Name: 低親和性細胞外受容体 - リガンド相互作用の検出のためのスケーラブルな親和性ベースの細胞外相互作用のスクリーニング（AVEXIS） (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: 学ぶAVEXIS法による細胞外受容体とリガンドの弱い相互作用の検出方法。哺乳類細胞で発現させたタンパク質ライブラリーを用いて、膜タンパク質間の新規相互作用を高スループットでスクリーニングし、細胞認識メカニズムを解明する。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この作品は、ウェルカムトラスト助成番号[077108]によってサポートされていましたGJWに授与されました。

<ol><li>Fagerberg, L., Jonasson, K., von Heijne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+the+human+membrane+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Prediction of the human membrane proteome.</a> Proteomics. 10, 1141-1141 (2010).</li>
<li>Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+initiation+in+biological+systems%3A+the+properties+and+detection+of+transient+extracellular+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+bioSystems%22%5BJournal%5D)">Signal initiation in biological systems: the properties and detection of transient extracellular protein interactions.</a> Molecular bioSystems. 5, 1405-1405 (2009).</li>
<li>Bushell, K. M., Sollner, C., Schuster-Boeckler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+screening+for+novel+low-affinity+extracellular+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+research%22%5BJournal%5D)">Large-scale screening for novel low-affinity extracellular protein interactions.</a> Genome research. 18, 622-622 (2008).</li>
<li>Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+and+high-throughput+recombinant+protein+production+by+transient+transfection+of+suspension-growing+human+293-EBNA1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells.</a> Nucleic acids research. 30, e9-e9 (2002).</li>
<li>Bendtsen, J. D., Nielsen, H., von Heijne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Prediction+of+Signal+Peptides%3A+SignalP+3.0%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Improved Prediction of Signal Peptides: SignalP 3.0.</a> Journal of molecular biology. 340, 783-783 (2004).</li>
<li>Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+transmembrane+protein+topology+with+a+hidden+markov+model%3A+application+to+complete+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Predicting transmembrane protein topology with a hidden markov model: application to complete genomes.</a> Journal of molecular biology. 305, 567-567 (2001).</li>
<li>Brown, M. H., Barclay, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+immunoglobulin+and+scavenger+receptor+superfamily+domains+as+chimeric+proteins+with+domains+3+and+4+of+CD4+for+ligand+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+engineering%22%5BJournal%5D)">Expression of immunoglobulin and scavenger receptor superfamily domains as chimeric proteins with domains 3 and 4 of CD4 for ligand analysis.</a> Protein engineering. 7, 515-515 (1994).</li>
<li>Wright, G. J., Puklavec, M. J., Willis, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoid%2Fneuronal+cell+surface+OX2+glycoprotein+recognizes+a+novel+receptor+on+macrophages+implicated+in+the+control+of+their+function%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Lymphoid/neuronal cell surface OX2 glycoprotein recognizes a novel receptor on macrophages implicated in the control of their function.</a> Immunity. 13, 233-23 (2000).</li>
<li>Dustin, M. L., Golan, D. E., Zhu, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+affinity+interaction+of+human+or+rat+T+cell+adhesion+molecule+CD2+with+its+ligand+aligns+adhering+membranes+to+achieve+high+physiological+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Low affinity interaction of human or rat T cell adhesion molecule CD2 with its ligand aligns adhering membranes to achieve high physiological affinity.</a> The Journal of biological chemistry. 272, (1997).</li>
