Name: 多発性嚢胞腎疾患で、ヒトとマウスの染色体異常を研究するためにスペクトル核型分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: 学ぶスペクトル核型分析（SKY）による多発性嚢胞腎疾患におけるヒトとマウスの染色体異常検出法。この技術は複雑な染色体転座を可視化し、遺伝性疾患のメカニズム解明に貢献します。

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著者は彼らの技術支援のためにブライアンMuntean、シャオ·ロー、マキ高橋ブレアメルに感謝します。この作品は、NIH（DK080640）とDr。スーリヤNauliにトレド＆ProMedicaトランスレーショナルリサーチ刺激のための賞の大学からの賞によってサポートされていました。

1。細胞の前処理と中期の準備<ol><li>彼らは70から80パーセントがコンフルエントに達するまで細胞は、5％CO 2インキュベーターで37で10〜15％ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリン/ストレプトマイシン°Cを含むイーグル培地（DMEM）のダルベッコの改変で栽培されています。 </li><li> 30〜60分間は0.05μg/ mlのコルセミド溶液で細胞を処理します。 </li><li> 50 mlの滅菌ファルコン遠心チューブ内の任意の浮遊細胞を含む培地を収集します。 sterile1X-PBSでプレート上で細胞を洗浄します。 1〜2分間滅菌したトリプシンでインキュベートした後、収穫し、同じチューブに残りの細胞を収集します。 </li><li> 5分間1000rpmでチューブを回転させ、上清を残して0.5 mlを吸引し、唯一の指でフリックでペレットを緩めます。 </li><li>ペレットのサイズに応じて、dH 2 Oでの0.56％のKClの低張液の5〜10 mlを追加し、30から45分間37℃で懸濁液をインキュベートします。 </li><li>メタノール/酢酸の一滴を追加します。（3:1​​ vol / vol）のml当たり低張性の細胞懸濁液と混合するために穏やかにチューブを反転させる。 </li><li>継続的にペレットをフリックしながら5分間1200rpmで遠心分離し、ステップ1.4としてペレットを収集し、新鮮なメタノール/酢酸（3:1 vol / vol）の固定液を滴下し、5 mlを加える。この手順では、中期スプレッドは実験が損なわれる細胞の塊の中に閉じ込めされないようにすることが重要です。 </li><li> 5分間1200rpmで再び遠心し、チューブの壁に沿って氷冷メタノール/酢酸固定液の5〜10 mlを加える。必要に応じて、この段階で、細胞は短期または-80 -20°Cで締めて密封チューブ内に固定液に保存することができます°C今後の使用のために長期（年）。 </li><li>無水エタノールできれいにスライドし、スライドの表面に水の鞘を形成するためにapproximately10XためのdH 2 Oでスライドを浸す。 （ステップ1.8からの細胞懸濁液をガラス板とドロップ15-20μlの上でスライドを配置する） &quot;10からスライドの上に1-2分間65から70に設定され水浴°Cでスライドを置き、乾燥させます。 </li><li>中期染色体スプレッドは等間隔があることを確認すること10Xと40Xの乾燥の目標を使用して光学顕微鏡下でスライドを確認してください。染色体を周囲の細胞質の存在を確認してください。細胞質は、現在のスライドの前処理（ペプシン消化）を続行している場合には細胞質が存在しないと染色体は、優れた形態を持っている場合は、スライドの前処理の必要はありません。 </li></ol> 2。スライドの前処理（ペプシン処理） <ol><li> 24ミリメートル×60 mmの顕微鏡のカバーガラスに2X-SSCに溶解し、1:200のRNase溶液（20 mg / ml）を120μLを適用し、優しく中期スライド面を反転してインキュベートし、カバーガラス上で中期のスライドを下向きに反転させる37℃で45分間。 </li><li>慎重にスライドを傷つけず​​にカバーガラスを除去し、コプリンジャーに2X-SSC緩衝液中で15分間毎に5分を洗う振とう。 </li><li>きれいなビーカーにペプシン原液の5〜15μL（dH 2 Oで100 mg / ml）を追加して、あらかじめ温めておいた100mlの追加（を37°C）0.01M HClを。 これは、ペプシンがクリーンに追加されることが重要です。直接HCl溶液に最初のではなく、ビーカー、それ以外の場合は、溶液に溶解しませんでした。で37塩酸/ペプシン溶液の入ったコプリンジャーにスライドをインキュベートし、3〜5分間°C。あまりにも多くの消化が染色体がoverdigestedされるようになりますし、少なすぎると消化は、プローブの非特異的な結合につながるとのハイブリダイゼーションシグナルに干渉する可能性のある細胞質消化のままになり、このステップは非常に重要です。 </li><li>室温で二回、5分間100ミリリットル1X-PBSを含むコプリンジャーにスライドを洗浄します。 </li><li>室温で5分間（1X-PBS 950 mlの1M MgCl 2の50ミリリットル）が100ミリリットル1X-PBS/MgCl 2を含むコプリンジャーにスライドを洗浄します。 </li><li>コプリンジャーcontaininのスライドを配置する室温（1X-PBS/MgCl 2の100ミリリットルの37％ホルムアルデヒドの1.7 ml）をgで10分間100ミリリットル、1％ホルムアルデヒド。 </li><li> 5分間100ミリリットル1X-PBSを含むコプリンジャーにスライドを洗浄します。 </li><li>スライドが適切に消化されず、細胞質が存在しないと染色体の形態が保持されていることを確認する40X乾燥したレンズを使用して光学顕微鏡下でスライドを観察します。ダイヤモンドペンを用いたハイブリダイゼーションの領域を選択します。 </li></ol> 3。染色体とプローブの変性とハイブリダイゼーション<ol><li>新鮮な変性溶液（70％formamide/2X SSC、pH7.0）で70〜80にprewarm℃〜70℃の水浴で変性溶液を含むコプリンジャーにスライド水浴場所に置かれコプリンジャーに°を準備します。マウスの染色体と80°C、C 30-1.5分間のヒト染色体のために。 </li><li>直ちに3 80％と続いminと3分ごとに、空気乾燥した100％のエタノール、氷冷70％エタノールでスライドを配置します。スライドを調べる染色体の形態のために。優れた染色体の形態は、暗い染色体とされていません &quot;相光&quot;またはハロ染色体によって表されます。 </li><li>数秒間、1000rpmで簡単に20分、ボルテックスと遠心分離のために振とうしながら37℃で、SkyPaintプローブ（バイアル1位SKY塗装キット）を温める。 </li><li> preannealingのために標識プローブDNAを許可するように60分間37°Cに続いて5分サイクルの85℃で2段階のサイクルのためにプログラムサーモプローブを変性させる。 </li><li> 22ミリメートル×40 mmのカバーガラスには気泡をトラップしないようにして作るとのハイブリダイゼーションとカバーの領域に変性したプローブを10μlの適用されます。 48から72時間37℃で加湿チャンバーのゴムセメントとインキュベートするとカバーガラスの端をシールします。 </li></ol> 4。蛍光プローブの検出<ol><li>慎重にカバーガラスを除去し、（45°C）、洗浄液I（2×SSCで新たに調製し、50％ホルムアミド）予熱を含むコプリンジャーにスライドを配置します。 5分間洗浄45三回45回転で振とう水浴中°C </li><li>振とうしながら45回溶液II（1X SSC）℃で5分間の洗浄でスライドを洗浄します。 </li><li> 45℃で5分間解IIIを（4X SSC/0.1％Tween 20）で洗浄℃の振とうしながらスライドを洗浄します。 </li><li>ブロッキング試薬80μlの（SKYのペイントキット、バイアル＃2）を適用し、30分間37℃でカバースリップとインキュベートを配置します。 </li><li>スライドを削除し、流体が流出することができます。 Cy5で染色試薬（濃縮抗体検出CADキット、バイアル＃3）80μlを適用し、40分間37℃でカバーガラスとインキュベートを適用します。 </li><li>振とうしながら5分間45°Cで3回ソリューションIIIを洗浄してスライドを洗浄します。 </li><li> Cy5.5染色試薬（濃縮抗体検出CADキット、バイアル＃4）80μlを適用し、40分間37℃でカバーガラスとインキュベートを配置します。 </li><li>振とうしながら5分間45°Cで3回ソリューションIIIを洗浄してスライドを洗浄します。 </li><li>スライドを傾けて、流体を許可<html>ドレイン。アンチフェード試薬DAPI（SKYのペイントキット、バイアル＃5）の20μlを適用し、24ミリメートル×60 mmの顕微鏡のカバーガラスを配置します。慎重に形成されているかもしれない空気の泡を削除します。スライドはすぐに撮影さまたは4℃で保存し1週間を超えないために暗闇の中でCすることができます。 </li></ol> 5。画像収集と分析<ol><li>画像の取得は60X油浸レンズを搭載したオリンパス顕微鏡、スペクトルキューブ（カスタム設計されたトリプルバンドパスフィルタ）、DAPIフィルターとCCDカメラによるサニャック干渉計モジュールを使用して、中期のスライドを表示することによって達成されます。 </li><li>スペクトル核型は、ユーザーズマニュアルは、次のスカイビュー·ソフトウェア（応用分光イメージングバージョン1.62）を用いて行った。 </li><li>画像を分析した後、染色体はカラー画像（特定の蛍光色を含む）、擬似カラー画像（分類のための色）と反転DAPI画像（特定のバンディングパターン）と見なすことができます。 </li></ol>e_title &quot;&gt; 6。代表的な結果完全SKY手順は、通常1週間程度の時間（ 図1）をとります 。これは、中期細胞が十分に供給されていることを提供された画像の取得と分析が含まれています。核型分析では、野生型マウス（ 図2a）からの細胞の正常なマウスの核型（40、XY）を明らかにする。対照的に、PKD1から細胞- / -マウス（PKDモデルマウス）染色体数や染色体欠失（染色体＃8）と転座（染色体＃11と19）（ 図2b）のような構造異常の有意な増加を示しています。また、ADPKD患者から血管組織を分析した。染色体の数を数えることによって、単純な研究では、非ADPKDといくつかのADPKD血管のサンプルは23対の染色体の正常な数値（ 図2c）を有していたことが示された。しかし、一般的に、我々は、染色体の46ペアで、その結果、染色体分離の障害を観察したDPKDサンプルの代わりに23対（ 図2d）。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3887/3887fig1.jpg" /> 図1。 SKYプロトコルのフローチャート。SKYプロトコルは細胞の前処理と中期の準備からの画像取得と解析を開始する実験を完了する手順を示しています。のフローチャートおおよそ一週間のタイムラインは日ごとにステップバイステップの手順で左側に提示されます。