Name: フローサイトメトリーおよび自動化された磁気活性化細胞選別（AutoMACS）を使用して、ナイーブ膵腫瘍を有するマウスからミエロイド系のサプレッサー細胞（MDSC）の調製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 15 s
Description: 学ぶフローサイトメトリーとAutoMACSを用いたマウス脾臓由来ミエロイド系サプレッサー細胞（MDSC）の迅速な調製法。Gr-1陽性白血球を高収率で分離し、免疫学研究に応用可能です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我々は、USFのフローサイトメトリーコアファシリティを認める。我々は、リソースを共有するためにドクターデニス·クーパーに感謝します。また、設定とこのビデオの撮影に、その支援のためのMayaコーエン、ローラペンドルトンとダイアナラトゥールに感謝します。 NNは博士号フェローシップHRD＃0929435にNSF FG-LSAMPブリッジによってサポートされています。この仕事はTGに授与米国癌学会機関研究助成＃93-032-13/Moffittがんセンターによって資金を供給された。

開始する前に、次の解決策を準備します。 3％の染色メディア（SM）： 1Xリン酸緩衝生理食塩水で3％ウシ胎児血清（FBS）（PBS） MACSバッファー（MB）： - 1XPBSでウシ血清（BSA）から0.5％アルブミン 1。マウスから収穫脾臓<ol><li>皮下に100μlの1X PBS（; TB担癌）に懸濁し、1.5×10 5マウスPanc02細胞と年齢C57BL / 6マウス（Harlan）の6-8週間を注入します。コントロールマウス（ナイーブ）100μlの1XPBSを受信します。 </li><li>約4週間ポスト噴射、二酸化炭素窒息によりマウスを安楽死させる。 </li><li>鉗子とハサミを用いて鈍的切開によるマウスから収穫の脾臓は、バランスを使用して重量を量る。別の場所の脾臓では、1×PBSを含む50 mlのコニカルチューブにラベルを付けました。 </li></ol> 2。シングルセルサスペンシオを生成します。脾臓から白血球のn すべての手順は、生物学的安全フードや氷上で保存細胞および抗体の下で無菌環境で実行する必要があります。 <ol><li>底に向かってカップの開口部にメッシュスクリーンを挿入することにより、細胞解離ふるいを組み立てます。次に、このような場所に画面を保持し、マイナス側でスレッドの領域に保持リングを挿入し、固定リングを締めリングキーを使用します。 10ミリリットル1×PBSを含むペトリ皿の中で組み立てられたふるいを置きます。 </li><li>プールの脾臓および細胞解離ふるいのメッシュスクリーンに対しても、ペトリ皿に脾臓を挽くためにガラスの乳棒を使用しています。マウスの各治療群に対して、この手順を繰り返します。 </li><li> 70μmのセルストレイナーと5ミリリットル血清ピペットを用いて50 mlコニカルチューブにフィルターを細胞懸濁液。 5分間12,000 rpmで（250〜300×g）で遠心します。 </li><li>脾臓あたり5ミリリットル×1 RBC溶解緩衝液上清とペレットを再懸濁しを削除します。。精力的に上下にピペッティング。室温で5分間インキュベートします。 1×PBS 20 mlを加えて反応を停止します。精力的に上下にピペッティング。 5分間12,000 rpmで（250〜300×g）で遠心します。 </li><li> 20ミリリットル滅菌1×PBSで上清とペレットを再懸濁しを削除します。精力的に上下にピペッティング。 </li><li> 50μlのは5×5×10 6個の細胞（ - 2×10 7細胞/ mlの1×10 7細胞/ ml）と等価になるようにトリパンブルーと3％のSMの所望の濃度で再懸濁し血球を用いて細胞をカウントします。 </li></ol> 3。フローサイトメトリーを用いてMDSCの細胞表面染色/免疫表現型<ol><li> （; MAC-1-FITC、GR-1-APCとDAPIはありませんステイン、NS）制御と補償コントロールの実験試料と単一の汚れのために96ウェルVボトムプレートのウェルにラベルを付けます。 </li><li> 96ウェルV底プレートのそれぞれのウェルに脾細胞を50μl/ウェルに相当する5×5×10 6個の細胞を追加します。遠心分離5分間12,000 rpmで（250〜300 xg）でプレート。 </li><li>氷上で1.5 mlのマイクロ遠心チューブに、3％のSMで希釈したマウスのBDのFcブロック（ラット抗マウスCD16/32モノクローナル抗体）の &quot;マスターミックス&quot;（MM）を準備します。出発点として、1ウェルあたり50μlの最終容量に対して3％のSMで1μgのFcのブロックを使用しています。 </li><li>慎重に細胞ペレットを中断することなく廃棄物の容器やシンクの上に、プレート上にバックをすばやく反転させ、96ウェルV底プレートの各ウェルから上清を除去します。 </li><li> Vortexは、簡単に5秒間のFcブロックMMを遠心分離し、96ウェルV底プレート内のすべてのペレットに50μlを加える。静かに彼らのウェルにサンプルを残して、上下にピペッティングでよく混ぜる。氷上、暗所で15分間プレートをインキュベートします。 5分間12,000 rpmで（250〜300×g）でプレートを遠心分離します。 </li><li>サンプルは、Fcブロックでインキュベートしながら、氷の上で1.5ml微量遠心チューブに3％のSMで希釈した蛍光標識抗体の &quot;マスターミックス&quot;（MM）を準備します。抗体は、滴定されるべき染色手順のための最適な希釈を決定します。出発点として、よくサンプルあたり、50μlの最終容量に対して3％のSMで1時25 MAC-1-FITCの希釈およびGr-1-APCの1:20希釈を兼ね備​​えています。 </li><li>前述のように慎重に、96ウェルV底の各ウェルから上清を除去します。 </li><li> Vortexは、簡単に5秒間蛍光標識染色抗体のMMを遠心分離や制御、実験ペレットに50μlを加える。優しく上下にピペッティングでよく混ぜる。単染色補正のために、ウェルあたり50μlの最終容量の3％のSMは、Mac-1-FITC、GR-1-APCの1:20希釈およびDAPIの75 ng / mlで、1:25希釈を追加するそれぞれのウェルに。 （ステインはありません）も無染色に50μlの3％のSMを追加します。よく混ぜ、氷上、暗所で30分間、96ウェルV底プレートで細胞をインキュベートします。 </li><li> 96ウェルV底プレートの各ウェルに対応するラベルのFACSチューブ（5ミリリットル、12ミリメートル×75 mmのポリスチレン丸底チューブ）。各FACSに200μlの3％のSMを追加します。チューブ。 </li><li> 5分間12,000 rpmで（250〜300×g）でプレートを遠心し、上清を除去します。各ペレットに100μlの3％のSMを追加することによってペレットを洗浄し、優しく上下にピペッティングでよく混ぜる。 5分間12,000 rpmで（250〜300×g）でプレートを遠心分離します。もう一度手順洗浄を繰り返します。 </li><li>前述のように慎重に、96ウェルV底の各ウェルから上清を除去します。 100μlの3％のSMの各ペレットを再懸濁し、よく混ぜる。 </li><li> 96ウェルV底プレートの各ウェルからのそれぞれ標識したFACSチューブにペレットを再懸濁し、100μlを転送します。 </li><li>前のフローサイトメトリー分析には、制御と実験試料とDAPI染色、単一の補償制御を75 ng / mlのDAPIを追加します。 </li><li> MDSC割合のフローサイトメトリーのデータ収集を実行します。負（無染色コントロール）と単一の陽性コントロールを使用して補正を行います。そのように、ログスケールの前方（FSC）対側方散乱（SSC）が表示され、ドットプロットを設定するの白​​血球集団興味を識別することができます。破片と最低前方と側方散乱の塊を除く、全ての白血球に大きなゲートを描画します。この親ゲートから、DAPI-（ライブ）細胞上でSSC対DAPIとゲートを表示する新しいドットプロットを作成します。この新たにゲート人口を選択し、ダブルポジティブ上のMac-1とGR-1とゲートが表示されます。ドットプロットを作成する（Mac-1 + GR-1 +）MDSC。 </li></ol> 4。 GR-1 +白血球の磁気濃縮<ol><li> 5分間12,000 rpmで（250〜300 xg）で適切に標識されたFACSチューブと遠心分離機にアリコート1×10 7残りの染色白血球。 </li><li> 1.5 mlのマイクロ遠心チューブ内でのGr-1-PE抗体のMMを準備します。 10 7個の細胞までについては、サンプルあたり50μlのMB、にのGr-1-PE抗体の1:10希釈を使用しています。大きなセル番号については、それに応じてボリュームをスケールアップ。簡単に言うと、5秒間遠心FACSチューブ内の白血球に加え、4℃、15分暗所でインキュベートします。 </LI&gt; <li> 、FACSチューブにMBの2ミリリットルを追加し、5分間12,000 rpmで（250〜300 xg）で遠心し、上清を捨てる。 </li><li> 1.5 mlのマイクロ遠心チューブに抗PE MicroBeadsはMMの準備をします。 10 7個の細胞までは、サンプルごとに、200μlのMBでの抗PE MicroBeadsでの1:4希釈を使用しています。大きなセル番号については、それに応じてボリュームをスケールアップ。簡単に言うと、5秒間遠心FACSチューブ内の白血球に加え、4℃、15分暗所でインキュベートします。 </li><li> 、FACSチューブにMBの2ミリリットルを追加し、5分間12,000 rpmで（250〜300 xg）で遠心し、上清を捨てる。 SBの3 mlのペレットを再懸濁します。新しい、標識された50 mlコニカルチューブに70μmのストレーナーを介してフィルタリングします。 </li><li>作成し、内閣総理オートMACSプロセパレータ。適切なソリューションと空の廃液ボトルと詰め替えはすべてのボトルは、必要に応じて。楽器の電源を入れ、初期化後に液体容器や列（s）の状態を調べる。すべてのシンボルは緑色でなければなりません。メニューには、上部から &quot;分離&quot;を選択してくださいメニューバーには、下のメニューバーから &quot;今すぐ洗い&quot;が続く。プライミング処理を開始するために &quot;実行&quot;に続いてポップアップオプションから &quot;すすぎ&quot;を選択します。プライミング処理が正常に完了すると、測定器は、それが[ステータス]メニューの下の &quot;分離のための準備&quot;であることが表示されます。 </li><li>行Bの否定的なフラクションコレクションと行のCの肯定的なフラクションコレクションのために15 mlコニカルチューブの行、50 mlコニカルチューブに磁気標識した細胞をチューブのサイズと場所に適した冷却したチューブのラック50mlコニカルチューブを選択します。 </li><li>サンプルから区別するモードで標識した標的細胞のポジティブセレクションのための &quot;POSSEL_S&quot;細胞分離プログラムを選択します。磁気標識した標的細胞をオートカラムに保持されます。非標識細胞は磁石の自動後退の行Bに負の分数のコレクションチューブに放出され、標識した標的細胞は、チューブの行Cで正のコレクションチューブに放出されます。ラック。 </li></ol>+充実した白血球のポストソート分析<ol><li> GR-1 +とGR-1を再集計-トリパンブルーと血球計を使用した画分を。 3％の染色培地中の所望の濃度で再懸濁した細胞を50μlの5×5×10 6個の細胞（1×10 7細胞/ ml - 2×10 7細胞/ ml）と等価であるように、それに応じて標識されたFACSチューブに50μlを転送します。 </li><li>サンプルあたり50μlの最終容量の3％のSMで1:25希釈で、唯一のMac-1のMMを準備します。細胞を染色し、フローサイトメトリー分析用G​​R-PEは、Mac-1 FITCおよびDAPIの単一の染色補正を準備します。前述のように200μlの3パーセントのSMとDAPI生存染料を追加します。 </li><li>パーセンテージもMDSC割合事前·事後autoMACS濃縮を比較する- GR-1 +とGR-1を決定するためにフローサイトメトリーのデータ収集を実行します。 </li></ol> 6。代表的な結果ここでは、rを示す<html> MDSC（ 図1）の並べ替え、その後のFACSのためにプールされた、ナイーブ脾臓からのGr-1 +白血球のautoMACS濃縮用epresentative結果。 1×10 6ナイーブ白血球前autoMACSのソートに、BD LSRII器を使用してMDSC割合を識別するには、Mac-1-FITCとGr-1-APC抗体で染色した。 1×10 7ナイーブ白血球はその後autoMACS Proの区切り記号を使用して、GR-1 +白血球の濃縮のためにAnti-Gr-1-PE抗体およびPE-MicroBeadsを用いて染色した。ポストautoMACSの濃縮は、GR-1 +とGR-1 GR-1の割合-収集した画分はフローサイトメトリーを用いて評価した。 1×10 6のGr-1 +白血球は、フローサイトメトリーによって腫瘍を白血球をプールし、非濃縮する濃縮のMDSC割合、プールされたナイーブな白血球を分析し、比較するには、Mac-1-FITC抗体で除去し、染色した。 fig1.jpg &quot;/&gt; ソートMDSC FACS用ナイーブGR-1 +白血球の図1。AutoMACS濃縮。脾臓、膵臓腫瘍を有するとナイーブなマウスから採取し、単一細胞懸濁液に加工された。ナイーブな白血球表面のフローサイトメトリー分析の前autoMACS濃縮（）には、Mac-1とGR-1蛍光標識抗体で染色した。 GR-1 +（B）とGR-1のフローサイトメトリー分析- GR-1-PE抗体と抗PE MicroBeadsで染色し、プールされたナイーブleuckocytesからのGr-1 +細胞の（C）分画のポストautoMACS濃縮。 MDSCおよびGR-1のフローサイトメトリー分析のGr-1 +の割合はポストautoMACS濃縮担癌マウス（E）から非濃縮プールされた白血球（ナイーブマウス、n = 5の場合と比較して、プールされたナイーブな白血球（D）から+細胞、担癌マウス、n = 3）で。 MDSCおよびGr-1の割合は、代表的なコンタープロットとヒストグラムのゲートがあります。