<li>Wright, G. J., Martin, S., Bushell, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+identification+of+transient+extracellular+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+transactions%22%5BJournal%5D)">High-throughput identification of transient extracellular protein interactions.</a> Biochemical Society transactions. 38, (2010).</li>
<li>de Wildt, R. M., Tomlinson, I. M., Ong, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+receptor-ligand+pairs+by+capture+of+long-lived+multivalent+interaction+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Isolation of receptor-ligand pairs by capture of long-lived multivalent interaction complexes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, (2002).</li>
<li>Jiang, L., Barclay, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+leucocyte+surface+protein+interactions+by+high-throughput+screening+with+multivalent+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Identification of leucocyte surface protein interactions by high-throughput screening with multivalent reagents.</a> Immunology. 129, 55-55 (2010).</li>
<li>Urech, D. M., Lichtlen, P., Barberis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+growth+selection+system+to+detect+extracellular+and+transmembrane+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">Cell growth selection system to detect extracellular and transmembrane protein interactions.</a> Biochimica et biophysica acta. 1622, 117-117 (2003).</li>
<li>Voulgaraki, D., Mitnacht-Kraus, R., Letarte, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivalent+recombinant+proteins+for+probing+functions+of+leucocyte+surface+proteins+such+as+the+CD200+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Multivalent recombinant proteins for probing functions of leucocyte surface proteins such as the CD200 receptor.</a> Immunology. 115, 337-337 (2005).</li>
<li>Wojtowicz, W. M., Wu, W., Andre, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vast+repertoire+of+Dscam+binding+specificities+arises+from+modular+interactions+of+variable+Ig+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A vast repertoire of Dscam binding specificities arises from modular interactions of variable Ig domains.</a> Cell. 130, 1134-1134 (2007).</li>
<li>Martin, S., Sollner, C., Charoensawan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+Large+Extracellular+Protein+Interaction+Network+and+Its+Resolution+by+Spatiotemporal+Expression+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Construction of a Large Extracellular Protein Interaction Network and Its Resolution by Spatiotemporal Expression Profiling.</a> Mol. Cell. Proteomics. 9, 2654-2654 (2010).</li>
<li>Crosnier, C., Bustamante, L. Y., Bartholdson, S. J., Bei, A. K., Theron, M., Uchikawa, M., Mboup, S., Ndir, O., Kwiatkowski, D. P., Duraisingh, M. T., Rayner, J. C., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basigin+is+a+receptor+essential+for+erythrocyte+invasion+by+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Basigin is a receptor essential for erythrocyte invasion by Plasmodium falciparum.</a> Nature. 480, 534-537 (2011).</li>
<li>Sollner, C., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+surface+interaction+network+of+neural+leucine-rich+repeat+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">A cell surface interaction network of neural leucine-rich repeat receptors.</a> Genome biology. 10, R99-R99 (2009).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

