低親和性細胞外受容体 - リガンド相互作用の検出のためのスケーラブルな親和性ベースの細胞外相互作用のスクリーニング（AVEXIS）

この手順の全体的な目標は、細胞認識プロセスに関与する新しい細胞外タンパク質、特に膜埋め込み受容体タンパク質を発見することです。AveXisのアプローチは、このクラスのタンパク質相互作用に典型的な非常に弱い相互作用親和性や、膜タンパク質が生化学的に操作しにくいという事実を回避するように設計されています。これは、まず、細胞表面受容体の細胞外領域の組換えタンパク質ライブラリーをコンパイルすることによって達成されます。

これは、モノマービオチン化ベイトとペンタマー酵素タグ付きプライズの両方と同様に、受容体のエクトドメイン領域を可溶性フラグメントとして産生するように発現プラスミドを設計することによって達成されます。2番目のステップは、相互作用スクリーニングの準備が整うようにタンパク質を発現および正規化することです。すべてのタンパク質は哺乳類細胞で産生され、ディス、硫化物、結合、グリコシル化などの翻訳後修飾が確実に追加されます。

プロトコールの重要なステップは、ライブラリ内のベイトタンパク質とプレイタンパク質がすべて閾値レベル内に正規化されていることを確認することです。次は、斬新なインタラクションのスクリーニングというエキサイティングな部分です。ベイツは、マイクロプレートの個々のウェルに配列され、その後、賞賛を使用して相互作用についてプローブされます。

次に、洗浄ステップが実行されます。最後のステップは、酵素の基質を添加して、ベイトタンパク質の配列に捕捉された賞賛を検出することです。最終的に、VEXスクリーニングの結果は、どのセルサーファー受容体が結合パートナーを形成することができ、したがって細胞間の認識およびコミュニケーションプロセスに関与している可能性があるかを示すことができます。

一般的なタンパク質抽出法のこの技術の主な利点は、酵母の2つのハイブリッドまたは生化学的精製など、細胞外タンパク質タンパク質相互作用を検出するように特別に設計されていることです。これは、膜につながれた受容体タンパク質間の新しい相互作用を発見するのに特に適しています。膜タンパク質は生化学的に操作が難しく、一般的にそれらのカウンター受容体相互作用は非常に弱いため、これらの相互作用を他の技術を使用して検出することは困難です。

この方法は、細胞が互いに認識し、通信する方法に関連する重要な質問に答えるのに役立ちます。分子レベルでは、卵子と精子の表面にどの受容体タンパク質が結合したのか、どの受容体リガンド相互作用が筋細胞の融合や神経堤形成などの細胞の挙動に関与しているのかなど、基本的な生物学的プロセスに関連する質問に答えるために使用できます。このアプローチの主な課題は、相互作用をスクリーニングするためのベイトとプレイのタンパク質ライブラリをコンパイルすることです。

また、餌と獲物のタンパク質がアッセイに必要な閾値レベル内で正常化されていることを確認することも非常に重要です。これにより、偽陰性と偽陽性の頻度が削減されます。私がこの方法を最初に思いついたのは、博士課程でCD 200細胞表面タンパク質の結合パートナーを特定しようとしていた

基本的に、私はこの特定の細胞表面受容体の結合パターンは何かという質問をしていました。今日でも?当時、これは技術的に難しい問題として残っていましたが、ヒトゲノムは完成間近であり、ゲノム内のすべての細胞表面受容体の完全なリストが手に入ったため、代わりに、この受容体タンパク質のセット内で技術的に相互作用できるものを求めることができることに気づきました。

これは答えるのがはるかに簡単な質問であり、AveXisはそれに答えるために開発した方法でした。ベイトおよび発現前ベクターのライブラリーが確立されたら、それらをHEC 2 9 3 E細胞にトランスフェクションする準備をし、まずトランスフェクションの前日に、50ミリリットルのフリースタイル2 9 3培地に250,000細胞/ミリリットルの密度で細胞を播種し、効率的なビオチンエレーションを確保する。餌タンパク質を生成するために使用される培地を補充し、餌タンパク質ではなく、d ビオチンを準備し、すべてのプレートを準備し、標準条件で細胞を一晩インキュベートします。

ビオチンは溶解度が低く、正確な溶液であるため、追加のビオチンを計量し、メディアに加えて翌日激しく振ることを好みます。50ミリリットルの培養細胞に25マイクログラムのベイトプラスミドまたはプレイプラスミドを適切なトランスフェクション試薬を使用してトランスフェクションし、ビオチン化ベイトをトランスフェクトします。ベイトは、収穫ごとに分泌型ELIタンパク質ビオチンリガーゼをコードするプラスミドと10対1の比率で構築されます。

トランスフェクションの5日後に、最初に重力3000倍で20分間遠心分離して細胞を淡白化し、次に0.22ミクロンのフィルターでS上清をろ過することにより、培養します。AveXisの主な特徴の1つは、組換えタンパク質が分泌されるため、閾値活性内に希釈または濃縮できることです。リコンビナントタンパク質の発現は最大4桁まで変動するため、ノーマライゼーションステップによりスクリーニングステップ中の偽陽性の発生が減少することがわかりました。

ベイトの正常化を開始するには、結合部位にストレプトするための結合のためのビオチン化ベイトタンパク質を競合するため、非結合型デビオチンを透析によって培地から除去する必要があります。組換えタンパク質の効果的な透析を確保するためには、透析チューブに過剰な表面積を提供することが重要であることがわかりました。通常、透析量に実際に必要な量の2〜3倍のチューブを提供します。

