フローサイトメトリーおよび自動化された磁気活性化細胞選別（AutoMACS）を使用して、ナイーブ膵腫瘍を有するマウスからミエロイド系のサプレッサー細胞（MDSC）の調製

本実験の全体的な目的は、in vivoおよびin vitroアッセイに使用するため、マウスの脾臓から生存可能な骨髄由来抑制細胞（MDSC）を含むGR1陽性濃縮白血球集団を迅速に調製することである。まず、数匹のマウスから脾臓を回収してプールし、単一細胞懸濁液を調製する。濃縮前のMDSCの割合を定量するため、プールした細胞の一部を96ウェルV底プレートに分注する。

MAC-1およびGR-1表面抗原を標識し、標識した細胞をフローサイトメトリー解析用のファルコンチューブに移します。残りのプールした白血球を、フルオロクロム標識GR-1抗体で染色し、抗GR-1抗体のフルオロクロムに結合する磁気マイクロビーズとともにインキュベートします。その後、AutoMax Proセパレーターを用いてGR-1陽性集団とGR-1陰性集団を分離し、集団のGR-1濃縮が成功したかを確認します。

少量の分注液を採取し、GR oneおよびMAC oneの発現を解析してMDSCの割合を評価します。得られた免疫表現型解析データの比較により、非濃縮集団と比較して、GR one濃縮白血球集団においてMDSCの割合が増加していることが示されます。さらに、ナイーブMDSCが増加し、腫瘍担持MDSCと同等の集団となります。

従来のフロー染色や、リンパ組織からのmDSCsの高速度フローサイトメトリーベースのソーティングなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、マスターミックス法を用いることで、プールした白血球の表面染色を均一にし、mDSCsの表現型解析およびGR1陽性細胞のAutoMaxソーティングにおける結果の大きなばらつきを防げることです。手順のデモンストレーションは、当研究室の大学院生であるNadine Nelson氏と、USFフローサイトメトリーコアファシリティの責任者であるDr. Hawsra氏が行います。以下の手順は、バイオセーフティキャビネット内の無菌環境で、細胞と抗体を氷上に保持した状態で実施してください。

可能な限り、メッシュスクリーンをカップの底方向の開口部に挿入して細胞解離用シーブを組み立てます。次に、リテーニングリングのスロット側を上に向けた状態でネジ山のある部分に挿入し、リングキーを使用してリテーニングリングを締め付け、スクリーンを固定します。組み立てたシーブを、10 millilitersのXPBSプールが入ったペトリ皿に配置します。

腫瘍を担持させた、あるいはナイーブコントロールとしての6〜8週齢のC 57black/6マウスから脾臓を摘出し、細胞解離用シブのメッシュスクリーン上に配置します。次に、ガラス製ペッスルを用いて、脾臓をメッシュスクリーン越しにペトリ皿へとすり潰します。この操作を各処理群のマウスについて繰り返します。

次に、5 mLのセロロジカルピペットを使用して、細胞懸濁液を70 µmのセルストレーナーに適用し、50 mLコニカルチューブにろ過させます。250〜300 ×gで5分間遠心分離します。上清を取り除き、脾臓1つにつき5 mLのRBC溶血バッファーを加えて激しくピペッティングしてペレットを再懸濁し、室温で5分間インキュベートします。インキュベート後、20 mLのPBSを加えて激しくピペッティングし、反応を停止させます。

その後、250から300 ×gで5分間遠心分離し、上清を除去した後、ペレットを20 mLの滅菌PBSに再懸濁して細胞数をカウントします。トリパンブルーと血球計数器を用いて、3%染色培地中で細胞濃度を1 × 10⁷から2 × 10⁷ cells/mLに調整して再懸濁します。最適な染色を実現することが、本手順において最も困難な点です。

これは、事前に抗体のタイトレーションを行うことで適切に実施できます。本プロトコルに記載されている通り、マスターミックスの調製および少量の液量での表面染色を行ってください。フローサイトメトリー解析用に細胞を染色するため、96ウェルV底プレートの各ウェルに、コントロールサンプル、実験サンプル、およびシングルステインのラベルを記入します。

コンペンセーションコントロールとして、5×10⁵から1×10⁶個の細胞を50 µLの液量で各ラベル付きウェルに加えてください。その後、プレートを250〜300 ×gで5分間遠心分離します。遠心分離後、プレートを下から観察してください。

ウェル内にペレットが存在することを確認し、3%染色培地で希釈したラット抗マウスCD163単クローン抗体を含むマウスBDFCブロックのマスターミックスを、氷上の1.5 mLマイクロ遠心チューブ内でボルテックスを用いて調製します。次に、96ウェルV底プレートを廃棄容器またはシンクの上に保持したまま、5秒間短時間遠心します。細胞ペレットを乱さないように、プレートを素早く反転させて上清を除去します。

次に、96ウェルV底プレート内のすべてのペレットにFCブロックマスターミックスを50 µL加え、ピペッティングで穏やかに混合します。プレートを氷上に置き、暗所で15分間インキュベートした後、遠心プレートを用いて250～300 ×gで5分間遠心分離します。氷上の1.5 mLマイクロ遠心チューブ内で、3%染色培地で希釈したMac-1 FITCおよびGR-1 APC抗体のマスターミックスを調製します。