生きている細胞はin vivoで観察された場合、その細胞膜は非常に動的な挙動を示す：彼らが連絡して、彼らの隣人2と通信する際の拡張と後退膜プロセス。これらの接点の多くを仲介する細胞膜に埋め込まれた受容体タンパク質間の物理的相互作用は、この非常に運動性の動作を許可するように非常に弱いように進化してきました。それは50μMとして弱いように単量体の相互作用の強さは非常に2,10に挑戦する新たな相互作用を検出できます生理的受容体密度が9で自発的な相互作用を駆動するのに十分であることと推定されている。低い偽陽性率でスケーラブルな方法で実装することができるタンパク質の相互作用：ここで説明しAVEXISメソッドは一時的な細胞外タンパク質を検出する感度の高い方法を提供します。他のスケーラブルな方法は、11月15日細胞の相互作用を検出するために開発されているが、AVEXISの一つの利点は、そのような餌と捕食活動などの実験パラメータが低い偽陽性率3を維持しながらも（T 1/2≤0.1秒）の相互作用の弱いを検出するために定量化されていることです。さらに、合理化された堅牢な試料調製手順は、他のアッセイよりもはるかに大規模に実装するために、このアッセイを有効にしていると我々は最近〜16500潜在的な相互作用16歳以上の合計体系的相互作用の画面を説明してきました。 アッセイは、可溶性の組換えタンパク質断片を発現させることが可能となっている任意のタンパク質を実行することができます。したがって、これはそのようなI型、GPI-結合及び分泌タンパク質のN末端シグナルペプチドを含むタンパク質が含まれています。我々は最近、今私たちが餌17とタイプIIのタンパク質を発現することができますベクトルのスイートを設計しました。アッセイは、一般的に、イオントランスポーターとして、マルチパスの膜タンパク質には適していませんsまたはポンプが正常に細胞膜のコンテキストの外側で折られることはほとんどありませんので。我々は、異なる様々なシステムにこれを適用していると正常ゼブラフィッシュ3,16,18、ヒト、マウス、およびPから細胞外タンパク質を表明している対話画面での熱帯熱マラリア 。 AVEXIS画面を設定するために必要なリソースの面で、我々は重大なボトルネックが選定、建設、発現プラスミドの完全なシーケンスであることを見出した。メソッドのこの側面は、〜100餌と獲物の構造を作るために年に取ることができますが、遺伝子合成の減少コストで、我々は現在、市販プロジェクトのこの側面をアウトソーシング好む。大揺れ組織培養インキュベーター（我々はINFORS HT Multitronセルを使用してください）​​と一緒に哺乳動物発現系は発現し、約100餌と獲物タンパク質月までに正規化する単一の研究者を可能にします。タンパク質が生成し、s、正規化されたら、相互作用のためにcreeningする便利な一日あたり処理されている12までの96ウェルプレートで迅速です。我々は、タンパク質のような大規模な数の生産を容易にするために開発されていることを唯一のオーダーメイドの装置が並列に0.22μmフィルターを通して5上清に渡すために使用されている圧縮空気駆動型ピストンです。 これらの相互作用のいくつかは3を検出することができますが、文献（偽陰性）から予想される相互作用に比べ見逃されるかもしれない相互作用のメインクラスは、同種の相互作用があります。予想される相互作用が検出されない場合には、私たちは、これがその後固定化した餌のタンパク質との相互作用を防ぐことができ、さらに餌タンパク質による同種の相互作用の形成（獲物 &quot;マスキング&quot;効果）によるものであると信じています。相互作用が検出された周波数は、スクリーニングされている蛋白質ライブラリのコンテンツに依存します。読者へのガイド&gt; 30の画面として、ゼブラフィッシュ免疫グロブリンスーパーファミリー内の000の相互作用は、188陽性の結果- 0.6パーセント3,16,18の周波数。つまり、結合タンパク質のいずれかの餌として存在するかどうかにかかわらず、同じ相互作用を検出することができます。任意の正のヒットを確認するために実行することができます非常に迅速なチェックでは、相互作用は、両方の餌 - 捕食の方向で検出することができるかどうかを判断することですまたは獲物。我々はこの往復動作を観察したときは、バインディングが続いて表面プラズモン共鳴を用いたタンパク質の精製直接飽和結合を示すことにより、特定であることが示されている。それは我々が人工的に餌のタンパク質をpentamerisingによって結合親和性を高めるために、我々は定量的に相互作用強度を比較するための適切なアッセイを考慮していないことを強調する必要があります。相互作用の生物物理学的結合パラメータを取得するために我々は、単量体蛋白質と表面プラズモン共鳴を使用しています。最後に、かつての相互作用が同定された、ハイアッセイのGHスループットの性質は、そのような抗体または相互作用をブロックする小分子などの試薬をスクリーニングするアッセイ法を適応することが比較的容易になります。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> 猫。数 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>フリースタイルメディア</td><td>インビトロジェン</td><td> 12338018 </td><td></td></tr><tr><td>ニトロセフィン</td><td>カルビオケム</td><td> 484400 </td><td></td></tr><tr><td> SAコーティングされたマイクロタイタープレート</td><td>ヌンク</td><td> 734-1284 </td><td></td></tr><tr><td> OX68抗体</td><td> AbDSerotec </td><td> MCA1022R </td><td></td></tr><tr><td>透析チューブ</td><td>ピアース</td><td> PN68100 </td><td></td></tr><tr><td>ポリミキシンB </td><td>シグマ</td><td> P4932 </td><td></td></tr><tr><td> D-ビオチン</td><td>シグマ</td><td> B4639-5G </td><td></td></tr><tr><td>基板-104 </td><td>シグマ</td><td> 1040-506 </td><td></td></tr><tr><td> Vivaspin-20遠心コンセントレータ</td><td>縫工筋</td><td> VS2002 </td><td></td></tr><tr><td> 0.22μmのフィルター</td><td>ナルゲン</td><td> 190-2520 </td><td></td></tr></tbody></table>

