Name: セルの剛性を推定するために基板に接続された細胞のマイクロピペット吸引 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: 学ぼう、マイクロピペット吸引法を用いて基板接着細胞の粘弾性特性を測定する方法。負圧を加えて膜変形を評価し、細胞バイオメカニクスや血管疾患研究への応用を理解できます。

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<ol><li>Rand, R. P., Burton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+the+red+cell+membrane.+I.+Membrane+stiffness+and+intracellular+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of the red cell membrane. I. Membrane stiffness and intracellular pressure.</a> Biophys. J. 4, 115-135 (1964).</li>
<li>Discher, D. E., Mohandas, N., Evans, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+maps+of+red+cell+deformation%3A+hidden+elasticity+and+in+situ+connectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Molecular maps of red cell deformation: hidden elasticity and in situ connectivity.</a> Science. 266, 1032-1035 (1994).</li>
<li>Schmid-Schönbein, G. W., Sung, K. L., Tözeren, H., Skalak, R., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+mechanical+properties+of+human+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Passive mechanical properties of human leukocytes.</a> Biophys. J. 36, 243-256 (1981).</li>
<li>Guilak, F., Tedrow, J. R., Burgkart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscoelastic+properties+of+the+cell+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Re.s+Commun%22%5BJournal%5D)">Viscoelastic properties of the cell nucleus.</a> Biochem. Biophys. Re.s Commun. 269, 781-786 (2000).</li>
<li>Needham, D., Nunn, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastic+deformation+and+failure+of+lipid+bilayer+membranes+containing+cholesterol%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Elastic deformation and failure of lipid bilayer membranes containing cholesterol.</a> Biophys. J. 58, 997-1009 (1990).</li>
<li>Sato, M., Theret, D. P., Wheeler, L. T., Ohshima, N., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+micropipette+technique+to+the+measurement+of+cultured+porcine+aortic+endothelial+cell+viscoelastic+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Application of the micropipette technique to the measurement of cultured porcine aortic endothelial cell viscoelastic properties.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 112, 263-268 (1990).</li>
<li>Theret, D. P., Levesque, M. J., Sato, F., Nerem, R. M., Wheeler, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+application+of+a+homogeneous+half-space+model+in+the+analysis+of+endothelial+cell+micropipette+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22J.+of+Biomechanical+Engineering%22%5BJournal%5D)">The application of a homogeneous half-space model in the analysis of endothelial cell micropipette measurements.</a> J. of Biomechanical Engineering. 110, 190-199 (1988).</li>
<li>Hochmuth, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropipette+aspiration+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech%22%5BJournal%5D)">Micropipette aspiration of living cells.</a> J. Biomech. 33, 15-22 (2000).</li>
<li>Lim, C. T., Zhou, E. H., Quek, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+models+for+living+cells--a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Mechanical models for living cells--a review.</a> Journal of Biomechanics. 39, 195(2006).</li>
<li>Zhao, R., Wyss, K., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+analytical+and+inverse+finite+element+approaches+to+estimate+cell+viscoelastic+properties+by+micropipette+aspiration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Comparison of analytical and inverse finite element approaches to estimate cell viscoelastic properties by micropipette aspiration.</a> Journal of Biomechanics. 42, 2768(2009).</li>
<li>Chien, S., Sung, K. L., Skalak, R., Usami, S., Tozeren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theoretical+and+experimental+studies+on+viscoelastic+properties+of+erythrocyte+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Theoretical and experimental studies on viscoelastic properties of erythrocyte membrane.</a> Biophys. J. 24, 463-487 (1978).</li>
<li>Evans, E., Kuhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+material+behavior+of+granulocytes+based+on+large+deformation+and+recovery+after+deformation+tests%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Passive material behavior of granulocytes based on large deformation and recovery after deformation tests.</a> Blood. 64, 1028-1035 (1984).</li>
<li>Sato, M., Levesque, M. J., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropipette+aspiration+of+cultured+bovine+aortic+endothelial+cells+exposed+to+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%22%5BJournal%5D)">Micropipette aspiration of cultured bovine aortic endothelial cells exposed to shear stress.</a> Arteriosclerosis. 7, 276-286 (1987).</li>
<li>Byfield, F., Aranda-Aspinoza, H., Romanenko, V. G., Rothblat, G. H., Levitan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+depletion+increases+membrane+stiffness+of+aortic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Cholesterol depletion increases membrane stiffness of aortic endothelial cells.</a> Biophys. J. 87, 3336-3343 (2004).</li>
<li>Byfield, F. J., Hoffman, B. D., Romanenko, V. G., Fang, Y., Crocker, J. C., Levitan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+the+role+of+cell+stiffness+in+modulation+of+volume-regulated+anion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Physiologica%22%5BJournal%5D)">Evidence for the role of cell stiffness in modulation of volume-regulated anion channels.</a> Acta. Physiologica. 187, 285-294 (2006).</li>
<li>Byfield, F. J., Reen, R. K., Shentu, T. -P., Levitan, I., Gooch, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+actin+and+cell+stiffness+is+modulated+by+substrate+stiffness+in+2D+and+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Endothelial actin and cell stiffness is modulated by substrate stiffness in 2D and 3D.</a> Journal of Biomechanics. 42, 1114(2009).</li>
<li>Evans, E., Needham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+properties+of+surfactant+bilayer+membranes%3A+thermal+transitions%2C+elasticity%2C+rigidity%2C+cohesion+and+colloidal+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Physical properties of surfactant bilayer membranes: thermal transitions, elasticity, rigidity, cohesion and colloidal interactions.</a> Journal of Physical Chemistry. 91, 4219-4228 (1987).</li>
<li>Sun, M., Northup, N., Marga, F., Huber, T., Byfield, F. J., Levitan, I., Forgacs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+cellular+cholesterol+on+membrane-cytoskeleton+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">The effect of cellular cholesterol on membrane-cytoskeleton adhesion.</a> J. Cell. Sci. 120, 2223-2231 (2007).</li>