<ol><li>Goni, O., Alcaide, P., Fresno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosuppression+during+acute+Trypanosoma+cruzi+infection%3A+involvement+of+Ly6G+%28Gr1%28%2B%29%29CD11b%28%2B%29+immature+myeloid+suppressor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunosuppression during acute Trypanosoma cruzi infection: involvement of Ly6G (Gr1(+))CD11b(+) immature myeloid suppressor cells.</a> Int. Immunol. 14, 1125-1134 (2002).</li>
<li>Zhu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD11b%2BLy-6C%28hi%29+suppressive+monocytes+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD11b+Ly-6C(hi) suppressive monocytes in experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J. Immunol. 179, 5228-5237 (2007).</li>
<li>Makarenkova, V. P., Bansal, V., Matta, B. M., Perez, L. A., Ochoa, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD11b%2B%2FGr-1%2B+myeloid+suppressor+cells+cause+T+cell+dysfunction+after+traumatic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD11b+/Gr-1+ myeloid suppressor cells cause T cell dysfunction after traumatic stress.</a> J. Immunol. 176, 2085-2094 (2006).</li>
<li>Ghansah, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+myeloid+suppressor+cells+in+SHIP-deficient+mice+represses+allogeneic+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Expansion of myeloid suppressor cells in SHIP-deficient mice represses allogeneic T cell responses.</a> J. Immunol. 173, 7324-7330 (2004).</li>
<li>Paraiso, K. H., Ghansah, T., Costello, A., Engelman, R. W., Kerr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+SHIP+deficiency+expands+myeloid+regulatory+cells+and+abrogates+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induced SHIP deficiency expands myeloid regulatory cells and abrogates graft-versus-host disease.</a> J. Immunol. 178, 2893-2900 (2007).</li>
<li>Yin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid-derived+suppressor+cells+prevent+type+1+diabetes+in+murine+models%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Myeloid-derived suppressor cells prevent type 1 diabetes in murine models.</a> J. Immunol. 185, 5828-5834 (2010).</li>
<li>Gabrilovich, D. I., Nagaraj, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid-derived+suppressor+cells+as+regulators+of+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Myeloid-derived suppressor cells as regulators of the immune system.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 162-174 (2009).</li>
<li>Gallina, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumors+induce+a+subset+of+inflammatory+monocytes+with+immunosuppressive+activity+on+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Tumors induce a subset of inflammatory monocytes with immunosuppressive activity on CD8+ T cells.</a> J. Clin. Invest. 116, 2777-2790 (2006).</li>
<li>Zhao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+in+frequency+of+myeloid-derived+suppressor+cells+in+mice+with+spontaneous+pancreatic+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Increase in frequency of myeloid-derived suppressor cells in mice with spontaneous pancreatic carcinoma.</a> Immunology. 128, 141-149 (2009).</li>
<li>Greten, T. F., Manns, M. P., Korangy, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+derived+suppressor+cells+in+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunopharmacol%22%5BJournal%5D)">Myeloid derived suppressor cells in human diseases.</a> Int Immunopharmacol. 11, 802-806 (2011).</li>
<li>Youn, J. I., Nagaraj, S., Collazo, M., Gabrilovich, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subsets+of+myeloid-derived+suppressor+cells+in+tumor-bearing+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Subsets of myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice.</a> J. Immunol. 181, 5791-5802 (2008).</li>
<li>Ribechini, E., Greifenberg, V., Sandwick, S., Lutz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subsets%2C+expansion+and+activation+of+myeloid-derived+suppressor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Subsets, expansion and activation of myeloid-derived suppressor cells.</a> Med. Microbiol. Immunol. 199, 273-281 (2010).</li>
<li>Pilon-Thomas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+Pancreatic+Adenocarcinoma+Dampens+SHIP-1+Expression+and+Alters+MDSC+Homeostasis+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Murine Pancreatic Adenocarcinoma Dampens SHIP-1 Expression and Alters MDSC Homeostasis and Function.</a> PLoS One. 6, (2011).</li>
<li>Panopoulos, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3+governs+distinct+pathways+in+emergency+granulopoiesis+and+mature+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">STAT3 governs distinct pathways in emergency granulopoiesis and mature neutrophils.</a> Blood. 108, 3682-3690 (2006).</li>
<li>Preynat-Seauve, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extralymphatic+tumors+prepare+draining+lymph+nodes+to+invasion+via+a+T-cell+cross-tolerance+process%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Extralymphatic tumors prepare draining lymph nodes to invasion via a T-cell cross-tolerance process.</a> Cancer Res. 67, 5009-5016 (2007).</li>
<li>Davies, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+separations+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Cell separations by flow cytometry.</a> Methods Mol. Med. 58, 3-15 (2001).</li>
<li>Maecker, H., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selecting+reagents+for+multicolor+BD+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Postepy+Biochem%22%5BJournal%5D)">Selecting reagents for multicolor BD flow cytometry.</a> Postepy Biochem. 55, 461-467 (2009).</li>
<li>Bagwell, C. B., Adams, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+Spectral+Overlap+Compensation+for+Any+Number+of+Flow+Cytometry+Parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Fluorescence Spectral Overlap Compensation for Any Number of Flow Cytometry Parameters.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 677, 167-184 (1993).</li>
<li>Perfetto, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amine+reactive+dyes%3A+an+effective+tool+to+discriminate+live+and+dead+cells+in+polychromatic+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 313, 199-208 (2006).</li>
<li>Safarik, I., Safarikova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+magnetic+techniques+for+the+isolation+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B.+Biomed.+Sci.+Appl%22%5BJournal%5D)">Use of magnetic techniques for the isolation of cells.</a> J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 722, 33-53 (1999).</li>
<li>Collazo, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHIP+limits+immunoregulatory+capacity+in+the+T-cell+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">SHIP limits immunoregulatory capacity in the T-cell compartment.</a> Blood. 113, 2934-2944 (2009).</li>
<li>Mack, E., Neubauer, A., Brendel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+RNA+yield+from+small+cell+populations+sorted+by+flow+cytometry+applying+different+isolation+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+A%22%5BJournal%5D)">Comparison of RNA yield from small cell populations sorted by flow cytometry applying different isolation procedures.</a> Cytometry. A. 71, 404-409 (2007).</li>
<li>Strauss, L., Czystowska, M., Szajnik, M., Mandapathil, M., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+responses+of+human+regulatory+T+cells+%28Treg%29+and+effector+T+cells+to+rapamycin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Differential responses of human regulatory T cells (Treg) and effector T cells to rapamycin.</a> PLoS One. 4, e5994(2009).</li>
</ol>