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3887/3887fig2.jpg" /> 図2。不死化マウス細胞株と新たに単離されたヒト初代培養細胞のスペクトル核型分析。個々の染色体の色と反転DAPI画像は染色体のソートの前に示されています。並べ替えの後、染色体は&quot;分類&quot;テーブルに表示されます。）は、野生型マウスからの中期スプレッドのSKYイメージが正常核型（40、XY）が含まれています。B） </st栄PKD1から中期スプレッドの&gt;空画像- / -マウスは、異常な染色体数（68の代わりに40）、このような染色体欠失（染色体＃8）と染色体転座（染色体＃11と19）のような染色体異常を示しています。C）SKY非ADPKD患者の血管組織からの中期スプレッドのイメージは、正常な核型（46、XX）を備えています。d）は ADPKD患者の血管組織から広がる中期の空のイメージは、異常な核型（92、XXXX）が含まれています。データの一部は、以前報告され、許可14で再利用されています。

<ol><li>Caspersson, T., Farber, S., Foley, G. E., Kudynowski, J., Modest, E. J., Simonsson, E., Wagh, U., Zech, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+differentiation+along+metaphase+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Chemical differentiation along metaphase chromosomes.</a> Experimental Cell Research. 49, 219-222 (1968).</li>
<li>Seabright, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+banding+technique+for+human+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">A rapid banding technique for human chromosomes.</a> Lancet. 2, 971-972 (1971).</li>
<li>Padilla-Nash, H. M., Barenboim-Stapleton, L., Difilippantonio, M. J., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+karyotyping+analysis+of+human+and+mouse+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Spectral karyotyping analysis of human and mouse chromosomes.</a> Nature Protocols. 1, 3129-3142 (2006).</li>
<li>Schrock, E., Zschieschang, P., O'Brien, P., Helmrich, A., Hardt, T., Matthaei, A., Stout-Weider, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+karyotyping+of+human%2C+mouse%2C+rat+and+ape+chromosomes--applications+for+genetic+diagnostics+and+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenetic+and+Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Spectral karyotyping of human, mouse, rat and ape chromosomes--applications for genetic diagnostics and research.</a> Cytogenetic and Genome Research. 114, 199-221 (2006).</li>
<li>Padilla-Nash, H. M., Heselmeyer-Haddad, K., Wangsa, D., Zhang, H., Ghadimi, B. M., Macville, M., Augustus, M., Schrock, E., Hilgenfeld, E., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jumping+translocations+are+common+in+solid+tumor+cell+lines+and+result+in+recurrent+fusions+of+whole+chromosome+arms%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+Chromosomes+%26+Cancer%22%5BJournal%5D)">Jumping translocations are common in solid tumor cell lines and result in recurrent fusions of whole chromosome arms.</a> Genes, Chromosomes & Cancer. 30, 349-363 (2001).</li>