<li>Shentu, T. P., Titushkin, I., Singh, D. K., Gooch, K. J., Subbaiah, P. V., Cho, M., Levitan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((oxLDL-induced+decrease+in+lipid+order+of+membrane+domains+is+inversely+correlated+with+endothelial+stiffness+and+network+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">oxLDL-induced decrease in lipid order of membrane domains is inversely correlated with endothelial stiffness and network formation.</a> Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 299, 218-229 (2010).</li>
<li>Norman, L. L., Oetama, R. J., Dembo, M., Byfield, F., Hammer, D. A., Levitan, I., Aranda-Espinoza, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+Cellular+Cholesterol+Content+Affects+Traction+Force%2C+Adhesion+and+Cell+Spreading%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Modification of Cellular Cholesterol Content Affects Traction Force, Adhesion and Cell Spreading.</a> Cell Mol. Bioeng. 3, 151-162 (2010).</li>
<li>Mitchinson, J. M., Swann, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mechanical+Properties+of+the+Cell+Surface%3A+I.+The+Cell+Elastimeter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">The Mechanical Properties of the Cell Surface: I. The Cell Elastimeter.</a> J. of Experimental Biology. 31, 443-460 (1954).</li>
<li>Byfield, F. J., Tikku, S., Rothblat, G. H., Gooch, K. J., Levitan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OxLDL+increases+endothelial+stiffness%2C+force+generation%2C+and+network+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">OxLDL increases endothelial stiffness, force generation, and network formation.</a> J. Lipid Res. 47, 715-723 (2006).</li>
<li>Ohashi, T., Ishii, Y., Ishikawa, Y., Matsumoto, T., Sato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+and+numerical+analyses+of+local+mechanical+properties+measured+by+atomic+force+microscopy+for+sheared+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Mater.+Eng%22%5BJournal%5D)">Experimental and numerical analyses of local mechanical properties measured by atomic force microscopy for sheared endothelial cells.</a> Biomed. Mater. Eng. 12, 319-327 (2002).</li>
<li>Solon, J., Levental, I., Sengupta, K., Georges, P. C., Janmey, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+adaptation+and+stiffness+matching+to+soft+elastic+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Fibroblast adaptation and stiffness matching to soft elastic substrates.</a> Biophysical Journal. 93, 4453(2007).</li>
<li>Kowalsky, G. B., Byfield, F. J., Levitan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((oxLDL+facilitates+flow-induced+realignment+of+aortic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">oxLDL facilitates flow-induced realignment of aortic endothelial cells.</a> Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 295, 332-340 (2008).</li>
<li>Ketene, A. N., Schmelz, E. M., Roberts, P. C., Agah, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+cancer+progression+on+the+viscoelasticity+of+ovarian+cell+cytoskeleton+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%3A+Nanotechnology%2C+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">The effects of cancer progression on the viscoelasticity of ovarian cell cytoskeleton structures.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Kole, T. P., Tseng, Y., Huang, L., Katz, J. L., Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+kinase+regulates+the+intracellular+micromechanical+response+of+adherent+cells+to+rho+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Rho kinase regulates the intracellular micromechanical response of adherent cells to rho activation.</a> Mol. Biol. Cell. 15, 3475-3484 (2004).</li>
<li>Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+GTPases+and+the+Actin+Cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rho GTPases and the Actin Cytoskeleton.</a> Science. 279, 509-514 (1998).</li>
<li>Okajima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+Force+Microscopy+for+the+Examination+of+Single+Cell+Rheology.+In%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Atomic Force Microscopy for the Examination of Single Cell Rheology. In.</a> Methods Mol. Biol. 736, 303-329 (2011).</li>
<li>Wang, N., Butler, J. P., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+across+the+cell+surface+and+through+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction across the cell surface and through the cytoskeleton.</a> Science. 260, 1124-1127 (1993).</li>
<li>Fabry, B., Maksym, G. N., Butler, J. P., Glogauer, M., Navajas, D., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaling+the+microrheology+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Scaling the microrheology of living cells.</a> Physical Review Letters. 87, 148102(2001).</li>
<li>Park, C. Y., Tambe, D., Alencar, A. M., Trepat, X., Zhou, E. H., Millet, E., Butler, J. P., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+cytoskeletal+prestress%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mapping the cytoskeletal prestress.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 298, C1245-C1252 (2010).</li>
<li>Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+force+microscopy+of+migrating+normal+and+H-ras+transformed+3T3+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts.</a> Biophys. J. 80, 1744-1757 (2001).</li>
<li>Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle-tracking+microrheology+of+living+cells%3A+principles+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Particle-tracking microrheology of living cells: principles and applications.</a> Annu. Rev. Biophys. 38, 301-326 (2009).</li>
<li>Shin, D., Athanasiou, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoindentation+for+obtaining+cell+biomechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Orthop.+Res%22%5BJournal%5D)">Cytoindentation for obtaining cell biomechanical properties.</a> J. Orthop. Res. 17, 880-890 (1999).</li>
<li>Ou-Yang, H. D., Wei, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+fluids%3A+probing+mechanical+properties+of+biological+systems+with+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Complex fluids: probing mechanical properties of biological systems with optical tweezers.</a> Annu. Rev. Phys. Chem. 61, 421-440 (2010).</li>
<li>Hosu, B. G., Sun, M., Marga, F., Grandbois, M., Forgacs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+membrane+tethers+revisited+using+magnetic+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Biol%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic membrane tethers revisited using magnetic tweezers.</a> Phys. Biol. 4, 67-78 (2007).</li>
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特別な利害関係は宣言されません。