利害の衝突が宣言されません。

これは、様々な動物モデルから別のリンパ組織にも適用可能であるMDSC集団を処理し、immunophentypingの詳細な方法です。特に、autoMACSの濃縮は、脾細胞4のGR-1の枯渇、脾臓細胞、リンパ節5から骨髄のサブセットの精製、CD8の骨髄好中球14の単離および精製+脾臓からT細胞を含む種々の白血球集団の分離に使用することができますとリンパ節15。かかわらず、興味のある細胞集団の、所望のリンパ系組織から白血球の単細胞懸濁液を生成し、最適な表面染色、フローサイトメトリー分析、autoMACS濃縮およびFACSソーティングに必要とされています。このプロトコルでは、白血球の単細胞懸濁液を作成するために機械的な解離を使用していました。しかし、このようなコラゲナーゼDなどの酵素消化を使用して増やすことも、このプロトコルに適切な代替手段です。脾臓または他のリンパ器官5から白血球の収量。 フローサイトメトリーは、免疫表現型の白血球のための重要なテクニックで...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬 </td><td> COMPANY </td><td> カタログ＃ </td><td> コメント </td></tr><tr><td> 1Xリン酸緩衝生理食塩水</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィックハイクローン</td><td> SH30028.02 </td><td>のCa 2 + / Mg 2 +を /フェノールレッドフリー</td></tr><tr><td>ウシ血清（BSA）からアルブミン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> A7906 </td><td> BSAをPBSに邪魔されずに溶解させ、無菌環境</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清（FBS） </td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィックハイクローン</td><td> SV3001403HI </td><td>不活化熱、無菌環境</td></tr><tr><td>ラット抗マウスCD16/32モノクローナル抗体（FCブロック） </td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 553142 </td><td>無菌環境</td></tr><tr><td>抗マウスCD11bをする（Mac-1）のFITC </td><td> eBiosciences </td><td> 11から0112 </td><td>無菌の環境</td></tr><tr><td>抗マウスLy6G（GR-1）APC </td><td> eBiosciences </td><td> 17から5931 </td><td>無菌環境</td></tr><tr><td>抗マウスLy6G（GR-1）PE </td><td> eBiosciences </td><td> 12から5931 </td><td>無菌環境</td></tr><tr><td> DAPI </td><td>インビトロジェン</td><td> D1306 </td><td>希釈無菌環境</td></tr><tr><td>細胞解離ふるい</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> CD1-1KT </td><td>使用前にオートクレーブ</td></tr><tr><td> 70μmのストレーナー</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 352350 </td><td>無菌環境</td></tr><tr><td> 1X RBC Lysis Bufferを</td><td> eBiosciences </td><td> 00-4333-57 </td><td>無菌環境、使用前に室温に暖かい</td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 08-757-12 </td><td>無菌環境</td></tr><tr><td> 50ミリリットルCONiCalの管</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> 339652 </td><td>無菌環境</td></tr><tr><td> 5ミリリットル12X75mmポリスチレン丸底チューブ</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 352054 </td><td> FACSチューブとして知られている。無菌環境</td></tr><tr><td> 96ウェルV底プレート</td><td>コー​​ニング</td><td> 3897 </td><td>無菌環境</td></tr><tr><td>トリパンブルー</td><td> Cellgro </td><td> 25から900-CI </td><td>無菌環境</td></tr><tr><td> PE MicroBeadsは</td><td>ミルテニーバイオテク</td><td> 130-048-801 </td><td>無菌環境</td></tr><tr><td> AutoMACS Proのセパレータ</td><td>ミルテニーバイオテク</td><td> 130-092-545 </td><td></td></tr><tr><td> AutoMACS列</td><td>ミルテニーバイオテク</td><td> 130-021-101 </td><td></td></tr><tr><td>ランニングバッファーAutoMACS </td><td>ミルテニーバイオテク</td><td> 130-091-221 </td><td&gt; </td></tr></tbody></table>

フローサイトメトリーおよび自動化された磁気活性化細胞選別（automacs）を使用して、ナイーブ膵腫瘍を有するマウスからミエロイド系のサプレッサー細胞（mdsc）の調製

Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSC) from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting (AutoMACS)

MDSCは、寄生虫感染、炎症、外傷後ストレス、移植片対宿主病、糖尿病や癌1から7を含む病理学的条件下でリンパ系器官に蓄積される未熟なマクロファージ、樹状細胞および顆粒球の不均一な集団である。マウスでは、MDSCエクスプレスMAC-1（CD11bを）とGR-1（Ly6GとLy6C）の表面抗原7。 MDSCはよくそれらが大幅に拡大し、7月10日ナイーブな対応に比べて抗腫瘍免疫応答を抑制されている各種担癌宿主内で研究されていることに注意することは重要です。しかし、病態に応じて、抑制11,12の別個のメカニズムやターゲットとMDSCの異なる亜集団が存在する。したがって、実行可能なMDSC集団を分離するための効果的な方法は、in vitroおよび in vivo で抑制のそれぞれ異なる分子メカニズムの解明において重要である。 最近、Ghansahグループは、マウスの膵臓癌モデルでMDSCの拡大を報告しています。私たちの担癌MDSCは、恒常性の損失を表示し、ナイーブなMDSC 13に比べて抑制機能を増加させた。 MDSC割合はナイーブ対担癌マウスのリンパ系のコンパートメントで有意に少なくなります。これは、しばしばこれらのMDSCの正確な比較分析を妨げている主要な警告です。したがって、前の蛍光活性化セルソーティング（FACS）にナイーブマウスからのGr-1 +白血球を豊かにすると、純度、生存率を高め、大幅にソート時間が短縮されます。これらはソートクイックFACSのために豊富にありますしかし、担癌マウスからのGr-1 +白血球の濃縮はオプションです。したがって、このプロトコルでは、我々はMDSCをイムノタイムリーにMDSCをソートするためのナイーブマウスの脾臓からのGr-1 +白血球を濃縮する非常に効率的な方法を説明します。免疫C57BL / 6マウスは、マウスPanc02 CEを接種するナイーブなマウスは、1XPBSを受け取るのに対し、皮下LLS。約30日後に接種、脾臓細胞解離ふるいを使用して単一細胞懸濁液に収穫し、処理されます。脾細胞は、その後赤血球（RBC）を溶解し、これらの白血球のアリコートを、フローサイトメトリーを用いた免疫表現型MDSC割合にMac-1とGR-1に対する蛍光標識抗体を用いて染色されています。平行実験で、ナイーブマウスからの全白血球は蛍光標識のGr-1抗体、PE-MicroBeadsでインキュベートし、積極的に自動化された磁気活性化細胞選別（autoMACS）プロ区切り記号を使用して、選択した状態で染色されています。次に、GR-1 +白血球のアリコートを、フローサイトメトリーを用いてMDSC割合の増加を識別するためにMac-1抗体で染色されています。今、これらのGR1 +濃縮白血球は 、in vivo および in vitro での比較分析（ナイーブ対担癌）で使用するMDSCのソートFACSの準備ができている</em&gt;のアッセイ。

