常にstablです。eと容易にRNAを分解するには、このように特別な注意は、RNAの取り扱いに注...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> TRIzol試薬</td><td>インビトロジェン</td><td> 15596 </td></tr><tr><td> miScript逆転写キット</td><td>キアゲン</td><td> 218061 </td></tr><tr><td> miScriptプライマーアッセイ</td><td>キアゲン</td><td>特定の実験</td></tr><tr><td> miScript SYBRグリーンPCRキット</td><td>キアゲン</td><td> 218073 </td></tr><tr><td>ライトサイクラー3.5リアルタイムPCRシステム</td><td>ロシュ社</td><td></td></tr><tr><td>ライトサイクラーキャピラリー</td><td>ロシュ社</td><td> 04929292001 </td></tr><tr><td>光度計1000分光光度計</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> 2538 </td></tr><tr><td> Agilent 2100バイオアナライザ</td><td> G2943CA </td><td></td></tr></tbody></table>

定量的リアルタイムpcr（定量pcr）による前立腺腫瘍におけるマイクロrnaの検出

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

マイクロRNA（miRNA）は、一本鎖、18から24ヌクレオチド長、非コーディングRNA分子である。彼らは、開発1、アポトーシス2、および細胞周期の調節3を含むほぼすべての細胞プロセスに関与している。 miRNAはそのターゲットメッセンジャーRNA（mRNA）5に結合することにより、ヒト遺伝子の30％〜90％4の発現を調節すると推定されている。 miRNAの広範囲の調節不全は、様々な疾患や癌のサブタイプ6で報告されています。その有病率とユニークな構造により、これらの小分子は、バイオマーカー、治療薬および/またはターゲットの次の世代になる可能性があります。 miRNAの発現を調べるために使われるメソッドは、SYBR Green I色素をベースと同様のTaqManプローブベース定量PCRが含まれています。 miRNAが効率的に臨床の現場で使用する場合は、それが新鮮な、そして/または、アーカイブされた臨床検体での検出は、正確な再現性、およびspであることが不可欠であるecific。定量PCRは、広くこのようなマイクロアレイ研究7などの全ゲノム解析におけるmiRNAの発現を検証するために使用されています。このプロトコルで使用されているサンプルは、臨床的限局性前立腺癌に対する根治的前立腺摘除術を施行した患者からのものであった。しかし、他の組織や細胞株は、切除した後に液体窒素で瞬間凍結した前立腺標本インチ置換することができます。臨床的変数とそれぞれの患者のフォローアップ情報は、その後の分析8に収集した。 前立腺腫瘍サンプル中のmiRNAレベルの定量化 。腫瘍の定量PCR解析の主な手順は次のとおりです。トータルRNA抽出、cDNA合成、およびmiRNA特異的プライマーを用いた定量PCR産物の検出。 mRNAは、miRNAの、および他のsmall RNAを含むトータルRNAは、TRIzol試薬を用いて検体から抽出した。キアゲンのmiScriptシステムはcDNAを合成し、定量PCR（ 図1）を実行するために使用されていました。内因性miRNAはPOではありません逆転写の過程で、したがって、lyadenylated、ポリ（A）ポリメラーゼがmiRNAをpolyadenylates。 miRNAはオリゴdTと逆転写酵素を用いてcDNAを合成するためのテンプレートとして使用されています。 oligo-dTプライマーの5 &#39;末端に普遍的なタグ配列は、PCRのステップでcDNAの増幅を容易にします。 PCR産物の増幅は、SYBRグリーン、二本鎖DNAにインターカレート色素が発する蛍光のレベルで検出されます。ユニバーサルタグ配列に結合するユニバーサルプライマーと一緒に特定のmiRNAのプライマーは、特定のmiRNAの配列を増幅します。 miScriptプライマーアッセイは、千以上の人間に固有のmiRNA、およびマウス固有のmiRNAの何百もご利用いただけます。相対定量法はmiRNAの発現を定量化するためにここで使用されていました。異なるサンプル間のばらつきを補正するために、ターゲットのmiRNAの発現レベルは、基準遺伝子の発現レベルに正規化されています。 GEの選択ターゲットの表現を正規化するのNEは、分析の相対定量法では非常に重要です。彼らは安定してほとんどのサンプルを越えて発現していることが考えられているとして、通常、この容量で使用されているリファレンス遺伝子の例としては、RNU6B、RNU44、とRNU48の小さなRNAである。このプロトコルでは、RNU6Bを参照遺伝子として使用されます。