<li>Veldman, T., Vignon, C., Schrock, E., Rowley, J. D., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hidden+chromosome+abnormalities+in+haematological+malignancies+detected+by+multicolour+spectral+karyotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Hidden chromosome abnormalities in haematological malignancies detected by multicolour spectral karyotyping.</a> Nature Genetics. 15, 406-410 (1997).</li>
<li>Karpf, A. R., Matsui, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+disruption+of+cytosine+DNA+methyltransferase+enzymes+induces+chromosomal+instability+in+human+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Genetic disruption of cytosine DNA methyltransferase enzymes induces chromosomal instability in human cancer cells.</a> Cancer Research. 65, 8635-8639 (2005).</li>
<li>Matsui, S., Faitar, S. L., Rossi, M. R., Cowell, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+spectral+karyotyping+to+the+analysis+of+the+human+chromosome+complement+of+interspecies+somatic+cell+hybrids%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Genetics+and+Cytogenetics%22%5BJournal%5D)">Application of spectral karyotyping to the analysis of the human chromosome complement of interspecies somatic cell hybrids.</a> Cancer Genetics and Cytogenetics. 142, 30-35 (2003).</li>
<li>Nestor, A. L., Hollopeter, S. L., Matsui, S. I., Allison, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+genetic+complementation+controlling+the+chromosomal+abnormalities+and+loss+of+heterozygosity+formation+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenetic+and+Genome+Research%22%5BJournal%5D)">A model for genetic complementation controlling the chromosomal abnormalities and loss of heterozygosity formation in cancer.</a> Cytogenetic and Genome Research. 116, 235-247 (2007).</li>
<li>Ried, T., Liyanage, M., du Manoir, S., Heselmeyer, K., Auer, K., Macville, M., Schrock, E. Tumor cytogenetics revisited: comparative genomic hybridization and spectral karyotyping. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRied%2C+T+%22Journal+of+Molecular+Medicine+%28Berlin%2C+Germany%29%22">Journal of Molecular Medicine (Berlin, Germany)</a>. 75, 801-814 (1997).</li>
<li>AbouAlaiwi, W. A., Takahashi, M., Mell, B. R., Jones, T. J., Ratnam, S., Kolb, R. J., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+polycystin-2+is+a+mechanosensitive+calcium+channel+involved+in+nitric+oxide+signaling+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Ciliary polycystin-2 is a mechanosensitive calcium channel involved in nitric oxide signaling cascades.</a> Circulation Research. 104, 860-869 (2009).</li>