これは、ミエロイド系のサプレッサー細胞（MDSC）をイムノおよびGr-1を豊かにし、迅速かつ包括的な方法です<sup&gt; +</supマウスの脾臓から&gt;白血球。このメソッドは、実行可能なGR-1に濃縮するために選別フローサイトメトリーとAutoMACSセルを使用しています<sup&gt; +</sup使用するためにMDSCのソート、FACSの前に&gt;白血球<emin vivoでの&gt;</em&gt;と<em&gt; in vitroで</em&gt;アッセイ。

フローサイトメトリーおよび自動化された磁気活性化細胞選別（AutoMACS）を使用して、ナイーブ膵腫瘍を有するマウスからミエロイド系のサプレッサー細胞（MDSC）の調製

MDSCは、病理学的な状況下でリンパ系器官に集積する、未熟なマクロファージ、樹状細胞、および顆粒球からなる不均一な細胞集団である。

本実験の全体的な目的は、in vivoおよびin vitroアッセイに使用するため、マウスの脾臓から生存可能な骨髄由来抑制細胞（MDSC）を含むGR1陽性濃縮白血球集団を迅速に調製することである。まず、数匹のマウスから脾臓を回収してプールし、単一細胞懸濁液を調製する。濃縮前のMDSCの割合を定量するため、プールした細胞の一部を96ウェルV底プレートに分注する。MAC-1およびGR-1表面抗原を標識し、標識した細胞をフローサイトメトリー解析用のファルコンチューブに移します。残りのプールした白血球を、フルオロクロム標識GR-1抗体で染色し、抗GR-1抗体のフルオロクロムに結合する磁気マイクロビーズとともにインキュベートします。その後、AutoMax Proセパレーターを用いてGR-1陽性集団とGR-1陰性集団を分離し、集団のGR-1濃縮が成功したかを確認します。少量の分注液を採取し、GR oneおよびMAC oneの発現を解析してMDSCの割合を評価します。得られた免疫表現型解析データの比較により、非濃縮集団と比較して、GR one濃縮白血球集団においてMDSCの割合が増加していることが示されます。さらに、ナイーブMDSCが増加し、腫瘍担持MDSCと同等の集団となります。従来のフロー染色や、リンパ組織からのmDSCsの高速度フローサイトメトリーベースのソーティングなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、マスターミックス法を用いることで、プールした白血球の表面染色を均一にし、mDSCsの表現型解析およびGR1陽性細胞のAutoMaxソーティングにおける結果の大きなばらつきを防げることです。手順のデモンストレーションは、当研究室の大学院生であるNadine Nelson氏と、USFフローサイトメトリーコアファシリティの責任者であるDr. Hawsra氏が行います。以下の手順は、バイオセーフティキャビネット内の無菌環境で、細胞と抗体を氷上に保持した状態で実施してください。可能な限り、メッシュスクリーンをカップの底方向の開口部に挿入して細胞解離用シーブを組み立てます。次に、リテーニングリングのスロット側を上に向けた状態でネジ山のある部分に挿入し、リングキーを使用してリテーニングリングを締め付け、スクリーンを固定します。組み立てたシーブを、10 millilitersのXPBSプールが入ったペトリ皿に配置します。腫瘍を担持させた、あるいはナイーブコントロールとしての6〜8週齢のC 57black/6マウスから脾臓を摘出し、細胞解離用シブのメッシュスクリーン上に配置します。次に、ガラス製ペッスルを用いて、脾臓をメッシュスクリーン越しにペトリ皿へとすり潰します。この操作を各処理群のマウスについて繰り返します。次に、5 mLのセロロジカルピペットを使用して、細胞懸濁液を70 µmのセルストレーナーに適用し、50 mLコニカルチューブにろ過させます。250〜300 ×gで5分間遠心分離します。上清を取り除き、脾臓1つにつき5 mLのRBC溶血バッファーを加えて激しくピペッティングしてペレットを再懸濁し、室温で5分間インキュベートします。インキュベート後、20 mLのPBSを加えて激しくピペッティングし、反応を停止させます。その後、250から300 ×gで5分間遠心分離し、上清を除去した後、ペレットを20 mLの滅菌PBSに再懸濁して細胞数をカウントします。トリパンブルーと血球計数器を用いて、3%染色培地中で細胞濃度を1 × 10⁷から2 × 10⁷ cells/mLに調整して再懸濁します。最適な染色を実現することが、本手順において最も困難な点です。これは、事前に抗体のタイトレーションを行うことで適切に実施できます。本プロトコルに記載されている通り、マスターミックスの調製および少量の液量での表面染色を行ってください。フローサイトメトリー解析用に細胞を染色するため、96ウェルV底プレートの各ウェルに、コントロールサンプル、実験サンプル、およびシングルステインのラベルを記入します。コンペンセーションコントロールとして、5×10⁵から1×10⁶個の細胞を50 µLの液量で各ラベル付きウェルに加えてください。その後、プレートを250〜300 ×gで5分間遠心分離します。遠心分離後、プレートを下から観察してください。ウェル内にペレットが存在することを確認し、3%染色培地で希釈したラット抗マウスCD163単クローン抗体を含むマウスBDFCブロックのマスターミックスを、氷上の1.5 mLマイクロ遠心チューブ内でボルテックスを用いて調製します。次に、96ウェルV底プレートを廃棄容器またはシンクの上に保持したまま、5秒間短時間遠心します。細胞ペレットを乱さないように、プレートを素早く反転させて上清を除去します。次に、96ウェルV底プレート内のすべてのペレットにFCブロックマスターミックスを50 µL加え、ピペッティングで穏やかに混合します。プレートを氷上に置き、暗所で15分間インキュベートした後、遠心プレートを用いて250～300 ×gで5分間遠心分離します。氷上の1.5 mLマイクロ遠心チューブ内で、3%染色培地で希釈したMac-1 FITCおよびGR-1 APC抗体のマスターミックスを調製します。