低親和性細胞外受容体 - リガンド相互作用の検出のためのスケーラブルな親和性ベースの細胞外相互作用のスクリーニング（avexis）

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

細胞外タンパク質の分泌や膜繋留タンパク質間のタンパク質相互作用は、細胞間の通信を開始し、多細胞生物の中で凝集を確保するため、両方のために重要である。細胞の相互作用を形成すると予測タンパク質はヒトの遺伝子1の約4分の1でエンコードされていませんが、その重要性と豊かさにもかかわらず、これらのタンパク質の大部分は結合パートナーをまとめました。主に、これは彼らの生化学的な難しによるものです。膜に埋め込まれたタンパク質は、それらのネイティブなコンフォメーションに可溶化することが困難であり、構造的に重要な翻訳後修飾が含まれています。また、受容体タンパク質との相互作用の親和性は、しばしば多くの一般的に使用される高スループットの方法2でそれらの検出を排除し、極めて低い相互作用の強さ（半減期&lt;1秒）によって特徴付けられる。 ここでは、アッセイ、AVEXIS（親和性ベースの細胞外を記述する低い偽陽性率は3で、非常に弱いタンパク質相互作用の検出（T 1/2≤0.1秒）を有効にするこれらの技術課題を克服LARインタラクション画面）。アッセイは、通常、便利なマイクロタイタープレートフォーマットの相互作用（図1）の何千の体系的なスクリーニングを有効にするには、ハイスループット形式で実装されています。それは相互作用をスクリーニングするためにその中に細胞表面の受容体または分泌タンパク質の細胞外ドメインのフラグメントを含む可溶性組換えタンパク質ライブラリーの生産に依存しているため、このアプローチでは、タイプに適しているI、II型、GPIアンカー型細胞表面受容体と分泌このようなイオンチャネルやトランスポーターとして、マルチパスの膜タンパク質のタンパク質ではなく。 組換えタンパク質のライブラリは、そのようなglycosylaなどの重要な翻訳後修飾を確保するために、便利な高レベルの哺乳類発現系4を使用して生成されまするとジスルフィド結合が追加されます。発現した組換えタンパク質が培地中に分泌され、二つの形式で生成されます。スクリーニングに適したストレプトアビジンでコーティングされた固相上に捕捉し、pentamerised酵素タグを付けることができ、ビオチン化餌（β-ラクタマーゼ）餌食。餌と獲物タンパク質は、従来のELISA（図1）に似て、それらの間の直接的な相互作用を検出するためにバイナリ形式でお互いに提示されます。捕食中のタンパク質のpentamerisationは軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（COMP）からペプチド配列によって達成し、それにより検出されるにも非常に一時的な相互作用を有効にするには、重要な親和性の向上を提供する外部ドメインの局所濃度を増加させています。餌とスクリーニングの前に所定のレベルに獲物の両方の活動を正規化することによって、我々は0.1秒の単量体の半減期を持つ相互作用が低い偽陽性率3で ​​検出できることが示されている。

AVEXISは、細胞認識のプロセスに関与する新規細胞外受容体 - リガンドペアの体系的に画面に開発した高スループット·タンパク質相互作用アッセイである。これは特に、他の高スループットアプローチを用いて識別することが困難である一時的なタンパク質相互作用を検出するように設計されています。

