セルの剛性を推定するために基板に接続された細胞のマイクロピペット吸引

本実験の目的は、さまざまな生理的および病理学的条件下における細胞の粘弾性特性を解析することである。これは、マイクロピペットプラーを用いてガラスキャピラリーから作製し、圧力トランスデューサーに接続したマイクロピペットを介して、細胞膜に陰圧を負荷することによって達成される。ピペットは倒立顕微鏡のステージ上に配置された精密マイクロマニピュレーターに取り付けられ、ピペットの先端を細胞に近接させる。

次に、ピペットの先端と細胞膜との間にシールを作成し、負圧のステップを印加した際のピペット内への細胞膜の変形を測定します。これにより、明確に定義された力に対する膜変形度に基づいた、さまざまな処理が細胞のバイオメカニクス特性に及ぼす影響に関する結果が得られます。当研究室では、脂質異常症が血管内皮細胞の生物物理学的およびバイオメカニクス的特性に与える影響を研究しており、本日は細胞の剛性を測定するために使用しているマイクロピペット吸引法という手法について説明します。

本手法の意義は、血管新生、機械的感知、遊走などの多様なメカニズムにおける細胞バイオメカニクスの基礎的な理解へと広がります。この方法は細胞バイオメカニクスへの洞察を提供できるだけでなく、モデル膜、細胞内オルガネラ、または組織などの他のシステムにも適用可能です。細胞膜を可視化し、ピペット内への膜の突出を観察するため、血管内皮細胞の膜を親油性蛍光色素で染色します。

まず、ストック染料を温めたPBS溶液で希釈して作業濃度にし、混合物を5分間超音波処理してD凝集体を分解させます。マイクロ遠心分離機で5分間遠心分離した後、上清を除去し、0.5 mLのPBSを加えて血管内皮細胞を洗浄します。5分後、溶液を吸引し、さらに2回洗浄を繰り返します。

次に、ダイス溶液を細胞に加え、37°Cのインキュベーターで30分間インキュベートします。インキュベーション後、前述と同様にPBSで再度細胞を洗浄します。マイクロピペットは、ガラスキャピラリーの中央部を加熱して引き伸ばして作製します。

ガラスが溶け始めると、キャピラリーの2つの半分を互いに引き離して、2本のマイクロピペットを作成します。本実験で使用するピペットの先端径は、通常2〜6 µmの範囲です。細胞のサイズに応じて、先端の形状は円筒状のチューブに近似させる必要があります。ガラスキャピラリーをピペットプラーに挿入します。

本デモンストレーションでは、最適化されたプログラムを用いてSuter P 97水平ピペットプラーを使用します。このプラーには、引き込み速度などのパラメータを変更するための複数のプログラムオプションが用意されています。プラープログラムを起動してください。

各マイクロピペットを引いた後、顕微鏡下でチップの形状を確認してください。チップを火炎研磨した後、PBSなどの生理食塩水または非蛍光増殖培地でマイクロピペットを満たします。重要な点として、細胞膜がピペット内へスムーズに移動するように、溶液には30%の血清を添加する必要があります。本デモンストレーションでは、3Dデコンボリューション機能を備えた倒立蛍光顕微鏡を使用し、コンピューターに接続されたビデオカメラ、圧力トランスデューサー、防振台、およびマイクロマニピュレーターを用います。まず、基質から細胞を吸い上げ、倒立蛍光顕微鏡に設置された浅い縦型チャンバーにピペッティングすることで、マイクロアスピレーションチャンバーに細胞をマウントします。

浅い縦型チャンバーを使用する理由は、マイクロピペットを可能な限り水平に近い非常に浅い角度で細胞に近づけるためです。これにより、マイクロピペット内に吸引された膜を単一の焦点面で可視化できるようになります。溶液を満たしたマイクロピペットを、フレキシブルチューブで電力トランスデューサに接続されたピペットホルダーに装着します。この際、ピペットホルダーのコネクタに密着するよう直径を調整してください。