ボルテックスした後、5秒間短時間遠心分離します。遠心後、プレートを反転させて各ウェルから上清を除去し、コントロールまたは実験群のペレットに抗体ミックスを50 µL添加します。緩やかにピペッティングして十分に混合します。シングルステイン補正用には、3%染色培地で希釈したMAC 1、FGR 1、APCまたはDPIを50 µLずつ適切なウェルに添加します。未染色コントロールには、3%染色培地を50 µL適切なウェルに添加し、混合します。その後、プレートを氷上で暗所に30分間インキュベートします。インキュベーションの間に、プレートの各ウェルに対応するようにFACSチューブにラベルを貼り、各FACSチューブに3%染色培地を200 µL加えます。30分間のインキュベーション時間が経過した後、プレートを250〜300 ×gで5分間遠心分離します。遠心分離後、前回と同様に上清を除去します。次に、各ペレットに3%染色培地を100 µL加え、ペレットを洗浄します。ピペッティングで穏やかに混ぜ合わせてください。プレートを再度5分間遠心分離します。遠心後の洗浄ステップをもう一度繰り返し、前と同様に上清を除去し、各ペレットを100 µLの3%染色培地に再懸濁してよく混合します。次に、プレートの各ウェルから再懸濁した細胞100 µLを、それぞれ対応するラベルを付けた FACSチューブに移します。次に、コントロール試料、実験試料、およびDPI単色染色補正コントロールに、75 nanograms per milliliterのDPIを添加します。付随するドキュメントの記載に従い、MDSCの割合を決定するためのサイトメトリーデータの取得を行います。次に、未染色の白血球の残りのうち、1 times 10 to the seventh個のGR one陽性白血球を濃縮するため、適切にラベル付けされた FACSチューブに移し、250 to 300 times Gで5分間遠心分離します。MAXバッファーで1 to 10に希釈したGR one PE抗体を50 microliters添加し、4 degrees Celsiusの暗所で15分間インキュベートします。インキュベーション後、各faxチューブにmax bufferを2 mL加え、250～300 ×gで5分間遠心分離します。遠心後、上清を捨てます。次に、max bufferで1/4に希釈したanti PE microbeadsを各チューブに200 µL加え、4 °Cの暗所で15分間インキュベートします。2 mLのmax bufferをfaxチューブに加え、250～300 ×gで5分間遠心分離します。その後、ペレットを3 mLのstaining bufferで再懸濁し、70 µmのストレーナーを用いて、ラベルを貼った新しい50 mLコニカルチューブにろ過します。本プロトコルでは、自動磁気分離法を使用します。磁気分離は非常に優れた手法です。表面マーカーに基づいて大量の細胞を迅速かつ費用対効果よく分離する必要がある場合は、必ず最後にフローサイトメトリーで結果を確認してください。AutoMax proセパレーターを準備し、プライミングを行う際は、すべてのボトルに適切な溶液が満たされていることを確認してください。装置の電源を入れます。初期化後、液体容器とカラムの状態を確認してください。すべてのシンボルが緑色になっている必要があります。次に、上部メニューバーから「separation（分離）」を選択し、続いて「wash（洗浄）」を選択します。次に、下部メニューバーのポップアップオプションから「rinse（リンス）」を選択し、「run（実行）」を選択してプライミングプロセスを開始します。プライミングプロセスが正常に完了すると、装置に分離準備完了が表示されます。ステータスメニューで、磁気標識した細胞が入った50 mLコニカルチューブを、適切なサイズの冷却チューブラックの行Aに配置します。次に、ネガティブ分画回収用の50 mLコニカルチューブを行Bに、ポジティブ分画回収用の15 mLコニカルチューブを行Cに配置し、サンプルから感度モードで標識標的細胞をポジティブ選択するための「POS cell S cell separation」プログラムを選択します。プログラムが開始されると、磁気標識された標的細胞はAutoMaxカラムに保持され、未標識の細胞は行Bのネガティブ分画回収チューブに放出されます。その後、磁石が後退し、標識標的細胞がチューブラックの行Cにあるポジティブ回収チューブに放出されます。濃縮後、trypan blueとヘモサイトメーターを用いて、GR1陽性分画およびGR1陰性分画を再計数します。次に、細胞を3%染色培地で1×10⁷ cells/mLから2×10⁷ cells/mLの密度で再懸濁し、適切にラベル付けしたFACSチューブに50 µLずつ分注します。フローサイトメトリーおよびシングルステイン補正のため、MAC-1およびDPI生存率染料で細胞を染色します。フローサイトメトリーによるデータ取得を行い、GR1陽性およびGR1陰性の割合を決定するとともに、AutoMaxおよび濃縮前後のMDSCの割合を比較します。膵腫瘍担がんマウスおよびナイーブマウスから脾臓を採取し、本ビデオ記事で説明した通りに単一細胞懸濁液に調製しました。MAC-1およびGR1蛍光標識抗体で表面染色したナイーブ白血球をフローサイトメトリーで解析したところ、こちらに示すように、AutoMax濃縮前はナイーブのMAC-1およびGR1陽性MDSCの割合は1.19%と非常に低い値でした。しかし、GR1陽性集団を濃縮した後、この細胞サブポピュレーションはナイーブマウスにおいて10.5%まで有意に増加し、腫瘍担がんマウスの25.3%に匹敵する割合となりました。この手順に続き、加速MDSC誘導、フローサイトメトリーを用いたin vivo養子移殖実験、定量リアルタイムPCR、ウェスタンブロッティングなどの他の手法を実施することで、MDSCの増殖、遊走、分化、および免疫応答の抑制に関与する分子メカニズムに関するさらなる疑問を明らかにすることができます。