<li>Nauli, S. M., Alenghat, F. J., Luo, Y., Williams, E., Vassilev, P., Li, X., Elia, A. E., Lu, W., Brown, E. M., Quinn, S. J., Ingber, D. E., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycystins+1+and+2+mediate+mechanosensation+in+the+primary+cilium+of+kidney+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Polycystins 1 and 2 mediate mechanosensation in the primary cilium of kidney cells.</a> Nature Genetics. 33, 129-137 (2003).</li>
<li>Nauli, S. M., Kawanabe, Y., Kaminski, J. J., Pearce, W. J., Ingber, D. E., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cilia+are+fluid+shear+sensors+that+regulate+calcium+signaling+and+nitric+oxide+production+through+polycystin-1%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Endothelial cilia are fluid shear sensors that regulate calcium signaling and nitric oxide production through polycystin-1.</a> Circulation. 117, 1161-1171 (2008).</li>
<li>AbouAlaiwi, W. A., Ratnam, S., Booth, R. L., Shah, J. V., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+from+humans+and+mice+with+polycystic+kidney+disease+are+characterized+by+polyploidy+and+chromosome+segregation+defects+through+survivin+down-regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells from humans and mice with polycystic kidney disease are characterized by polyploidy and chromosome segregation defects through survivin down-regulation.</a> Human Molecular Genetics. 20, 354-367 (2011).</li>
<li>Padilla-Nash, H. M., Nash, W. G., Padilla, G. M., Roberson, K. M., Robertson, C. N., Macville, M., Schrock, E., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cytogenetic+analysis+of+the+bladder+carcinoma+cell+line+BK-10+by+spectral+karyotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+Chromosomes+%26+Cancer%22%5BJournal%5D)">Molecular cytogenetic analysis of the bladder carcinoma cell line BK-10 by spectral karyotyping.</a> Genes, Chromosomes & Cancer. 25, 53-59 (1999).</li>
</ol>

利害の衝突が宣言されません。

スペクトル核型分析（SKY）は、ゲノムと染色体の組成を研究に使用される細胞遺伝学手法です。この手法では、染色体彩色プローブを活用し、これらのプローブの検出は、サニャック干渉計を介して取得されます。完全SKYプロセスは、通常1週間程度かかり、それはいくつかの重要なステップ（ 図1）が含まれます。 SKYは、最初のパディリャ、ナッシュら 3によって説明された標準プロトコルを使用しています。プロトコルは、以来、我々を含む様々な細胞遺伝学研究所、によって適合されています。 プロトコルの重要なステップの中で、良い品質の中期の準備が成功したSKYの分析を持っていることが極めて重要である。染色体があまりにも多くの細胞質を持っている場合や、スライドが古すぎる場合は、たとえば、画像の品質が損なわれる可能性があります。私たちのムービークリップで見られるように、細胞質の内容は簡単に差動の高解像度を使用して識別することができます干渉コントラスト顕微鏡技術。