Microaspirationは、細胞膜に負圧を適用し、明確に定義された圧力に応答して膜の変形能を測定することにより細胞の剛性/変形を推定するためのシンプルで再現性の高い方法を提供します。これは、最初の細胞分裂21その後赤血球1の機械的特性を見るためのメカニズムへの洞察を提供するために、ウニの卵の弾性的性質を特徴づけるためにミッチソンとスワン（1954）によって開発されました。この方法は、種々の細胞型（ 例えば 2,3,12,13）の生体力学的特性を評価するために、複数の研究で使用されています。我々の最近の研究では、3Dイメージング14,15,22とmicroaspirationを組み合わせることにより、基板に接続されたセルの剛性を推定するために、このメソッドを拡張した。膜の硬さと弾力性が細胞表現型に関する重要な情報を提供し、どのように細胞は、特に機械的手掛かりの様に、動的な環境に対応血流の血行力学的な力によって、または細胞外マトリックスの粘弾性特性を変化させることにより生成されるの。確かに、以前の研究では、流体せん断応力<sup...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ/モデル番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td>サッターピペットプラー</td><td>サターインスツルメンツ</td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td>マイクロフォージ</td><td>ナリシゲ</td><td> MF-830 </td><td></td></tr><tr><td>倒立蛍光顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td> AXIOVERT 200M </td><td>顕微鏡は、好ましく3D/deconvolution機能を装備する必要があります。 </td></tr><tr><td>ビデオカメラ</td><td>ツァイス</td><td> AxioCam MRM </td><td></td></tr><tr><td>画像取得sotware </td><td>ツァイス</td><td> AxioVisionの</td><td></td></tr><tr><td>空気圧トランスデューサ</td><td> BioTekの</td><td> DPM-1B </td><td> DPM1B空変換器のテスターは現在FLUKEことによって見つけることができます。 </td></tr><tr><td>ピペットグラス</tD&gt; <td>リッチランド</td><td>カスタマイズされたガラス</td><td>ピペットは1.2内径と外径1.6を使用してカスタマイズされた。 </td></tr><tr><td> DiIを染料</td><td>インビトロジェン</td><td> D282 </td><td> DMSOによく溶ける</td></tr></tbody></table>

