Name: マウス肺胞マクロファージを採取し、無水物ナノ粒子により誘導される細胞活性化を評価する (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: 学ぶマウス肺胞マクロファージの採取と無水物ナノ粒子による細胞活性化評価法。気管露出、気管支肺胞洗浄、流式細胞計測を用いて免疫応答を解析し、ナノ材料の免疫調節可能性を探索する。

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著者らは、のためにアイオワ州立大学のフローサイトメトリー施設からの財政支援と博士ショーン·リグビーは、米国陸軍医学研究および資材コマンド（グラント番号W81XWH-09-1から0386までとW81XWH-10-1-0806）に感謝したいと思います彼の専門的なテクニカルサポートを提供しています。

1。肺洗浄を使用してマウスから肺胞マクロファージを（AMɸ）収穫<ol><li>このような実験着と使い捨て手袋、適切な眼の保護、適切な個人用保護具（P​​PE）を着用してください。 </li><li>収穫の開始前に完全なAMɸ（cAMɸ）培地を準備します。 Dulbelccoダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）の222.25 mLのペニシリン/ストレプトマイシン（ペン/連鎖球菌）溶液に、β-メルカプトエタノール（2 - メルカプトエタノール）を250μL、熱不活化ウシ胎児血清（FBS）を25 mLの2.5 mLを加える。 cAMɸ媒体が真空下で孔径0.2μmボトルトップフィルタを使用してフィルター滅菌する。 </li><li>安楽死のチャンバー内のCO 2窒息により健康なマウスを安楽死させる。 C57BL / 6マウス（6-8週齢）は、このプロジェクトの目的のために使用されていますが、この肺胞洗浄法は、マウスのいずれかの株に行うことができます。圧縮ガスシリンダーを使用して、チャンネルにマウスを置く前に1分間チャンバー内にガスを流すチャンバが完全にCO 2が充電されることを保証するためにオレンジ色に点灯します。マウスを安楽死させるために少なくとも1分間チャンバー内にマウスを置きます。さらに、1.4で説明したように、マウスの死亡を確認するために物理的な方法として、心臓穿刺を介して各マウスを放血させる。 </li><li>その背中の上にマウスを置く（背側）、70％エタノールでスプレー、胸骨を見つけて、腹部から30度の角度で、胸腔内に約50mm 23ゲージの針を（1 mLシリンジに接続されている）を挿入する。針の適切な配置と、それはマウスの大きさに応じて血液中の0.4から1 mLの間に収集することが可能でなければなりません。バイタルサインの停止のために動物を調べます。 </li><li>実験台の上に置き、マウス、その腹部（腹側）に横たわっているようにします。作業環境を滅菌するために70％エタノールでスプレーマウス。約半分マウスの背筋皮をつまむ。 70％エタノールで滅菌された解剖はさみを使用して、皮膚を​​通して小さな切開を行います。&lt;/ LI&gt; <li>切開の両側に皮をつかむと、マウスの頭蓋 - 尾軸に沿って反対方向に肌を引き出します。正しく完了したら、皮膚は、基礎となる枝肉から削除されます。 </li><li>マウスの首は現在公開され、筋肉や腺を表示する必要があります。慎重にその組織を切り取って、それによってマウスの喉頭、気管、食道を露出し、鉗子を使用して、マウスの前方に向かって引き出します。頸静脈または頸動脈を切断しないようにしてください。 </li><li>気管は、現在表示され、その周りの軟骨環を有する組織として識別できます。繊細な鉗子で気管を保持し、ゆっくりと持ち上げると背側に位置して食道から気管を分離します。 </li><li>いずれかが気管が喉頭に後方を保持している場所の前方に小さな切開を行います。切開は約45°度の角度でなされるべきである。これに後退からそれを防ぐことができますとしても、完全に、気管を横断するしないでください体腔。 </li><li>気管の内腔にカテーテルを挿入するための準備中に、滅菌PBSでトムキャットカテーテルを装着し1ccのシリンジを記入してください。鉗子を用いて気管を保持し、手でコントロールを向上させ、穏やかに気管切開部位に挿入し先端に近いカテーテルを保持します。穏やかに20mm程度気管にカテーテルを挿入します。もう一方の手を解放し、カテーテル管の周囲にある気管を掴む。 </li><li>カテーテルを装着し1 mLのシリンジを用いて、穏やかに肺に室温、滅菌したPBSの0.75 mLを注入し、PBSで穏やかに戻ってシリンジに吸引します。外部からの胸をマッサージしながら、このプロセスを3回繰り返します。カテーテルからシリンジを取り外し、15 mLの遠心チューブに洗浄液を分注する。新鮮なPBSの0.75 mLの注射器を充填し、カテーテルにシリンジを再接続した後、各マウスについて、手順1.9倍1.10を繰り返します。流体の回復はVO未満を取得し、部分的かもしれませんLUMEが注入された。複数のマウス由来の細胞を収集する場合、すべての肺lavagesが実行されるまで、氷の上で採取した細胞で15 mLのチューブを配置します。 </li></ol> 2。