preparation-myeloid-derived-suppressor-cells-mdsc-from-naive

Research

JoVE Journal

Medicine

医学

本稿では、腫瘍に浸潤する白血球の高度に精製された集団を単離するためのプロトコルについて説明します。このプロトコルは複雑な腫瘍組織から細胞を単離するための収率および純度を高めるためにミルテニーバイオテクプロトコルから構成されている。...

原発腫瘍から免疫細胞の分離

明確な樹状細胞サブセットは、リンパ器官に稀な集団として存在するため、免疫学的実験に十分な数と純度で単離することが困難です。ここでは、マウス脾臓樹状細胞の現在知られている主要なサブセットをすべて単離するための高効率、高収率の方法について説明します。...

マウスの樹状細胞サブセットの単離のための効率的かつ高収率方法

私たちは、PDCの機能研究のための狼瘡傾向マウスの骨髄から高純度の形質細胞様樹状細胞（pDC）を単離するために蛍光活性化セルソーティングを使用してプロトコルを報告しています。...

マウスの骨髄から形質細胞様樹状細胞の精製のために、蛍光活性化細胞選別

識別し、並べ替え (MAC および FACS) 蛍光と磁気の組み合わせを使ってマウスの骨髄から骨髄前駆細胞の 6 のサブセットを分離する方法を示します。このプロトコルは、体外培養の試金 (セルロースまたは液体文化)、養子の転送実験生体内RNA ・...

寡能性と系列拘束されたマウスの骨髄から骨髄前駆細胞の分離と同定

我々 は遺伝子組み換えの造血細胞の悪性の可能性を評価するために造血幹細胞移植 (造血幹細胞移植) の使用について説明します。造血幹細胞移植、マウス骨髄異形成症候群 (MDS) や白血病の新規治療法を評価するための大規模コホートの生成し同様、生体内で様々...

骨髄異形成症候群の起源を評価するために造血幹細胞移植の使用

ここで前の活性化 cd8 陽性の細胞毒性を調査するプロトコルについて述べるリアルタイム顕微鏡を介してアポトーシスがん細胞を検出することにより癌細胞に対して細胞の+ T。このプロトコルは、骨髄細胞による T 細胞抑制の背後にあるメカニズムを調査し、免疫抑制の骨髄系細胞の封鎖を介してT...

CD8 による培養腫瘍細胞のアポトーシスのリアルタイム検出+ T 細胞腫瘍浸潤骨髄細胞の免疫抑制機能を勉強するには

ここでは、柱状磁気活性化細胞選別を利用して、脱髄疾患の動物モデルにおける原発性ミクログリアを単離および精製するためのプロトコルを提示する。...

脱髄の動物モデルにおける磁気活性化細胞選別によるマウス原発性ミクログリアの単離

マウスの腫瘍浸潤リンパ球(TIL)をフローサイトメトリーを通じて養子細胞移植に利用する方法について説明します。このプロトコルは、同系膵臓がんマウスモデルにおける腫瘍に対するTILの特異的細胞毒性を検証することを目的としており、膵臓がんの養子細胞療法の開発に関する洞察を提供します。...

膵臓癌マウスモデルにおける腫瘍浸潤リンパ球のフローサイトメトリーに基づく単離と治療的評価

心筋組織の歪みのようなパラメータを測定するために正確で実用的な方法は、それが示されているので、その株が頻繁に使用されるパラメータEFより収縮不全のためのより高感度およびそれ以前のマーカーである、偉大な臨床的価値があります。...

特徴追跡を用いた磁気共鳴が派生心筋ストレインの評価

脳腫瘍開始細胞（BTICs）、幹細胞特性を有する異種腫瘍内の希少な細胞の同定は、ヒトの脳の腫瘍の病因に新たな洞察を提供しています。我々はBTICsを濃縮するために、特定の培養条件を改良しており、我々は日常的に、さらに、これらの集団を豊かにするためにフローサイトメトリーを使用しています。単一細胞RT-PCR法による自己再生アッセイおよび転写産物の解析が続いてこれらの単離された細胞で行うことができます。...

ソート幹細胞アッセイおよびフローの原発性脳腫瘍組織の処理

学ぶフローサイトメトリーとAutoMACSを用いたマウス脾臓由来ミエロイド系サプレッサー細胞（MDSC）の迅速な調製法。Gr-1陽性白血球を高収率で分離し、免疫学研究に応用可能です。

フローサイトメトリーおよび自動化された磁気活性化細胞選別（AutoMACS）を使用して、ナイーブ膵腫瘍を有するマウスからミエロイド系のサプレッサー細胞（MDSC）の調製

さらに動画を探す