セルの剛性を推定するために基板に接続された細胞のマイクロピペット吸引

Micropipette Aspiration of Substrate-attached Cells to Estimate Cell Stiffness

研究の数が増え、個々の細胞の生体力学的特性は、細胞の増殖、分化、移動および細胞間相互作用を含む複数の細胞機能において重要な役割を果たしていることを示している。細胞のバイオメカニクスの2つの重要なパラメータは、細胞変形や剛性と力を収縮し、生成する細胞の能力である。ここでは、細胞表面にガラスマイクロピペット、マイクロピペット吸引またはMicroaspirationと呼ばれる技術によって適用された負圧に応じて、膜変形の度合いを測定することにより、セルの剛性を推定するために迅速かつ簡単な方法を説明します。 Microaspirationその後、空気圧トランスデューサに接続されており、近くに持って来られる、非常に小さなチップ（細胞または組織サンプルの大きさに応じて2から50μmの直径）でマイクロピペットを作成するためにガラスキャピラリーを引っ張ることによって行われます顕微鏡下で細胞の付近。時ピペットの先端が細胞に触れると、負圧工程は、細胞膜上の明確に定義された圧力を発生させる空気圧トランスデューサによりピペットに適用されます。圧力に応じて、メンブレンをピペット内に吸引され、ピペットにプログレッシブ膜変形または &quot;膜投影&quot;は、時間の関数として測定される。この実験的なアプローチの基本的な原理は、定義された機械的な力に応じて、膜変形の程度は膜剛性の関数であるということです。硬めの膜であり、膜変形と短い定常吸引length.The技術の遅い速度は、単離された両方のサスペンションと、基板に接続された、大規模な細胞小器官内の細胞、およびリポソーム上で実行することができます。 分析は、異なる細胞集団や実験条件の与えられた圧力の下で達成最大の膜の変形を比較することによって行われる。 &quot;剛性係数は、&quot; ESです印加圧力の関数としての膜変形の吸引された長さをプロットすることによりtimated。さらに、データはさらに材料の剛性を特徴づける細胞のヤング率（E）は、最も一般的なパラメータを推定するために分析することができる。真核細胞の細胞膜は膜脂質二重層は、サブ膜細胞骨格によって、それが膜の機械的足場を構成し、変形を支配する細胞骨格であるunderliedされる二成分系とみなすことができることに注意することが重要です携帯封筒の。このアプローチは、したがって、サブ膜細胞骨格の力学的特性をプロービングすることができます。

ここでは、セルの剛性を測定するために迅速かつ簡単な方法を説明します。このアプローチの一般的な原則は、細胞表面にマイクロピペットを介して適用、明確に定義された負圧に応答して膜の変形を測定することです。この方法は、基板に接続された細胞の生体力学的特性を研究するための強力なツールを提供します。