肺洗浄AMɸハーベストの処理<ol><li> 4時10分℃、250×gで肺胞洗浄液を遠心</li><li>バイオセーフティキャビネット内の適切な廃棄容器に無菌、上清をデカントを使用します。静かに試験管ラックの上部に遠心管を掻き集めることによって、細胞ペレットを再懸濁します。細胞を再懸濁するcAMɸ培地1 mLを加える。 </li><li>コー​​ルターカウンターバイアルにISOTON II希釈液の10 mLに細胞を20μLをピペッティングによりコールター粒子カウンタZ1を用いて細胞を列挙します。 、バイアルにZAP-oglobin II溶解試薬の3から4滴を加え穏やかに反転し3〜4倍して、細胞濃度を得るためにカウンターの上にサンプルバイアルをロードします。表示するには、2×10 4の希釈率でカウンタをプログラムしてくださいmL当たりの細胞数として細胞濃度。 </li><li> cAMɸ培地を用いmL当たり2.5×10 5細胞を希釈する。 </li><li> 6ウェル組織培養皿の各ウェルに2.5×10 5細胞/ mL 2 mLを分注します。 </li><li>細胞がウェルの底に付着できるようにするには、AMɸために6時間、5％CO 2雰囲気下37℃の加湿インキュベーター内にインキュベートし、培養皿を豊かにする。付着細胞を破壊しないように静かに上清を吸引除去する。 </li><li>非接着細胞および残骸を削除するには、滅菌PBS（カルシウムとマグネシウムは無料）を使用して、ウェルを洗浄します。各ウェルにcAMɸ培地2mlを追加します。 </li><li>覚せい剤を添加する前に、5％CO 2雰囲気下37℃の加湿インキュベーター内に一晩細胞をインキュベートします。この濃縮工程の後、細胞の約87％はマクロファージマーカーCD11bをとF4/80（ 図2c）に対して陽性である。 </li></ol> 3。 Polyanhydridの追加電子ナノ粒子およびコントロールトリートメント<ol><li>無水物の抗溶媒のナノカプセル化15を介してナノ粒子を作製する。このプロセスでは、ポリマーは塩化メチレンに溶解し、（4°C 25 mg / mLの濃度で）、ペンタン（比1:200塩化メチレン-20°C：ペンタン）で沈殿させた。 </li><li>滅菌は、正確にマイクログラムの量を測定することができますバランスに紙の重さを使用して無水物ナノ粒子を秤量する。 1.5 mlのマイクロ遠心チューブに粒子を追加します。 </li><li> cAMɸ冷たい氷の中にナノ粒子を再懸濁します。計算は、媒体のそれ以上の0.3 mLをナノ粒子の所望の濃度を得るために各ウェルに添加されるように作られています。ナノ粒子がウエルの培養に追加されるまで氷上で再懸濁粒子を保持します。 </li><li>前のAMɸ文化にナノ粒子を追加する、マイクロチップのベンチトップ超音波を用いた粒子を超音波洗浄します。 70％エタノールとwipinを噴霧してマイクロチップを殺菌超音波処理の前に滅菌キムワイプでg。チューブを氷上に保ちながら、30から45の10〜20ジュールで超音波洗浄します。肉眼的にナノ粒子懸濁液を観察します。粒子が十分に分散されていない場合は、懸濁液は、ナノ粒子が30から45秒のために再度超音波処理する前に、ポリマーのガラス転移温度以下であることを確認するには、1〜2分間氷上で設定することができます。この超音波処理ステップの目的は、十分に50:50 CPTEGとして、ナノ粒子を分散させることです。水性の環境にさらされた場合CPHナノ粒子が凝集してしまう傾向がある。しかし、ナノ粒子のいくつかの小さな凝集体は依然として懸濁液中に残ることがあります。 </li><li>ナノ粒子懸濁液は、（十分に分散する）氷上で保存すべきであり、時期尚早の表面侵食や凝集を防ぐために直ちに使用することができます。 </li><li>インキュベーターからAMɸおよびバイオセーフティキャビネット内の場所を含む培養皿を取り外します。メディ量から約45度の角度とピペットで傾斜プレートええと、その（それは0.3 mLを超えないようにしてください）​​ナノ粒子懸濁液に添加されます。培地を除去したときに接着細胞を乱すことがありません。 </li><li>渦前に、適切なウェルにそれを追加する簡単に無水物ナノ粒子懸濁液。特定のウェル（S）にナノ粒子懸濁液の量（以上0.3 mL）をピペットでいますが、混在させるピペッティングしていません。このアクションは、井戸からAMɸ付着を切り離すことができます。粒子は井戸の底に沈殿した細胞を連絡させていただきます。このレポートで説明されている研究のために、ナノ粒子の最終濃度AMɸと共培養し、125μg/ mLであった。その後の井戸と、所望の治療群に進みます。そのような培地のみと指定された井戸から200 ng / mLのリポポリサッカライド（LPS）などの正および負の対照群が含まれています。 </li><li> 48時間5％CO 2雰囲気下で37℃の加湿インキュベーターに培養皿を返します。私たちのlaboratorにおける運動の研究yはそれが発生する転写とタンパク質合成のための十分な時間を許可するように細胞表面マーカーの発現およびサイトカイン分泌の両方を評価するための最適な培養期間であることが48時間を示している。