定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（定量PCR）は、腫瘍サンプル中の様々なマイクロRNA（miRNA）分子の発現レベルを調査するために迅速かつ高感度な方法です。異なるmiRNA分子の何百ものこのメソッド式を使用して、増幅定量化し、同じcDNAをテンプレートから分析することができます。

定量的リアルタイムPCR（定量PCR）による前立腺腫瘍におけるマイクロRNAの検出

マイクロRNA（miRNA）は、18～24ヌクレオチドの長さを持つ単鎖の非コードRNA分子である。これらは、事実上あらゆる細胞プロセスに関与しており……

本実験の目的は、定量リアルタイムPCRを用いて、前立腺がん組織および正常前立腺組織におけるマイクロRNA分子の発現レベルを定量化することです。まず、前立腺組織から全RNAを抽出することでこれを達成します。これには、miRNA、マイクロRNA、およびその他の低分子RNAが含まれます。次に、RNAを逆転写してcDNAを生成します。その後、このcDNAを鋳型としてSYBR Greenを用いたリアルタイムPCRを行い、マイクロRNAの発現をリアルタイムで増幅および定量します。これにより、定量リアルタイムPCRに基づく、さまざまな前立腺サンプルにおけるマイクロRNAの相対的発現量が得られます。他の手法と比較した本手法の主な利点は、感度、精度、再現性に優れているだけでなく、迅速かつ費用対効果が高いことです。microRNAの発現は、がん化プロセスに深く関与する遺伝子と相関することが多いため、本手法はがん生物学分野における重要な課題の解明に利用できます。したがって、QPCRを用いてmicroRNAの発現を評価し、それが臨床的変数とどのように相関するかを確認することが可能です。これらのバイオマーカーは、診断および予後予測の両方のツールとして利用できる可能性があります。これらは前立腺がんの診断に役立つだけでなく、どの前立腺がんが浸潤性の高いものであるかを判断するのに役立つと考えられます。さらに、これらのバイオマーカーが治療薬となる可能性もあります。本手法は前立腺腫瘍の発生に関する洞察を提供できるだけでなく、他の癌や疾患にも適用可能です。切除時に前立腺サンプルを採取し、解剖学的指標を用いて検体の向きを決定します。前立腺と精嚢を、右側を緑色、左側を青色として次のように染色します。直腸表面に垂直に組織の横断正中面をランダムに採取し、サンプルを凍結して-80°Cで保存します。コピーを取り、標本の切片の方向を揃えて4等分します。病理医に相談し、対応する画像上で腫瘍領域と正常領域を特定します。RNAを抽出して単離するために、標記された領域をガイドとして腫瘍組織を特定します。まず、凍結した前立腺サンプルをドライアイス上に置き、指定されたコピーを参照します。前立腺腫瘍の小さな一部を切り出します。前立腺腫瘍組織を1 mLのtriol試薬中でホモジナイズします。ホモジナイズしたサンプルを5分間インキュベートします。室温で、サンプルに0.2 mLのクロロホルムを加え、15秒間激しく振盪します。サンプルを室温で3分間インキュベートし、次いで4°Cで12,000 ×gにて15分間遠心分離します。無色の上層水相を新しいチューブに回収し、0.5 mLのイソプロピルアルコールを加えます。サンプルを室温で10分間インキュベートし、次いで4°Cで12,000 ×gにて10分間遠心分離します。RNAを含むペレットを乱さないように、上清を注意深く吸引します。75% ethanolを1 mL加え、RNAペレットをボルテックスした後、4 °Cで7,500 ×gにて5分間遠心分離し、沈殿させます。再度、上清を吸引し、RNAペレットを5〜10分間乾燥させます。この際、完全に乾燥させないように注意してください。ペレットをヌクレアーゼフリー水に溶解し、分光光度計を用いてRNA濃度を測定します。バイオアナライザーを使用して、RNAサンプルの品質と完全性を確認します。メーカーの指示に従い、逆転写キットを用いてRNAをcDNAに逆転写します。