個々の細胞の生物力学的特性が、細胞の...を含む複数の細胞機能において重要な役割を果たすことを示す研究が増えています。

本実験の目的は、さまざまな生理的および病理学的条件下における細胞の粘弾性特性を解析することである。これは、マイクロピペットプラーを用いてガラスキャピラリーから作製し、圧力トランスデューサーに接続したマイクロピペットを介して、細胞膜に陰圧を負荷することによって達成される。ピペットは倒立顕微鏡のステージ上に配置された精密マイクロマニピュレーターに取り付けられ、ピペットの先端を細胞に近接させる。次に、ピペットの先端と細胞膜との間にシールを作成し、負圧のステップを印加した際のピペット内への細胞膜の変形を測定します。これにより、明確に定義された力に対する膜変形度に基づいた、さまざまな処理が細胞のバイオメカニクス特性に及ぼす影響に関する結果が得られます。当研究室では、脂質異常症が血管内皮細胞の生物物理学的およびバイオメカニクス的特性に与える影響を研究しており、本日は細胞の剛性を測定するために使用しているマイクロピペット吸引法という手法について説明します。本手法の意義は、血管新生、機械的感知、遊走などの多様なメカニズムにおける細胞バイオメカニクスの基礎的な理解へと広がります。この方法は細胞バイオメカニクスへの洞察を提供できるだけでなく、モデル膜、細胞内オルガネラ、または組織などの他のシステムにも適用可能です。細胞膜を可視化し、ピペット内への膜の突出を観察するため、血管内皮細胞の膜を親油性蛍光色素で染色します。まず、ストック染料を温めたPBS溶液で希釈して作業濃度にし、混合物を5分間超音波処理してD凝集体を分解させます。マイクロ遠心分離機で5分間遠心分離した後、上清を除去し、0.5 mLのPBSを加えて血管内皮細胞を洗浄します。5分後、溶液を吸引し、さらに2回洗浄を繰り返します。次に、ダイス溶液を細胞に加え、37°Cのインキュベーターで30分間インキュベートします。インキュベーション後、前述と同様にPBSで再度細胞を洗浄します。マイクロピペットは、ガラスキャピラリーの中央部を加熱して引き伸ばして作製します。ガラスが溶け始めると、キャピラリーの2つの半分を互いに引き離して、2本のマイクロピペットを作成します。本実験で使用するピペットの先端径は、通常2〜6 µmの範囲です。細胞のサイズに応じて、先端の形状は円筒状のチューブに近似させる必要があります。ガラスキャピラリーをピペットプラーに挿入します。本デモンストレーションでは、最適化されたプログラムを用いてSuter P 97水平ピペットプラーを使用します。このプラーには、引き込み速度などのパラメータを変更するための複数のプログラムオプションが用意されています。プラープログラムを起動してください。各マイクロピペットを引いた後、顕微鏡下でチップの形状を確認してください。チップを火炎研磨した後、PBSなどの生理食塩水または非蛍光増殖培地でマイクロピペットを満たします。重要な点として、細胞膜がピペット内へスムーズに移動するように、溶液には30%の血清を添加する必要があります。本デモンストレーションでは、3Dデコンボリューション機能を備えた倒立蛍光顕微鏡を使用し、コンピューターに接続されたビデオカメラ、圧力トランスデューサー、防振台、およびマイクロマニピュレーターを用います。まず、基質から細胞を吸い上げ、倒立蛍光顕微鏡に設置された浅い縦型チャンバーにピペッティングすることで、マイクロアスピレーションチャンバーに細胞をマウントします。浅い縦型チャンバーを使用する理由は、マイクロピペットを可能な限り水平に近い非常に浅い角度で細胞に近づけるためです。これにより、マイクロピペット内に吸引された膜を単一の焦点面で可視化できるようになります。溶液を満たしたマイクロピペットを、フレキシブルチューブで電力トランスデューサに接続されたピペットホルダーに装着します。この際、ピペットホルダーのコネクタに密着するよう直径を調整してください。各実験の開始時に、ピペット内の圧力を大気圧に平衡化させ、ミクロン単位での精密な制御が可能なマイクロマニピュレーターにピペットを装着します。ピペットをチャンバー底部に対して浅い角度で配置し、ピペット先端を視野の中心に移動させます。膜を吸引するためのピペットチップの円筒部分であるシャンクは、焦点面に対して水平に揃える必要があります。