サイトカインの高いレベルは、拡張培養期間（すなわち、72時間）の間に蓄積されていますが、この時点で評価する細胞表面マーカーの発現はサイトカインの上昇の寄与によって混同することができます。観察表面マーカー発現の変化は、ナノ粒子自体の刺激に直接起因するとは限りません。 </li></ol> 4。フローサイトメトリーを用いてAMɸアクティベーションを評価する<ol><li>蛍光活性化セルソーティング（FACS）緩衝液（0.1％アジ化ナトリウムおよび0.1％ウシ血清アルブミン（BSA））0.1 Mリン酸は、従来のナノ粒子Oと共培養されたメッキマクロファージを採取する液（pH7.4）緩衝生理食塩水を準備します。rの覚せい剤。 </li><li>ブロッキングバッファーおよびモノクローナル抗体のワーキング溶液を調製。ブロックバッファを準備するには、FACS緩衝液中で、それぞれ、ラットIgG（Sigma）およびanti-CD16/32（ベイバイオサイエンス）に1 mg / mLと10μg/ mLで希釈します。メーカー推奨濃度またはユーザ最適化された濃度のいずれかにFACS緩衝液で表面マーカー抗体のパネルを希釈します。本研究で示された結果のため、表面マーカーパネルは、MHC II、CD86、CD40およびCIRE（CD209）に対する抗体で構成されています。マクロファージマーカーF4/80とCD11bに対する抗マウス抗体はまた、積極的にデータ解析時にマクロファージ表現型を識別するために、パネルに含まれています。近交系マウスは、しばしば彼らのMHC IIハプロタイプが異なるように、MHC II分子に対する抗体を選択する際には注意する必要があります。選択された抗体は、目的のマウス系統によって発現特定のMHC同種抗原と反応しなければなりません。 </li><li>ナノ粒子および/またはとのインキュベーションの48時間後覚せい剤、20分間氷上に静置細胞培養皿。プレートから付着したマクロファージを削除するには、穏やかに24センチメートルセルスクレーパーで井戸を落とす。 </li><li> 5 mLの血清学的ピペットを使用して、静かに、単一細胞懸濁液を生成するために上下に5回細胞と培地を吸引除去する。独立した5mLのポリスチレンチューブに個々のウェルの内容物をピペットように異なった実験的な治療から細胞を一緒に混合することはありません。 </li><li>各チューブへのFACS緩衝液2mlを追加します。 </li><li> 10分間、4℃で250×gで細胞のチューブを遠心します。 </li><li>試験管ラックの上部にチューブを掻き集めることにより上清をデカントし、残留液に静かに再懸濁し、細胞ペレット。 </li><li>モノクローナル抗体の非特異的結合を防ぐために、細胞の各チューブにブロッキングバッファー10μL（4.2で調製）を追加します。渦管と30分間氷上でインキュベートする。 </li><li>各チューブとincubに希釈したモノクローナル抗体の適切なボリュームを追加する15分間、氷上で暗闇の中で食べました。分析するサンプルが含まれているチューブは、polycromaticパネル（前の抗体の組み合わせの最適化、個々のラボで行われるべきである）の抗体の組み合わせを受信する必要があります。追加の制御グループが正しく個別に単一色を使用して標識した細胞に対応して標識されていない細胞の管を含む、フローサイトメーターで測定パラメータ、および補償管を設定するには、含まれるべきである。正しくフローサイトメトリー分析のためにゲートを設定するには、蛍光マイナスワン（FMO）のコントロールは、取得時に含まれるべきである。 FMOのコントロールは、それぞれのアイソタイプコントロールに置き換えられています1を除いてパネルに使用​​されるすべての蛍光標識抗体で標識した細胞である。正と負の集団（すなわち、単独で陽性対照刺激と培地で処理した細胞の別のアリコート）もFMOと補償制御管に含まれるべきである。 </li><li&gt;は、10分間4℃、250×gで各チューブ、ボルテックスと遠心℃にFACS緩衝液2 mLを追加します。 </li><li>上清をデカントし、試験管ラックの上部にチューブをかき集め、残留液に再懸濁し、細胞ペレット。 </li><li>抗体パネルは蛍光色素に直接結合しない抗体で構成されていますが、代わりにビオチンに結合している場合は、蛍光標識ストレプトアビジンは、表面マーカーを可視化するために必要とされる。このステップでは、希釈した蛍光標識ストレプトアビジンの適切な量を追加し、氷上で15分間、暗所でインキュベートします。 4.2のように、ストレプトアビジンは、製造元が推奨する濃度になるように、またはユーザが最適化されたものに希釈されます。この手順は、ビオチン化一次抗体を含むパネルが必要になります。 </li><li> 4.10で説明したように洗浄ステップを実行します。 </li><li>脱イオン水で固定1:3安定BDの適切な量を希釈します。しばらく静かにVOを各チューブに希釈固定液100μLを追加します。細胞の凝集を防ぐためrtexing。 °Cで約一週間のフローサイトメーターで買収する前にラベルを付け、固定した細胞を安定的に4℃で暗所に保存することができます。 </li></ol> 5。代表的なデータステップ3.1で作製したナノ粒子は、163の平均直径±24 nmであり、これまでの研究5,16で得られたものと一致する形態を持っていた。