標準曲線を作成するために、目的遺伝子が十分に発現していることが分かっているサンプルから、元のCD NAの一連の希釈系列を調製します。20 µLの反応量に基づき、2 x quant. Detect cyber green PCR master mix、10 x microscript universal primer、10 x microscript primer assay、およびRN a's free waterを用いてマスターミックスを調製し、リアルタイムPCRを実施します。標的遺伝子用と、今回のリファレンス遺伝子であるRNU six B用の2組のプライマーを用意します。各cDNA希釈液を2 µLずつ個別のライトサイクラー用キャピラリーチューブに分注し、マスターミックスを18 µL加えます。キャピラリーアダプターを使用して遠心分離します。キャピラリーをキャピラリーベースのリアルタイムPCR装置にセットし、以下のPCRプログラムで実行します。95 °Cで15分間加熱し、続いて94 °Cで15秒間のサイクルを50回繰り返します。55 °Cで30秒間、および70 °Cで30秒間加熱します。キャリブレーターとして使用するサンプルを選択し、その正規化目標量を1に設定します。他のすべてのサンプルにおけるmicro RNAの相対的な発現量をキャリブレーターと比較し、増幅曲線を作成します。PCR反応には、molecular biochemicals light cyclerソフトウェアバージョン3.5の定量化（quantification）タブを使用します。反応を定量し、データをテキストファイルにエクスポートしてください。その後、データをREL quant解析ソフトウェアにインポートし、定量結果を算出します。標的遺伝子、参照遺伝子、および標準曲線のデータの別々のファイルをインポートします。標的遺伝子と参照遺伝子の両方についてキャリブレーターの位置を指定し、サンプルの位置も指定します。データは、各サンプルの標的遺伝子対参照遺伝子の比を、キャリブレーターの標的遺伝子対参照遺伝子の比で除した値として算出されます。特定のmicro RNAおよびハウスキーピング遺伝子について以前に作成した標準曲線を用い、濃度が未知のmicro RNA標的の定量データを外挿するための参照標準として使用します。3つのサンプルを1つのグループとして解析し、トリプリケート（3連）の平均濃度および標準偏差を算出します。3連系（トリプリケート）のうち1つが他のセットと不一致である場合、プログラムによって除外されます。ここでは、前立腺サンプルのA-Q-P-C-R分析の例を示します。リファレンス遺伝子U sixの発現レベルを示すグラフでは、約20サイクルで指数増幅が始まっており、一方でターゲット遺伝子MIR 98の発現は25サイクル付近で増幅の遅延が見られました。本実験のデータはテキストファイルとしてエクスポートされ、解析ソフトウェアを用いて分析されました。キャリブレーターおよびサンプルを含むキャピラリーの位置を指定します。この手法に習熟すれば、適切に実施することで1日で完了させることが可能です。本手法の信頼性はRNAの品質に依存します。したがって、RNAは非常に分解されやすいため、取り扱いには細心の注意を払うことが重要です。

microrna-detection-prostate-tumors-quantitative-real-time-pcr

Research

JoVE Journal

Medicine

医学

我々は、事前にマイクロRNAの設定と分析サーモ科学マトリックスマルチチャンネルピペットで手でだけでなく、ロボットを使用してQPCR用96穴の配列のデモンストレーションを行います。...

定量リアルタイムPCR（定量PCR）アレイを用いたプレマイクロRNAとマイクロRNAのプロファイリング

ここでは、サンプルの限られた量を扱う場合は特に、マイクロRNA（miRNA）の発現レベルのコストと時間効果のハイスループットスクリーニングのツールと​​してのマイクロ流体プラットフォームとの組み合わせで最適化された多重逆転写定量PCR（定量RT -...