低親和性細胞外受容体 - リガンド相互作用の検出のためのスケーラブルな親和性ベースの細胞外相互作用のスクリーニング（AVEXIS）

細胞外タンパク質間相互作用：分泌タンパク質または膜結合タンパク質間の相互作用は、細胞間コミュニケーションの開始および...の両方にとって極めて重要である。

この手順の全体的な目的は、細胞認識プロセス、特に膜埋め込み型受容体タンパク質に関与する新しい細胞外タンパク質相互作用を発見することです。AveXisアプローチは、この種のタンパク質相互作用に特有の非常に弱い相互作用親和性と、膜タンパク質の生化学的な操作が困難であるという事実に対処するように設計されています。これは、まず細胞表面受容体の細胞外領域のリコンビナントタンパク質ライブラリを構築することによって達成されます。これは、受容体のエクトドメイン領域を、モノマーのビオチン化ベイトおよびペンタマーの酵素タグ付きプレイズの両方として、可溶性断片として産生する発現プラスミドを設計することで達成されます。第2のステップは、タンパク質を発現させ、相互作用スクリーニングに備えて標準化することです。すべてのタンパク質は、ジスルフィド結合や糖鎖付加などの翻訳後修飾が付加されることを確実にするため、哺乳類細胞で産生されます。プロトコルの極めて重要なステップは、ライブラリ内のベイトタンパク質とプレイタンパク質がすべて閾値レベル内に正規化されていることを確認することです。次に、最も重要な段階である新規相互作用のスクリーニングを行います。ベイトをマイクロタイタープレートの各ウェルに配置し、プレイを用いて相互作用を探索します。次に、洗浄ステップを行います。最終ステップでは、ベイトタンパク質の配列上に捕捉された獲物を検出するため、酵素の基質を添加します。最終的に、VEXスクリーニングの結果により、どの細胞表面受容体が結合パートナーを形成でき、したがって細胞間の認識および通信プロセスに関与している可能性があるかを示すことができます。酵母ツーハイブリッド法や生化学的な精製法などの一般的なタンパク質抽出法に対する本手法の主な利点は、細胞外のタンパク質間相互作用を検出するために特化して設計されている点にあります。本手法は、特に膜結合型受容体タンパク質間の新たな相互作用の発見に適しています。膜タンパク質は生化学的な操作が困難であり、また通常、その受容体との相互作用は極めて弱いため、他の手法ではこれらの相互作用を検出することが困難です。この手法は、細胞がどのように互いを認識し、通信しているかという重要な疑問を解明するのに役立ちます。分子レベルでは、卵子や精子の表面に提示されたどの受容体タンパク質が互いに結合したか、あるいは心筋細胞の融合や神経堤の形成といった細胞挙動にどの受容体リガンド相互作用が関与しているかなど、基礎的な生物学的プロセスに関する疑問の解決に利用できます。このアプローチにおける主な課題は、相互作用をスクリーニングするための「ベイト・アンド・プレイ（bait and pray）」タンパク質ライブラリを構築することです。また、ベイトタンパク質とプレイタンパク質が、アッセイで要求される閾値レベル内で標準化されていることを確認することが非常に重要です。これにより、偽陰性および偽陽性の頻度を低減できます。私は博士課程において、細胞表面タンパク質CD 200の結合パートナーを同定しようとしていた際に、初めてこの手法を考案しました。本質的に、私はこの特定の細胞表面受容体の結合パターンはどうなっているのか、という問いを立てていました。今日においても、これは技術的に回答が困難な問いであり続けています。しかし、当時はヒトゲノムの解読がほぼ完了しつつあったため、ゲノム上のすべての細胞表面受容体の完全なリストが手に入ったことで、これらの受容体タンパク質のセットの中で、技術的にどのものが相互作用し得るかという問いに改めてアプローチできることに気づきました。