各実験の開始時に、ピペット内の圧力を大気圧に平衡化させ、ミクロン単位での精密な制御が可能なマイクロマニピュレーターにピペットを装着します。ピペットをチャンバー底部に対して浅い角度で配置し、ピペット先端を視野の中心に移動させます。膜を吸引するためのピペットチップの円筒部分であるシャンクは、焦点面に対して水平に揃える必要があります。

この最初の位置に到達させるには、ピペットを可能な限り浅い角度にし、ピペットのシャンクをチャンバーの底に押し当てて曲げます。シャンクは非常に細いため、細胞に近づく際にチャンバーの底を滑るのに十分な柔軟性があります。粗動マニピュレーターを使用して、マイクロピペットを単一細胞の側面にゆっくりと降ろし、細胞の焦点面付近まで移動させます。

次に、ファインマニピュレーターを使用して、マイクロピペットの先端が細胞膜に軽く触れるまで、細胞の端へと移動させます。ピペットの位置を確認するために画像を1枚撮影してください。ピペットの先端全体が細胞表面に完全に接触し、その接触が安定している場合に、良好なシールが形成されます。

次に、トランスデューサーを用いて負圧を加え、膜の突出が安定するまでその状態を維持します。膜をピペット内に吸引させるのに必要な圧力は、細胞の種類や具体的な実験条件によって異なります。通常、-2 mmHgから-15 mmHgの範囲で圧力を加えると、初期変形が観察されます。

圧力を加えると、メンブレンが徐々にピペット内に変形し、一定の長さに達して安定します。このプロセスには通常2〜3分かかります。この間、ピペット内に引き込まれるメンブレンの進行状況を追跡するため、30秒ごとにメンブレン変形の画像を撮影する必要があります。最後に、圧力を2〜5 mmHg刻みで次の段階まで上げます。

膜の突出部が細胞から離脱し、ピペット内に移動するまで、一連の手順を繰り返します。その時点で実験を終了します。膜の変形度を定量化するため、ピペットの先端から膜突出部の円周の頂点までの吸引長を測定します。ピペットの直径によるばらつきを考慮し、より口径の大きなピペットを使用すると、同一の圧力レベルで細胞膜により大きな力が加わります。

基質付着細胞に対するマイクロ吸引法の妥当性を検証するため、吸引長を各実験で測定したピペット径で正規化しました。この手法を用いて推定したところ、F actinの崩壊によりウシ大動脈内皮細胞の細胞剛性が低下することが確認されました。ここでは、マイクロピペットから印加された負圧に応じて段階的に変形する内皮膜の代表的な蛍光画像シリーズを、予想通りに示しています。膜は徐々にピペット内に吸引され、吸引長は印加圧力の関数として増加します。変形の時間経過から、F actinの崩壊により、あらゆる圧力条件下で突出部の吸引長が有意に増加することが示されました。

この手法を用いて、細胞膜のコレステロールが枯渇すると細胞の剛性が増加し、一方でコレステロールを濃縮しても影響がないことが的に明らかになりました。ここでは、最大吸引長に達した時のコレステロール濃縮細胞、コントロール細胞、およびコレステロール枯渇細胞を、−15 mmHgの条件下で示しています。通常、突起は−10 mmHgで形成され始め、膜変形に要する時間は、−10、−15、および−20 mmHgの陰圧において測定されました。

ここでは、最大吸引長を印加圧力の関数としてプロットしています。-15 mmHgおよび-20 mmHgの圧力において、枯渇細胞の最大正規化長は対照細胞よりも有意に低くなりました。-25 mmHgを超える負圧を印加したところ、吸引された突起が脱落し、独立した小胞が形成されました。

膜の剥離を引き起こした圧力レベルは、異なるコレステロール条件下で同等であり、これは予期せぬ観察結果であった。先行研究では、膜コレステロールの増加が膜脂質二重層の剛性を高めることが示されている。この手法を習得すれば、適切に行った場合に2〜3時間で完了させることができる。この手法を試みる際は、本実験が個々の細胞に対して行われるものであることを念頭に置くことが重要である。

したがって、1つの条件につき3〜5個の細胞を解析し、これを計3回の独立した実験で実施してください。