ハイスループットマイクロRNAプロファイリング：最適化されたマルチプレックスフリューダイナミックArrayTMのIFCSでナノリッタースケールでの定量RT - PCR

私たちは、脳脊髄液（CSF）中のマイクロRNAをプロファイリングするリアルタイムPCRのプロトコルを記述します。 RNA抽出プロトコールを除いて、手順は他の体液、培養細胞、または組織試料から抽出したRNAに拡張することができる。...

定量リアルタイムPCRを用いて脳脊髄液マイクロRNAプロファイリング

エストロゲンとマイクロRNAの両方を介したシグナル伝達分子は、乳がんの発展と成長において重要である。エストロゲンは転写因子であるエストロゲン受容体を活性化する。多くの転写因子は、マイクロRNAの発現を調節することができ、エストロゲン調節マイクロRNAは、異なる大規模な技術を用いてプロファイリングすることができる。...

乳癌細胞におけるエストロゲン調節マイクロRNAのプロファイリング

循環マイクロRNAは、最近様々な癌および他の疾患のための有望で新規なバイオマーカーとして浮上している。この記事の目的は、マイクロRNAの循環の豊富さを定量化し、決定するために利用可能である三つの異なるプローブベースのリアルタイムPCRプラットフォームと方法を議論することです。...

プローブベースのリアルタイムPCRは、マイクロRNAの定量的測定のためのアプローチ

ここでは、定量的リアルタイムPCR(RT-PCR)およびin...

前立腺癌臨床組織におけるmiRNA発現解析

このプロトコルの目標は、下流のRNA分析のために不均一な前立腺組織から純粋な細胞型の集団を分離する効果的な方法として、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションを使用することです。...

RNA分析のためのヒト前立腺上皮のレーザーキャプチャーマイクロダイセクション

ここでは、定量的リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、ラット腹膜におけるマイクロRNA発現の検出のためのプロトコールを提示する。この方法は、いくつかの病理学的状態におけるラット腹膜におけるマイクロRNA発現プロファイルの研究に適している。...

定量的リアルタイムPCRを用いたラットの腹膜におけるマイクロRNA発現の検出

このレポートでは、中古増幅の有無、定量的リアルタイム逆転写 PCR を用いたプラズマ miRNA の絶対レベルを測定するためのプロトコルについて説明します。このプロトコル プラズマ miRNAs...

定量的リアルタイム逆転写 PCR を用いたカニクイザルにおける血中マイクロ Rna の絶対定量

治療抵抗性は進行前立腺癌の患者で発症することが多く、場合によっては、癌は神経内分泌前立腺癌と呼ばれる致死的なサブタイプに進行する。この遷移を促進する小さな非コーディングRNA媒介分子変化を評価することは、神経内分泌前立腺癌の発症につながる因果メカニズムのより良い疾患階層化および同定を可能にするであろう。...

去勢耐性前立腺癌患者からのホルマリン固定組織および血清由来エキソソームからの小型非コードRNAのシーケンシング

このプロトコルは、マイクロRNAおよびマルチプレックスタンパク質を同時に検出および定量するためのホルマリン固定パラフィン包埋組織を用いたタンデム免疫蛍光ハイブリダイゼーションアッセイを記述している。...

新しい検出および定量法としてのロック核酸 in situ ハイブリダイゼーションによるマイクロRNA増幅と認識

学ぶ 定量リアルタイムPCRによる前立腺がん組織におけるマイクロRNA発現の定量解析法。RNA抽出、逆転写、cDNA合成、サイバーグリーン蛍光法を用いて、がんと正常組織のmiRNA発現差を高感度に検出し、バイオマーカーとしての可能性を評価する。

定量的リアルタイムPCR（定量PCR）による前立腺腫瘍におけるマイクロRNAの検出

さらに動画を探す