ボルテックスした後、5秒間短時間遠心分離します。遠心後、プレートを反転させて各ウェルから上清を除去し、コントロールまたは実験群のペレットに抗体ミックスを50 µL添加します。緩やかにピペッティングして十分に混合します。シングルステイン補正用には、3%染色培地で希釈したMAC 1、FGR 1、APCまたはDPIを50 µLずつ適切なウェルに添加します。未染色コントロールには、3%染色培地を50 µL適切なウェルに添加し、混合します。

その後、プレートを氷上で暗所に30分間インキュベートします。インキュベーションの間に、プレートの各ウェルに対応するようにFACSチューブにラベルを貼り、各FACSチューブに3%染色培地を200 µL加えます。30分間のインキュベーション時間が経過した後、プレートを250〜300 ×gで5分間遠心分離します。

遠心分離後、前回と同様に上清を除去します。次に、各ペレットに3%染色培地を100 µL加え、ペレットを洗浄します。ピペッティングで穏やかに混ぜ合わせてください。

プレートを再度5分間遠心分離します。遠心後の洗浄ステップをもう一度繰り返し、前と同様に上清を除去し、各ペレットを100 µLの3%染色培地に再懸濁してよく混合します。次に、プレートの各ウェルから再懸濁した細胞100 µLを、それぞれ対応するラベルを付けた FACSチューブに移します。

次に、コントロール試料、実験試料、およびDPI単色染色補正コントロールに、75 nanograms per milliliterのDPIを添加します。付随するドキュメントの記載に従い、MDSCの割合を決定するためのサイトメトリーデータの取得を行います。次に、未染色の白血球の残りのうち、1 times 10 to the seventh個のGR one陽性白血球を濃縮するため、適切にラベル付けされた FACSチューブに移し、250 to 300 times Gで5分間遠心分離します。MAXバッファーで1 to 10に希釈したGR one PE抗体を50 microliters添加し、4 degrees Celsiusの暗所で15分間インキュベートします。

インキュベーション後、各faxチューブにmax bufferを2 mL加え、250～300 ×gで5分間遠心分離します。遠心後、上清を捨てます。次に、max bufferで1/4に希釈したanti PE microbeadsを各チューブに200 µL加え、4 °Cの暗所で15分間インキュベートします。

2 mLのmax bufferをfaxチューブに加え、250～300 ×gで5分間遠心分離します。その後、ペレットを3 mLのstaining bufferで再懸濁し、70 µmのストレーナーを用いて、ラベルを貼った新しい50 mLコニカルチューブにろ過します。本プロトコルでは、自動磁気分離法を使用します。

磁気分離は非常に優れた手法です。表面マーカーに基づいて大量の細胞を迅速かつ費用対効果よく分離する必要がある場合は、必ず最後にフローサイトメトリーで結果を確認してください。AutoMax proセパレーターを準備し、プライミングを行う際は、すべてのボトルに適切な溶液が満たされていることを確認してください。

装置の電源を入れます。初期化後、液体容器とカラムの状態を確認してください。すべてのシンボルが緑色になっている必要があります。

次に、上部メニューバーから「separation（分離）」を選択し、続いて「wash（洗浄）」を選択します。次に、下部メニューバーのポップアップオプションから「rinse（リンス）」を選択し、「run（実行）」を選択してプライミングプロセスを開始します。プライミングプロセスが正常に完了すると、装置に分離準備完了が表示されます。

ステータスメニューで、磁気標識した細胞が入った50 mLコニカルチューブを、適切なサイズの冷却チューブラックの行Aに配置します。次に、ネガティブ分画回収用の50 mLコニカルチューブを行Bに、ポジティブ分画回収用の15 mLコニカルチューブを行Cに配置し、サンプルから感度モードで標識標的細胞をポジティブ選択するための「POS cell S cell separation」プログラムを選択します。プログラムが開始されると、磁気標識された標的細胞はAutoMaxカラムに保持され、未標識の細胞は行Bのネガティブ分画回収チューブに放出されます。その後、磁石が後退し、標識標的細胞がチューブラックの行Cにあるポジティブ回収チューブに放出されます。

濃縮後、trypan blueとヘモサイトメーターを用いて、GR1陽性分画およびGR1陰性分画を再計数します。次に、細胞を3%染色培地で1×10⁷ cells/mLから2×10⁷ cells/mLの密度で再懸濁し、適切にラベル付けしたFACSチューブに50 µLずつ分注します。フローサイトメトリーおよびシングルステイン補正のため、MAC-1およびDPI生存率染料で細胞を染色します。

フローサイトメトリーによるデータ取得を行い、GR1陽性およびGR1陰性の割合を決定するとともに、AutoMaxおよび濃縮前後のMDSCの割合を比較します。膵腫瘍担がんマウスおよびナイーブマウスから脾臓を採取し、本ビデオ記事で説明した通りに単一細胞懸濁液に調製しました。MAC-1およびGR1蛍光標識抗体で表面染色したナイーブ白血球をフローサイトメトリーで解析したところ、こちらに示すように、AutoMax濃縮前はナイーブのMAC-1およびGR1陽性MDSCの割合は1.19%と非常に低い値でした。しかし、GR1陽性集団を濃縮した後、この細胞サブポピュレーションはナイーブマウスにおいて10.5%まで有意に増加し、腫瘍担がんマウスの25.3%に匹敵する割合となりました。

この手順に続き、加速MDSC誘導、フローサイトメトリーを用いたin vivo養子移殖実験、定量リアルタイムPCR、ウェスタンブロッティングなどの他の手法を実施することで、MDSCの増殖、遊走、分化、および免疫応答の抑制に関与する分子メカニズムに関するさらなる疑問を明らかにすることができます。