超音波処理の前後に溶液中でナノ粒子は、粒子の適切な分散を確保するために超音波処理の必要性を示すために、 図1に示されています。肺胞を介して得られる収穫AMɸsのフローサイトメトリー分析は、 図2に示されています。抗マウスCD11bを、抗マウスF4/80抗体と同様に対応するFMOコントロールの組み合わせで細胞を標識すると、さらに分析するためにAMɸsとゲーティングを識別し、バックグラウンドの標識を確立することができる。無水物と肺胞マクロファージの治療MHC II、CD40、CD86、およびCIRE（ 図3）の増加、平均蛍光強度で示すように、ナノ粒子は、活性化を高めます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3883/3883fig1.jpg" /> 図1 50:50 CPTEG：CPH（）は前にナノ粒子と超音波の（B）30秒後。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3883/3883fig2.jpg" /> 図2フローサイトメトリー（A）のAlexa Fluor®700抗CD11bとPE-Cy7 FMOコントロール、（B）のAlexa Fluor 700 FMO制御とPE-Cy7 anti-F4/80で標識された収穫肺胞マクロファージの分析と（C ）のAlexa Fluor®700抗CD11bとPE-Cy7 anti-F4/80。右上隅にある番号は、二重陽性細胞の割合を表します。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3883/3883fig3.jpg" /> 図3蛍光INTENの増加を示すヒストグラム50:50 CPTEGと肺胞マクロファージの共培養後、MHC II（）、CD40（B）、CD86（C）とCIRE（D）の表面発現のためにsity：CPH無水物は、48時間ナノ。ヒストグラムはAMɸFMOコントロールとしてラベルの結果を示している（ <img alt="グラフの1行目" src="/files/ftp_upload/3883/3883line1.jpg" /> ）、未処理のAMɸすべての細胞表面マーカーに対する抗体で標識された（ <img alt="グラフの3行目" src="/files/ftp_upload/3883/3883line3.jpg" /> ）とAMɸナノ粒子を培養し、すべての細胞表面マーカーに対する抗体で標識された（ <img alt="グラフの2行目" src="/files/ftp_upload/3883/3883line2.jpg" /> 。）

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利害の衝突が宣言されません。

単回投与レジメン5で鼻腔内に投与した場合、無水物ナノ粒子ワクチンのプラットフォームでは有効性を示している。このワクチン·デリバリー·プラットフォームによって誘発される肺内に常駐貪食細胞集団の活性化を測定することにより、最終的に適応免疫応答を促進するために、その潜在的能力の評価を可能にします。 具体的には、肺胞洗浄液から肺胞マクロファージを採取し、ナノ粒子の異なる製剤でそれらを治療する抗原提示6,8につながる、マクロファージを活性化するために異なる粒子の化学的性質の能力への洞察を提供しています。さらに、in vitro試験で 、これらはin vivo試験大規模かつ複雑に着手する前に、肺胞マクロファージを活性化するために、これらの微粒子アジュバント製剤の能力を評価するために有用である。実験では、常にsurfacのポジティブコントロール処理を含める必要がありますこのようなLPS、Toll様受容体4のアゴニストとしての電子は、マーカーのアップレギュレーション、。注意は、このプロトコルは、1回の...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> CAMメディア </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro </td><td> 15から013-CV </td><td></td></tr><tr><td>の50 mM 2 - メルカプトエタノール</td><td>シグマ</td><td> M3148-25ML </td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン万μg/ mLのソリューション</td><td> Cellgro </td><td> 30から002-CI </td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>アトランタバイオ</td><td> S11150 </td><td></td></tr><tr><td> FACSバッファー </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> S671-500 </td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> MK7868500 </td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> P217500 </td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> P288-200 </td><td></td></tr><tr><td> BSA（ウシ血清アルブミン） </td><td>シグマ</td><td> A7888 </td><td></td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>シグマ</td><td> S2002 </td><td></td></tr><tr><td> 抗体 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ラットIgG </td><td>シグマ</td><td> I4341 </td><td></td></tr><tr><td>抗-MS CD16/32 </td><td>ベイバイオサイエンス</td><td> 16から0161 </td><td></td></tr><tr><td>フルオレセインイソチオシアネート（FITC）結合抗-MS MHC IIハプロタイプIA /​​ IE、クローンM5/114.15.2、 </td><td> eBioscience </td><td> 11から5321 </td><td></td></tr><tr><td>アロフィコシアニンにコンジュゲート抗マウスCD86、クローンGL-1、（APC）-Cy7 </td><td> Biolegend </td><td> 105030 </td><td></td></tr><tr><td> APCへの結合抗マウスCD40、クローン1C10、 </td><td>ベイバイオサイエンス</td><td> 17から0401 </td><td></td></tr><tr><td>ビオチン標識抗マウスCD209、クローン5H10、 </td><td>ベイバイオサイエンス</td><td> 13から2091 </td><td></td></tr><tr><td>のAlexa Fluor®700標識抗マウスCD11bを、クローンM1/70、 </td><td>ベイバイオサイエンス</td><td> 56から0112 </td><td></td></tr><tr><td>フィコエリスリンに結合した抗マウスF4/80、BM8クローン、（PE）-Cy7 </td><td>ベイバイオサイエンス</td><td> 25から4801 </td><td></td></tr><tr><td> PE-テキサスレッド結合ストレプトアビジン</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 551487 </td><td></td></tr><tr><td> 他の消耗品と試薬 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> A405-20 </td><td> 70％（V / V）として使用</td></tr><tr><td>圧縮されたCO 2 </td><td> Linweld </td><td> 16000060 </td><td></td></tr><tr><td> 1 mLのシリンジ</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td>ソブリン3½ &quot;FRトムCatcatheter </td><td>ケンドール</td><td> 703021 </td><td></td></tr><tr><td>バイオセーフティキャビネット</td><td> NUAIRE </td><td>シリーズ22 </td><td></td></tr><tr><td>解剖用はさみ</td><td>フィッシャー</td><td> 138082 </td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td> Roboz </td><td> RS-8254 </td><td></td></tr><tr><td>カルシウムとマグネシウムを含まないPBS、1X </td><td> Cellgro </td><td> 21から040-CM </td><td></td></tr><tr><td>スクリューキャップ付き15 mLの遠心チューブ</td><td> VWRインターナショナル</td><td> 21008-216 </td><td></td></tr><tr><td>プレート処理された6ウェル組織培養</td><td>共演者</td><td> 3516 </td><td></td></tr><tr><td>プラスチックチューブのラック</td><td>ナルゲン</td><td> 5970 </td><td></td></tr><tr><td>セルスクレーパー24センチメートル</td><td> TPP </td><td> 99002 </td><td></td></tr><tr><td> 5mLのポリスチレン丸底チューブ</td><td>ファルコン</td><td> 352008 </td><td></td></tr><tr><td>ピペットエイドXL </td><td>ドラモンド</td><td> 4-000-105 </td><td></td></tr><tr><td> 