これは非常に答えを出しやすい問いであり、AveXisはその問いに答えるために私たちが開発した手法です。ベイトおよびプレイの発現ベクターライブラリが構築されたら、それらをHEK 293E細胞にトランスフェクトする準備をします。まず、効率的なビオチン化を確実にするため、トランスフェクションの前日に、細胞を50 mLのFreeStyle 293培地に250,000 cells/mLの密度で播種します。プレイタンパク質ではなく、ベイトタンパク質を産生するために使用する培地には、D-ビオチンを添加してください。すべてのプレートを準備した後、細胞を標準的な条件下で一晩インキュベートします。ビオチンは溶解度が低く、正確な溶液調製が困難であるため、追加のビオチンを秤量して培地に加え、翌日まで激しく振とうする方法を推奨します。50 mLの培養細胞に、適切なトランスフェクション試薬を用いて、25 µgのベイトまたはプレイプラスミドをトランスフェクションし、ビオチン化ベイトを生成させます。この際、ベイト構築物と分泌型ELIタンパク質ビオチンリガーゼをコードするプラスミドを10:1の比率で共トランスフェクションし、回収します。細胞を 3000 ×g で 20 分間遠心分離してペレット化し、次に上清を 0.22 µm フィルターでろ過することで、トランスフェクションから 5 日後の培養液を回収します。AveXis の主な特徴の一つは、リコンビナントタンパク質が分泌されるため、閾値内の活性にまで希釈または濃縮できることです。リコンビナントタンパク質の発現量は最大 4 桁まで変動することが分かっているため、この標準化ステップによってスクリーニング工程における偽陽性の発生を減少させることができます。ベイトの正規化を開始するには、非結合のデビオチンがストレプトアビジンの結合部位においてビオチン化ベイトタンパク質と競合するため、透析によって培地から除去する必要があります。まず、ベイトを透析チューブに封入します。組換えタンパク質の効果的な透析を行うには、透析チューブの表面積を十分に確保することが重要であることが分かっています。通常、透析させる液量に対して実際に必要とされる量の2〜3倍のチューブを使用します。透析後、24時間にわたり、PBSなどの適切なバッファーを用いてベイトを十分に透析させます。次に、BSAを含むPBSTでstrepコード化マイクロプレートのウェルを15分間ブロッキングし、ELISAを開始します。その間に、きれいなプレートを用いて、2% BSA含有PBST中でベイトタンパク質の1/3連続希釈を4段階で調製します。15分間のインキュベーション後、希釈液をstrep TTRコード化プレートに移し、室温で1時間インキュベートします。1時間後、ウェルを洗浄し、各ウェルに2 µg/mLのOX 68を100 µLずつ加えます。プレートを室温でさらに1時間インキュベートします。2回目のインキュベーション後、再度洗浄を行い、プレートに抗USアルカリホスファターゼを充填します。プレートを室温でさらに1時間インキュベートします。次に、プレートをPBSTで3回洗浄し、最後にPBSで洗浄します。残留した界面活性剤を除去するため、1時間後にジエタノールアミンバッファーで希釈した1 mg/mLのsubstrate 1 0 4を100 µL添加します。室温で405 nmの吸光度を測定します。4種類の異なる透析済みベイト上清の希釈系列を、抗CD4タグモノクローナル抗体を用いたELISAにより検出しました。未希釈の発現ベイトタンパク質でストレプトアビジンコーティングプレートのすべてのビオチン結合部位を飽和させるのに不十分な場合は、Viva Spin濃縮器を用いてタンパク質を濃縮してください。