さらに、積極的に分裂する細胞の可用性は、SKY解析のための前提条件であり、これ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgroメディアテック株式会社</td><td> 10から013-CV </td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清（FBS） </td><td>ハイクローン</td><td> SH30088-03 </td><td></td></tr><tr><td> Penecillin /ストレプトマイシン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> SV30010 </td><td></td></tr><tr><td>コルセミド</td><td>ロシュ·ダイアグノスティックス</td><td> 10 295 892 001 </td><td> 10μg/ mlの</td></tr><tr><td>塩酸</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> A144-500 </td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> S77375-1 </td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> SH30256-01 </td><td></td></tr> &lt;TR&gt; <td> SKYペイントプローブキット（ヒト） </td><td>適用されたスペクトルイメージング</td><td> SKY000028 </td><td></td></tr><tr><td> SKYペイントプローブキット（マウス） </td><td>適用されたスペクトルイメージング</td><td> SKY000030 </td><td></td></tr><tr><td>濃縮された抗体検出キット</td><td>適用されたスペクトルイメージング</td><td> SKY000033 </td><td></td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> SH30236.01 </td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> A433P-4 </td><td></td></tr><tr><td>酢酸</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> A38-212 </td><td></td></tr><tr><td> RNaseの</td><td>ロシュ·ダイアグノスティックス</td><td> 10 109 169 001 </td><td></td></tr><tr><td>ペプシン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> P6887-5G </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2を </td><td>フルカ</td><td> 63069-500ML </td><td></td></tr><tr><td> 37％ホルムアルデヒド</td><td>マリンクロット·ベーカー</td><td> 2106から02 </td><td></td></tr><tr><td> 20X SSC </td><td>プロメガ</td><td> V4261 </td><td></td></tr><tr><td>ホルムアミド</td><td>フルカ</td><td> 47671 </td><td>使用直前に準備する</td></tr><tr><td> Tween-20を</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> BP337-500 </td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡のスライドガラス</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 12から549 </td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡のカバーガラス24x60mm </td><td> VWRビスタビジョン</td><td> 16004-312 </td><td></td></tr><tr><td>ゴムのり</td><td>エルマーの（ローカル小売店） </td><td></td><td></td></tr><tr><td>ハイブリダイゼーション/ humidifiedchamber /トレイ</td><td> Simport </td><td> M920-2 </td><td>下部の湿紙タオルを置く</td></tr><tr><td>サーモサイクラー</td><td>エッペンドルフ</td><td> Epgradient S </td><td></td></tr><tr><td>プラットフォーム/オービタルシェーカーを振る</td><td> Bellcoバイオテクノロジー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>揺れ/水浴</td><td>精密科学</td><td></td><td></td></tr><tr><td> DAPIフィルターキューブ</td><td>クロマテクノロジー</td><td></td><td></td></tr><tr><td> SKYフィルターキューブ</td><td>クロマテクノロジー</td><td></td><td></td></tr><tr><td> SpectraCube </td><td>適用されたスペクトルイメージング</td><td></td><td></td></tr><tr><td>反転した細胞培養顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>ニコンのEclipse TS100 </td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>オリンポス</td><td> IX70 </td><td> 60X油</td></tr></tbody></table>