10、5、および2 mLピペット</td><td>フィッシャー</td><td> 13から675 </td><td></td></tr><tr><td> 200と10μLmicropipettors </td><td>ギルソンピペットマン</td><td> F123601 </td><td></td></tr><tr><td> 200と10μLピペットチップ</td><td>フィッシャー</td><td> 02から707 </td><td></td></tr><tr><td>安定BD固定剤</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 338036 </td><td></td></tr><tr><td> ISOTON II希釈</td><td> Beckman-Coulter社</td><td> 8546719 </td><td></td></tr><tr><td> ZAP-oglobin II溶菌試薬</td><td> Beckman-Coulter社</td><td> 7546138 </td><td></td></tr><tr><td>コー​​ルターカウンターポリスチレンバイアル</td><td> Beckman-Coulter社</td><td> 14310-684 </td><td></td></tr><tr><td>試験管</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 352008 </td><td></td></tr><tr><td> 機器 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>冷凍遠心器</td><td> Labnet </td><td> 50075040 </td><td></td></tr><tr><td>加湿インキュベーターCO 2 </td><td> Nuaire </td><td>モデルオートフロー8500 </td><td></td></tr><tr><td> FACSCantoフローサイトメーター</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 338960 </td><td></td></tr><tr><td>コー​​ルターパーティクルカウンタZ1 </td><td> Beckman-Coulter社</td><td> WS-Z1DUALPC </td><td></td></tr><tr><td>マイクロチップと超音波液体処理装置</td><td> Misonix </td><td>モデル番号S-4000 </td><td></td></tr></tbody></table>

マウス肺胞マクロファージを採取し、無水物ナノ粒子により誘導される細胞活性化を評価する

Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

生分解性ナノ粒子は、呼吸器感染症に対する新規経鼻ワクチンの設計と実装のための汎用プラットフォームとして浮上している。具体的には、無水物は、脂肪族セバシン酸（SA）、芳香族1,6 -ビス（p-カルボキシフェノキシ）ヘキサン（CPH）、または両親媒性1,8 -ビス（p-カルボキシフェノキシ）-3,6 -ジオキサオクタンから成るナノ粒子（CPTEG）はin vivoで 3,4,5 で一意のバルクと表面浸食速度論1,2を表示し、徐々に機能的な生体分子（例えば、タンパク質抗原、免疫グロブリンなど）を解放するために悪用される可能性があります。これらは、それらのワクチン·デリバリー·プラットフォーム6,7,8のための優れた選択肢となり、本質的なアジュバント活性を有する、ナノ粒子。 鼻腔粘膜のワクチン接種後に自然免疫の活性化を支配するメカニズムを解明するために、1つは、抗原Pの分子や細胞の応答を評価する必要があります免疫応答を開始するための責任憤り細胞（APC）。樹状細胞は肺胞マクロファージは（AMɸ）肺実質9,10,11で一世を風靡しながら、気道を行うに見られる主なAPCのです。 AMɸ微生物病原体や細胞破片12,13の肺をクリアに非常に効率的です。さらに、この細胞型は、適応免疫応答9の開始に重要な最初のステップである所属リンパ節への微生物抗原の輸送に重要な役割を果たしています。 AMɸまた、生得的なパターン認識とスカベンジャー受容体、分泌炎症誘発性メディエーター、及び主要なナイーブT細胞12,14の上昇を表現しています。 AMɸ（例えば、80％以上）の比較的純粋な人口は容易に実験室での研究のために肺洗浄を介して取得することができます。 AMɸ免疫有能な動物から採取した居住者はencounteれマクロファージの代表的な表現型を提供するin vivoでの rは粒子ベースのワクチン。ここで、我々は、マウスからの収穫と文化AMɸに使用されるプロトコルを記述し、in vitroでの無水物ナノ粒子を用いた治療後にマクロファージの活性化の表現型を調べます。

ここで、我々は、肺に先天性免疫細胞を常駐し、無水物ナノ粒子との共培養に応答して活性化を検討しているマウスの肺胞マクロファージを採取するためのプロトコルについて説明します。