それ以外の場合は、2% BSA含有PBSTで希釈したベイトタンパク質を使用してください。これは、アッセイのビオチン結合部位を飽和させるのに十分な量です。ベータラクタマーゼの酵素活性を用いて、前駆体タンパク質が発現している相対的なレベルを定量します。まず、パラプロテインを含む上清をPBST 2%BSAバッファーで希釈し、希釈系列を作成することから始めてください。次に、希釈液 20 µL を、プレートに分注した nitrous stepin 溶液 60 µL に加えます。直ちにプレートをプレートリーダーに移し、遠心濃縮器または 2% BSA 含有 PBST による希釈を用いて、その後 20 分間、1 分ごとに 485 nm の吸光度を測定します。アッセイ中のすべての nitros を約 7 分で加水分解するようにサンプルの最終濃度を設定します。これは、1 分あたり約 2 ol nitros turnover に相当します。strep TAVR ENC コーティングプレートを PBST で洗浄し、ペーパータオルで軽く叩いて水分を除去することで、AveXis スクリーニングを開始します。次に、各ウェルに BSA 含有 PBST を加え、プレートを 30 分間インキュベートします。これにより、非特異的なタンパク質結合部位をブロックします。各ウェルから、プレートをシンクの上で軽く弾いてブロッキング液を除去し、適切なウェルに100 µLの規格化されたビオチン化モノマー状ベイトを添加します。プレートを室温で1時間インキュベートします。その後、再びプレートを弾いてベイトサンプルを除去し、PBSTで3回洗浄します。3回目の洗浄後、軽く叩いて水分を取り除きます。次に、各ウェルに100 µLの正規化されたペンタマープレイコンストラクトを加え、プレートを室温で1時間インキュベートします。1時間後、PBSTでさらに3回洗浄し、最後にPBSのみで洗浄します。最後に、各ウェルに60 µLのnitrous seven溶液を加え、プレートを室温で2時間、または好ましくは4 °Cで16時間インキュベートします。翌日、陽性相互作用は赤色に変化します。視覚的記録のためにプレートの写真を撮影し、その後プレートリーダーを用いて吸光度485 nmで反応を定量します。AveXisスクリーニング反応の開始から約10分後、抗体介在性プリキャプチャーコントロールおよびポジティブコントロール相互作用の両方で、黄色から赤色への色変化が観察されました。この色変化は、基質中の亜硝酸の加水分解を示しています。この時間スケールで観察可能なポジティブな相互作用もありますが、ほとんどの場合は出現までに数時間を要しました。通常、0.4%から0.6%程度のポジティブヒット率が観察されています。タンパク質ライブラリーが調製されれば、本手法のスクリーニング部分は迅速に行うことができます。相互作用が確認された後は、1日で最大12プレートまでスクリーニングすることが十分に可能です。最も重要な次のステップは、まず、新しい独立したタンパク質調製物を用いて、この相互作用が再現可能であることを示すことです。次に、相互作用がベイト（餌）とプレイ（獲物）の方向性に依存しないこと、つまり、相互的に再現可能かどうかを常に確認します。これには、ベイトベクターのドメインをプレイベクターにクローニングし、またその逆を行う操作が含まれます。繰り返し再現され、且つ相互的に確認された相互作用は信頼性が高いと考えられ、常にポジティブな結果が示されています。表面プラズモン共鳴（SPR）などの他の手法を用いて、再同定した相互作用をさらに検証しています。重要な点として、これにより2つの精製成分が直接相互作用できることが証明され、また結合が飽和し、したがって特異的であることも示すことができます。