多発性嚢胞腎疾患で、ヒトとマウスの染色体異常を研究するためにスペクトル核型分析

Spectral Karyotyping to Study Chromosome Abnormalities in Humans and Mice with Polycystic Kidney Disease

識別し、個々の染色体を分類する従来の方法は、1、2を分析している特定の種の各染色体のユニークなバンドパターンに依存しています。この古典的なバンディング技術は、しかし、そのような癌に関連付けられているような複雑な染色体異常を識別するのに信頼できるものではありません。バンディング技術の限界を克服するために、スペクトル核型分析（SKY）は、染色体異常に多くの信頼できる情報を提供するために導入されています。 SKYは、スペクトル顕微鏡3、4と中期染色体を検出するために多色蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）テクニックです。 SKYは、遺伝的疾患や悪性腫瘍5、6の大規模な番号に関連付けられている染色体異常の広い範囲の細胞遺伝学的分析のための貴重なツールであることが実証されています。 SKYは、縮退oligonucleから調製された多色蛍光標識DNAプローブの使用を含むPCR法によるotideプライマー。したがって、すべての染色体は差蛍光染料（ローダミン、テキサスレッド、Cy5で、FITC及びCy5.5）の混合物で標識されたプローブとのin situハイブリダイゼーション後のユニークなスペクトル色を持っています。 SKYに使用されるプローブは、7月10日 55染色体特異的プローブまでで構成されています。 SKYの手順は、いくつかの手順を実行します（ 図1）が含まれます。 SKYは、正常または病気の組織や血液から高い分裂指数と細胞の可用性を必要とします。新たに単離した初代培養細胞または細胞株のいずれかから単一細胞の染色体は、ガラススライド上に広がっています。この染色体の広がりは、各染色体の特定の蛍光色素の異なる組み合わせで標識されている。プローブ検出と画像取得のために、スペクトルイメージングシステムは、サニャック干渉計とCCDカメラで構成されています。これは、サンプルから発せられる可視光スペクトルの測定を可能にし、あちこちスペクトル画像を取得するメートル、個々の染色体。 HiSKY、撮影した画像の結果を分析するために使用されるソフトウェアは、染色体異常の簡単な識別を提供しています。最終結果は、中期染色体の各ペアは、異なる色（ 図2）を有する核型分類のイメージです。これは染色体のアイデンティティと転座を簡単に識別することができます。詳細については、適用されるスペクトルイメージングのWebサイト（参照してください<a href="http://www.spectral-imaging.com/" target="_blank">http://www.spectral-imaging.com/</a> ）。 SKYは、最近、常染色体優性多発性嚢胞腎疾患（ADPKD）、一次繊毛11-13の機能不全を特徴とする遺伝性疾患とヒトとマウスの染色体の分離の欠陥と染色体異常の同定に使用されていました。このテクニックを使用して、我々は異常な染色体の分離とADPKD患者およびマウスモデル14の染色体の欠陥の存在を実証。 SKYを使用して更なる分析は、私たちは、染色体数とIDを識別するためだけでなく、正確にそのような染色体欠失と転（ 図2）のような非常に複雑な染色体異常を検出することはできませんだけ。

スペクトル核型分析（SKY）は、ゲノムと染色体異常を識別するための高度な細胞遺伝学的手法です。この手法は、すべての染色体の分類を可能にする染色体ペインティングプローブ、を利用しています。 SKYはまた、多発性嚢胞腎疾患を含む様々な疾患を持つマウスとヒトの複雑な染色体異常や偏析欠陥を識別することができます。

個々の染色体を識別および分類するための従来の手法は、特定の種における各染色体の固有のバンディングパターンに依存しており、それは...

本手法の目的は、染色体ペイントプローブを用いて染色体を標識し、多嚢胞性腎疾患を患うマウスおよびヒトにおける染色体異常および分離欠損を同定することである。まず、ヒトまたはマウスから細胞を回収してsmidで処理し、次いで固定を行い、ガラススライド上にメタフェーズスプレッド（中期染色体像）を調製する。その後、ハイブリダイゼーションの妨げとなる余分なRNAおよび細胞質を除去するために、スライドの前処理を行う。これは、それぞれRNA分解酵素とペプシンを用いて消化することで行われます。次に、染色体とプローブの変性を行い、続いてハイブリダイゼーションを行うことで染色体を標識します。最終ステップは、蛍光色素を用いたプローブの検出です。最終的に、蛍光顕微鏡による観察およびSkyviewソフトウェアを用いた画像キャプチャと解析を通じて、染色体数の異常や構造異常を示す結果を得ることができます。