生分解性ナノ粒子は、呼吸器系疾患に対する新しい経鼻ワクチンの設計および実装のための多用途なプラットフォームとして台頭しています。

本手順の全体的な目的は、ポリ無水物ナノ粒子が精製された肺胞マクロファージを活性化させる能力を評価することです。まず、マウスの気管を外科的に露出させ、肺洗浄を行うことで呼吸器系から細胞を回収します。その後、肺胞マクロファージを遠心分離して単離し、一晩培養します。次にポリ無水物ナノ粒子懸濁液を調製し、肺胞マクロファージに添加します。マクロファージをインキュベートし、48時間後に活性化させます。細胞表面マーカーの発現をフローサイトメトリーで解析します。データの分析により、肺胞マクロファージを活性化させることができるポリ酸無水物ナノ粒子の組成を特定することが可能になります。本手法は、バイオマテリアルおよび免疫学の分野における課題の解決に寄与します。具体的には、肺胞マクロファージを含む抗原提示細胞を活性化させる能力によって示される、固有のアジュバント活性を持つバイオマテリアルを特定することができます。呼吸器病原体に対するポリアンヒドリド・ナノワクチン・プラットフォームが、細菌性肺炎に対して完全な保護能を提供することを発見した際、私たちは研究にこの手法を用いることを初めて考えました。本研究では、このワクチン・プラットフォームと呼吸器免疫細胞との特異的な相互作用について調査することを目的としました。まず、安楽死させたマウスを仰向けに配置して、本手順を開始します。マウスに70%ethanolをスプレーします。ここでは6〜8週齢のC 57 BL/6マウスを使用していますが、この手法はあらゆる系統のマウスで実施可能です。胸骨の位置を確認し、腹部から30度の角度で、1 mLシリンジに取り付けた23G針を挿入します。胸腔内へ約50 mm挿入し、0.4〜1 mLの血液を採取します。通常は心腔内で採取します。この手順を誤ると、実験に用いる個体を損失させる可能性があります。そのため、ここで実演するように慎重に行うことが非常に重要です。洗浄を行うには、マウスを腹臥位にし、70% ethanolをスプレーしてください。次に、70% ethanolで滅菌した解剖用ハサミを用いて、脊椎のほぼ中央あたりの皮膚をつまみます。皮膚に小さな切開を加えます。切開部の両側の皮膚を掴み、マウスの頭尾軸に沿って反対方向に引っ張ります。頸部の筋肉と腺を露出させた後、筋肉組織を慎重に切開します。次に、ピンセットを用いて組織をマウスの前方へ引き寄せ、喉頭、気管、および食道を露出させます。頸静脈や頸動脈を切断しないように注意してください。気管は、周囲に軟骨輪がある組織として識別できます。鉗子を用いて慎重に気管を掴み、背側に位置する食道からゆっくりと持ち上げて分離します。Tomcatカテーテルを装着した1 ccシリンジに、滅菌PBSを満たします。次に、45度の角度で、鉗子の前方かつ喉頭の後方の気管に小さな切開を加えます。気管を完全に切断しないように注意してください。これにより、気管が体腔内に陥入することを防げます。鉗子で気管を保持し、カテーテルを気管の切開部から約 20 millimeters 緩徐に挿入します。その後、カテーテルチューブ周囲の気管を保持して片手を自由にし、胸部を外側からマッサージします。カテーテルを装着した1 mLシリンジを用いて、室温の滅菌PBS 0.75 mLを肺内にゆっくりと注入します。その後、PBSをゆっくりとシリンジに吸引し戻します。この操作を3回繰り返します。シリンジをカテーテルから取り外し、洗浄液を15 mL遠心チューブに分注します。シリンジに新鮮なPBSを0.75 mL満たし、再びカテーテルに接続して洗浄を繰り返します。液の回収は不完全な場合があるため、注入量よりも回収量が少なくなることがあります。複数のマウスから細胞を回収する場合、すべての肺洗浄が完了するまで、回収した細胞を入れた15 mLチューブを氷上に置いてください。回収した細胞中の肺胞マクロファージの集団を濃縮するため、肺洗浄液を4°Cで250 ×g、10分間遠心分離します。無菌操作を用いて、バイオセーフティキャビネット内で上清を適切な廃棄容器にデカントします。遠心チューブをテストチューブラックの上で静かに揺らし、細胞ペレットを再懸濁します。細胞数を計数するため、完全肺胞マクロファージ培地を1 mL加え、細胞を再懸濁します。細胞 20 µL を、カルチャーカウンター用バイアルに入れた 10 mL の isotone two 希釈液にピペットで加えます。zog globin、lytic reagent 2 を 3〜4 滴バイアルに加え、ゆっくりと 3〜4 回転倒混和します。その後、サンプルバイアルを Colter particle counter Z1 カウンターにロードします。細胞濃度を1 mLあたりの細胞数として表示させるため、カウンターに希釈倍率を2×10⁴として設定してください。細胞濃度が決定したら、15 mLチューブ内で完全肺胞マクロファージ培地を用いて、細胞濃度を2.5×10⁵/mLに希釈します。その後、この溶液を6ウェル組織培養プレートの各ウェルに2 mLずつ分注します。肺胞マクロファージを濃縮させるため、培養皿を5%CO2雰囲気下の37 °C加湿インキュベーターで6時間インキュベートします。インキュベーション中、マクロファージがウェルの底面に接着します。インキュベーション後、接着細胞を剥離させないように注意しながら、上清を穏やかに吸引します。