24時間にわたって、透析を行った後、PBSなどの適切な緩衝液に対して餌を広範囲に透析した。ELIZAは、BSAを含むPBSTで連鎖球菌をコードしたマイクロTプレートのウェルを15分間ブロックすることから始まります。その間、きれいなプレートで、PBSTの餌タンパク質を2%BSAで4回1〜3希釈します。

15分間のインキュベーション後、希釈液を連鎖球菌TTRコードプレートに移し、1時間後にプレートを室温で1時間インキュベートし、ウェルを洗浄し、次にそれぞれに、100マイクロリットル/ミリリットルOX 68あたり2マイクログラムをよく加えます。プレートを室温でさらに1時間インキュベートします。2回目のインキュベーション後、別の洗浄シリーズを行い、プレートに抗米国アルカリホスファターゼをロードします。

プレートを室温で3時間インキュベートします。次に、プレートをPBSTで3回洗浄し、最後にPBSを洗浄します。残留洗剤を除去するには、1時間後にジエタノールアミン緩衝液に1ミリグラムあたり1ミリグラムの基質1 0 4を100マイクロリットル加えます。.

室温で吸光度を4 0 5ナノメートルと測定し、4つの異なる透析ベイトスーピネートの希釈シリーズを、抗CD4タグモノクローナル抗体を使用してElizaによって検出した。希釈されていない発現ベイトタンパク質が、連鎖球菌特異的ENCコーティングプレートのすべてのビオチン結合部位を飽和させるのに十分でない場合は、Vivaスピン濃縮器を使用してタンパク質を濃縮します。それ以外の場合は、ベイトタンパク質をPBSTで2%BSAで希釈した濃度で使用します。

これは、アッセイのビオチン結合部位を飽和させるのに十分です。βラクタマーゼ酵素活性を用いて、プレタンパク質が発現する相対レベルを定量化します。まず、パラタンパク質をPBST 2%BSAバッファーに含むすり酸の希釈系列を作成します。

次に、プレートにロードされた60マイクロリットルの亜硝酸ステピン溶液に20マイクロリットルの希釈液を加えます。すぐにプレートをプレートリーダーに移し、遠心濃縮器または2%BSAでPBSTを希釈して、次の20分間、1分に1回4〜85ナノメートルの吸光度を測定します。サンプルの最終濃度を、アッセイ内のすべてのニトロを約7分で加水分解するように設定します(これは、1分あたり約2 olのニトロ代謝回転です)。

AveXisのスクリーニングを開始するには、連鎖球菌TAVR ENCコーティングされたプレートをPBSTで洗浄し、ペーパータオルでプレートを軽くたたいて乾かします。次に、BSAを含むPBSTを各ウェルに加え、プレートを30分間インキュベートします。これにより、偽のタンパク質結合部位がブロックされます。

それぞれ内で、シンク上でプレートをスマートにフリックしてブロッキング溶液をウェルで除去し、100マイクロリットルの正規化ビオチン化モノマーベイトを適切なウェルに加えます。プレートを室温で1時間インキュベートします。次に、もう一度フリックして餌のサンプルをプレートから取り出し、PBSTで3回洗い流します。

その後、3回目の洗濯後にタップして乾かします。次に、正規化された五量体の獲物コンストラクトを100マイクロリットルを各ウェルに加え、プレートを室温で1時間インキュベートします。1時間後、プレートをPBSTでさらに3回洗浄し、最後にPBSのみで洗浄します。

最後に、60マイクロリットルの亜硝酸7溶液を各ウェルに加え、プレートを室温で2時間インキュベートするか、できればプレートを4°Cで16時間インキュベートします。翌日には、ポジティブなインタラクションが赤に変わります。視覚的な記録のためにプレートの写真を撮り、プレートリーダーを使用して4 85ナノメートルの吸光度で反応を定量化します。

AveXisのスクリーニング反応開始から約10分後、抗体を介した獲物捕獲制御とポジティブ制御の相互作用の両方に黄色から赤色への色の変化が見られました。この色の変化は、基質中の亜硝酸の加水分解を示しています。このタイムスケールでは、いくつかの肯定的な相互作用が観察されますが、ほとんどは現れるまでに数時間かかりました。

通常、約 0.4 から 0.6% の陽性のヒット率が観察されています。タンパク質ライブラリーが調製されると、この手法のスクリーニング部分を迅速に行うことができます。相互作用を特定した後、1日で最大12枚のプレートをスクリーニングすることは可能です。

最も重要な次のステップは、まず、新鮮で独立したタンパク質調製物を使用して相互作用を繰り返すことができることを示すことです。次に、相互作用が餌の獲物の向きに依存しないかどうか、つまり、往復できるかどうかを常に判断します。これには、ベイトベクタードメインを獲物ベクターにクローニングすること、またはその逆のクローニングが含まれます。

反復および相互の相互作用は高い信頼性と見なされ、常に正であることが示されています。表面プラズマ共鳴などの他の技術を使用して、共鳴中の表面プラズマを使用して、再識別した相互作用をさらに検証するのが好きです。重要なことに、これは、精製された2つの成分が直接相互作用できること、また、結合が座っていること、したがって特異的であることを示すためにも使用できることを実証します。