この最初の位置に到達させるには、ピペットを可能な限り浅い角度にし、ピペットのシャンクをチャンバーの底に押し当てて曲げます。シャンクは非常に細いため、細胞に近づく際にチャンバーの底を滑るのに十分な柔軟性があります。粗動マニピュレーターを使用して、マイクロピペットを単一細胞の側面にゆっくりと降ろし、細胞の焦点面付近まで移動させます。次に、ファインマニピュレーターを使用して、マイクロピペットの先端が細胞膜に軽く触れるまで、細胞の端へと移動させます。ピペットの位置を確認するために画像を1枚撮影してください。ピペットの先端全体が細胞表面に完全に接触し、その接触が安定している場合に、良好なシールが形成されます。次に、トランスデューサーを用いて負圧を加え、膜の突出が安定するまでその状態を維持します。膜をピペット内に吸引させるのに必要な圧力は、細胞の種類や具体的な実験条件によって異なります。通常、-2 mmHgから-15 mmHgの範囲で圧力を加えると、初期変形が観察されます。圧力を加えると、メンブレンが徐々にピペット内に変形し、一定の長さに達して安定します。このプロセスには通常2〜3分かかります。この間、ピペット内に引き込まれるメンブレンの進行状況を追跡するため、30秒ごとにメンブレン変形の画像を撮影する必要があります。最後に、圧力を2〜5 mmHg刻みで次の段階まで上げます。膜の突出部が細胞から離脱し、ピペット内に移動するまで、一連の手順を繰り返します。その時点で実験を終了します。膜の変形度を定量化するため、ピペットの先端から膜突出部の円周の頂点までの吸引長を測定します。ピペットの直径によるばらつきを考慮し、より口径の大きなピペットを使用すると、同一の圧力レベルで細胞膜により大きな力が加わります。基質付着細胞に対するマイクロ吸引法の妥当性を検証するため、吸引長を各実験で測定したピペット径で正規化しました。この手法を用いて推定したところ、F actinの崩壊によりウシ大動脈内皮細胞の細胞剛性が低下することが確認されました。ここでは、マイクロピペットから印加された負圧に応じて段階的に変形する内皮膜の代表的な蛍光画像シリーズを、予想通りに示しています。膜は徐々にピペット内に吸引され、吸引長は印加圧力の関数として増加します。変形の時間経過から、F actinの崩壊により、あらゆる圧力条件下で突出部の吸引長が有意に増加することが示されました。この手法を用いて、細胞膜のコレステロールが枯渇すると細胞の剛性が増加し、一方でコレステロールを濃縮しても影響がないことが的に明らかになりました。ここでは、最大吸引長に達した時のコレステロール濃縮細胞、コントロール細胞、およびコレステロール枯渇細胞を、−15 mmHgの条件下で示しています。通常、突起は−10 mmHgで形成され始め、膜変形に要する時間は、−10、−15、および−20 mmHgの陰圧において測定されました。ここでは、最大吸引長を印加圧力の関数としてプロットしています。-15 mmHgおよび-20 mmHgの圧力において、枯渇細胞の最大正規化長は対照細胞よりも有意に低くなりました。-25 mmHgを超える負圧を印加したところ、吸引された突起が脱落し、独立した小胞が形成されました。膜の剥離を引き起こした圧力レベルは、異なるコレステロール条件下で同等であり、これは予期せぬ観察結果であった。先行研究では、膜コレステロールの増加が膜脂質二重層の剛性を高めることが示されている。この手法を習得すれば、適切に行った場合に2〜3時間で完了させることができる。この手法を試みる際は、本実験が個々の細胞に対して行われるものであることを念頭に置くことが重要である。したがって、1つの条件につき3〜5個の細胞を解析し、これを計3回の独立した実験で実施してください。

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Bioengineering

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セルの剛性を推定するために基板に接続された細胞のマイクロピペット吸引

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