その後、滅菌済みのカルシウムおよびマグネシウムフリーPBSを用いてウェルを洗浄します。非接着細胞とデブリを除去するため、各ウェルに完全肺胞マクロファージ培地を 2 mL 加えます。その後、細胞を 37 °C で一晩インキュベートします。この濃縮ステップの後、細胞の約 87% がマクロファージマーカーである CD11b および F4/80 陽性となります。肺胞マクロファージ集団が濃縮されたら、次の手順としてポリアンヒドリドナノ粒子を添加します。まず、ポリアンヒドリドの貧溶媒ナノカプセル化によりナノ粒子を作製します。この工程では、ポリマーを塩化メチレンに溶解させ、ペンタン中で沈殿させます。滅菌済みの秤量紙を用いて、適切な量のポリアンヒドリドナノ粒子を量り取ってください。ここでは、培養液1mLあたり125µgの粒子を添加します。粒子を1.5mLマイクロ遠心チューブに入れ、適切な量の氷冷した完全肺胞マクロファージ培地でナノ粒子を再懸濁し、氷上に置きます。次に、卓上ソニケーターのマイクロチップを滅菌します。チューブを氷上に置いたまま、70% ethanolでスプレーし、滅菌済みのキムワイプで拭き取ります。10～20 joulesで30～45秒間ソニケーションを行います。粒子が十分に分散していない場合は、ナノ粒子懸濁液をマクロに観察してください。懸濁液を氷上に1〜2分間置き、ナノ粒子がポリマーのガラス転移温度以下であることを確認します。その後、再度30〜45秒間ソニケーションを行います。このソニケーション工程の目的は、50 50 CCPタグとしてナノ粒子を適切に分散させることです。CPHナノ粒子は水系環境にさらされると凝集する傾向があります。しかし、ナノ粒子の小さな凝集塊が懸濁液中に残る場合があります。表面の早期侵食や凝集を防ぐため、ナノ粒子懸濁液は氷上で保持し、直ちに使用してください。肺胞マクロファージを含む培養皿をインキュベーターから取り出し、バイオセーフティキャビネット内に配置する。接着細胞を乱さないように注意しながらプレートを傾け、ナノ粒子懸濁液の添加量に相当する培地をピペットで吸い出す。ポリアンヒドリドナノ粒子懸濁液を短時間ボルテックスし、その後、適切なウェルにナノ粒子懸濁液を0.3 millilitersまでピペッティングして加える。ここでも、接着細胞を乱さないように注意してください。粒子はウェルの底に沈降し、細胞に接触します。以降のウェルおよび希望する処理群についても同様に操作を進めてください。培地のみ、および200 ng/mLのリポポリサッカライドなどの陽性および陰性対照群を指定のウェルに含め、37 °Cで48時間インキュベートします。インキュベーション後、付属文書に記載されている通り、フローサイトメトリーによって肺胞の活性化を評価できます。細胞活性化を評価するため、C 57 BL sixマウスから肺胞マクロファージを回収し、ビデオ記事に記載した方法で濃縮した。濃縮した肺胞マクロファージ（5 × 10⁵ cells/mL）に、125 µg/mLの50:50 CPT:CPHポリアンハイドライドナノ粒子を添加し、48時間培養した。その後、肺胞マクロファージのマーカーであるMHC II、CD 40、CD 86、およびSIRT1の発現を、抗体染色およびフローサイトメトリーにより評価した。結果はこのヒストグラムに示されている。実線の青色で示されたナノ粒子とともにインキュベートした肺胞マクロファージでは、予想通り、ナノ粒子未処理の細胞と比較して、CD4 T細胞への抗原提示に必要な分子であるMHC IIの表面発現が増加していました。FMO（fluorescence minus one）コントロールでは染色のレベルが低かったことから、観察されたシグナルは自己蛍光によるものではないことが示されました。実線の青色で示されたナノ粒子とともにインキュベートした肺胞マクロファージでは、未処理の細胞と比較して、T細胞の適切な活性化に必要な共刺激分子であるCD40の発現が亢進していました。別のT細胞共刺激分子であるCD 86の発現も、ポリアンヒドリドナノ粒子で48時間処理した後に増加しました。病原体表面に存在する糖鎖モチーフに結合するC型レクチン受容体であるCYの発現は、ポリアンヒドリドナノ粒子処理後の肺胞マクロファージにおいて大幅に増強されます。このビデオを視聴することで、肺胞マクロファージを回収するための肺洗浄液採取の方法、それらの細胞の培養方法、およびポリアンヒドリドナノ粒子を用いてそれらの細胞を刺激し、細胞活性化を測定または評価する方法について十分に理解できるはずです。本手順を実施する際は、採取する初代細胞の汚染および処理系への不純物の混入を防ぐため、無菌的な実験操作を行うことが重要です。

harvesting-murine-alveolar-macrophages-evaluating-cellular-activation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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マウス肺胞マクロファージを採取し、無水物ナノ粒子により誘導される細胞活性化を評価する

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