avidity-based-extracellular-interaction-screening-avexis-for-scalable

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このビデオでは、マイクロパターン化表面を使用することにより、タンパク質 -...

マイクロパターン化表面でのタンパク質間相互作用の in vivo検出

このビデオでは、ビーズベースの近接アッセイである増幅発光近接均質アッセイを実演します。これは、均質なサイズのアクセプタービーズとドナービーズを利用し、相互作用する傾向がある2つのタンパク質で固定化され、タンパク質相互作用を阻害する可能性のある小分子をスクリーニングします。...

Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay:タンパク質間相互作用を阻害する小分子をスクリーニングするためのビーズベースの近接アッセイ

Peptideアレイスクリーニングは、タンパク質間相互作用部位を同定するためのハイスループットアッセイです。これにより、標的タンパク質の複数の相互作用をマッピングすることができ、タンパク質を標的とする阻害剤の部位を同定する方法として役立つことができます。ここでは、ペプチドアレイのスクリーニングと解析のためのプロトコールについて説明します。...

ペプチド配列の使用タンパク質間相互作用部位を同定

提示されたプロトコルは、リガンド-受容体相互作用の迅速な調査のための酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）ベースの技術を2つ記述しています：最初のアッセイは、リガンドと受容体間の解離定数の決定を可能にします。2番目のアッセイは、リガンド-受容体相互作用のブロッキングペプチドの迅速なスクリーニングを可能にします。...

ELISAベースの結合と競争法は急速にリガンド - 受容体相互作用を決定するために、

バイオパニング細菌の表示ライブラリは、抗体に堅牢な代替ペプチド親和性試薬の発見の実績のある手法です。半自動ソーティング法を本書は誤検知の発生を減らすバイオパニングを合理化します。ここでは、思考プロセスと候補者を評価し、下流の解析を最小限に適用される技術を示しています。...

結果菌株のペプチド親和性試薬の発見と解析のため細菌表示ライブラリの半自動バイオパニング

高スループットで新規受容体-リガンド相互作用の同定のため画面細胞外蛋白質のマイクロ アレイのプロトコルを紹介します。タンパク質マイクロ...

低親和性受容体-リガンド相互作用のハイスループット検出の細胞外タンパク質マイクロ アレイ技術

薬のターゲットの関与の測定、効果的な薬の開発と妥当性化学プローブの中心。ここでは、我々 は携帯電話熱シフト試金 (CETSA) のマイクロ プレート互換適応高コンテンツ...

付着性のセルのターゲット婚約を定量化するイメージングの高いコンテンツを使用してください。

本稿では、細胞外受容体とリガンドの相互作用を同定するためのゲノムスケール細胞ベースのスクリーニングアプローチについて述べる。...

ゲノムスケールCRISPR/Cas9遺伝子スクリーンを用いた細胞表面受容体同定

本研究は、薬物とペプチドの相互作用を同定するための戦略を提示することを目的とした。この戦略は、水晶結晶マイクロバランス(QCM)バイオセンサーに基づく薬物認識短いペプチドのバイオパンニングを含み、続いてタンパク質上の薬物認識および薬物結合部位の注釈のために得られた情報を定量的に評価するためのバイオインフォマティクス分析を行う。...

バイオセンサーベースの高スループットバイオパンニングおよびバイオインフォマティクス分析戦略による、薬物-タンパク質相互作用のグローバル検証

本プロトコルは、HA、S糖タンパク質、関連するハイブリッド型グリカン、および高マンノースオリゴ糖へのCV-N結合を調べるためのSPR結合アッセイのための新しいツールについて説明しています。SPRは、これらのグリカンに二量体または単量体CV-Nのいずれかを結合するためのKD...

表面プラズモン共鳴 による 抗ウイルス剤のエンジニアリング

この論文は、細胞外小胞サブセットの特性評価のためのスループットを向上させた新世代のマルチパラメトリック分析プラットフォームを提案します。この方法は、多重化されたバイオセンシング法と、原子間力顕微鏡による計量学的および形態力学的分析とラマン分光法の組み合わせに基づいており、マイクロアレイバイオチップにトラップされた小胞ターゲットを認定します。...

細胞外小胞サブセット解析のための多重化表面プラズモン共鳴イメージングチップ上のマルチモーダル解析プラットフォーム

学ぶAVEXIS法による細胞外受容体とリガンドの弱い相互作用の検出方法。哺乳類細胞で発現させたタンパク質ライブラリーを用いて、膜タンパク質間の新規相互作用を高スループットでスクリーニングし、細胞認識メカニズムを解明する。

低親和性細胞外受容体 - リガンド相互作用の検出のためのスケーラブルな親和性ベースの細胞外相互作用のスクリーニング（AVEXIS）

さらに動画を探す