従来のGIMs（擬似中期核）屈曲法などの既存の手法に対する本技術の主な利点は、染色体転座や、従来の屈曲法では特徴づけられない複雑な染色体再構成といった、複雑な染色体異常に関する追加情報を提供できる点にあります。この手法は、嚢胞性腎疾患の分野において、嚢胞性腎臓形成のメカニズムなどの重要な疑問を解決するのに役立ちます。本手順のデモンストレーションはDr.Wiam Abuおよび当研究室の優秀なシニアポストドクターが行います。まず、内皮細胞を10〜15%胎児牛血清および1%ペニシリン・ストレプトマイシンを含むDMEMを用い、37°C、5%二酸化炭素条件下で、細胞が70〜80%コンフルエントになるまで培養します。次に、細胞を最終濃度0.05 mg/mLのCole溶液で37°Cで30〜60分間処理した後、回収します。細胞を回収するには、まず、浮遊細胞を含む培地を50 mLの滅菌遠心チューブに回収します。滅菌済みトリプシンで1～2分間インキュベートした後、プレート上の細胞を滅菌済み1×PBSで洗浄し、残りの細胞を回収して同じチューブに集めます。1000 rpmで5分間遠心分離して細胞をペレット化した後、チューブ内の上清の大部分を吸引し、ペレットの上に約0.5 mLを残します。チューブを軽く叩いて細胞ペレットをほぐします。次に、ペレットの大きさに応じて、蒸留水で調製した0.56%塩化カリウム高張液を5〜10 mL加え、懸濁液を37 °Cで30〜45分間インキュベートします。インキュベート後、1 mLピペットを用いて、高張細胞懸濁液1 mLあたり1滴の氷冷固定液を加えます。その後、細胞を1,200 rpmで5分間遠心分離し、チューブを静かに転倒させて混合します。前と同様に上清を吸引します。次に、ペレットを弾きながら、新鮮な固定液1 mLをゆっくりと加えます。その後、さらに4 mLの固定液をチューブの壁面に沿って静かに加えます。この手順は、メタフェーズ・スプレッドが細胞の塊に閉じ込められないようにするために極めて重要です。遠心分離ステップを繰り返し、上清を吸引した後、固定液をチューブの壁に沿ってゆっくりとピペッティングし、5～10 mLの固定液を補充します。この段階で、細胞はキャップをしっかりと締めて密封したチューブに入れ、準備が整うまで短期的には-20 °Cで、長期的には-80 °Cで保存することが可能です。準備が整ったら、細胞標本中の中期染色体数を数えます。スライドを絶対エタノールで洗浄してください。次に、スライドを蒸留水に10回ほど浸し、スライド表面に水膜を形成させます。スライドをガラスプレートの上に置き、スライドから10インチ上の高さから細胞懸濁液を15〜20 µL滴下します。スライドを65〜70 °Cに設定したウォーターバスに1〜2分間浸し、乾燥させます。10倍および40倍のドライ対物レンズを用いて、光学顕微鏡下でスライドを確認してください。中期染色体が存在し、分散が均等であることを確認します。また、染色体周囲の細胞質の状態を確認してください。このように細胞質が存在する場合は、スライドの前処理に進みます。細胞質が存在せず、染色体の形態が良好である場合は、スライドの前処理を行う必要はありません。新鮮に調製した 20 mg/mL の RNase ソリューションを 2×SSC で 1:200 に希釈した溶液 120 µL を 24 mm × 60 mm のカバーガラスに滴下します。メタフェーズスライドをカバーガラスの上に裏返して置きます。その後、メタフェーズスライドをゆっくりと正面向かいに反転させます。スライドを加湿チャンバーに入れ、37 degrees Celsiusで45分間インキュベートします。インキュベーション時間が経過したら、スライドに傷をつけないよう注意してカバーガラスを取り除き、カップリングジャー内でSSCバッファーを用いて、振盪しながら5分間ずつ3回洗浄します。その間に、清潔なビーカーに蒸留水で調製した100 mg/mLのpepinを5〜15 µL加え、次に37 °Cに予熱した0.01 M塩酸を100 mL加えます。PEPを先に清潔なビーカーに加えることが重要であり、そうしないと溶解しません。この溶液をコプランジャーに移します。消化後、洗浄済みスライドをカップリングジャーに入れ、37 °Cで3〜5分間インキュベートします。1 XPBSを含むコピンジャー内で、スライドを振盪しながら5分間ずつ2回洗浄します。続いて、塩化マグネシウムを添加したPBSを含むコピンジャーで5分間洗浄します。次に、1%ホルムアルデヒドを含むコピンジャーで10分間インキュベートし、最後に1×PBSを含むコピンジャーで5分間洗浄します。その後、70%、80%、100%の連続したエタノール溶液を含むコピンジャーでそれぞれ2分間脱水し、風乾させます。光学顕微鏡を用いて40倍のドライレンズでスライドを観察し、スライドが適切に消化されていること、細胞質が残存していないこと、および染色体の形態が維持されていることを確認します。最後に、ダイヤモンドペンを用いてハイブリダイゼーション用の領域を選択します。調製したばかりの変性溶液をコピンジャーに入れ、ウォーターバスで70 °Cに予熱します。次に、スライドを、70 °Cの水浴中で予熱した変性溶液が入ったコチン瓶に入れ、30秒から1分間保持します。インキュベーション後、直ちにスライドを氷冷した70%エタノールに3分間浸し、続いて80%および100%エタノールにそれぞれ3分間浸した後、風乾させます。スライドを観察し、染色体が淡色または光沢を帯びず、濃い色に見えるか、その形態を確認します。良好な染色体または形態を示します。スカイペイントを温めます。37 °Cで振盪しながら20分間プローブ反応を行います。その後、ボルテックスミキサーで撹拌し、1000 rpmで短時間遠心分離します。サーモサイクラーを用いて、プローブを85 °Cで5分間加熱して変性させた後、37 °Cでインキュベートします。変性させたプローブを10 µL、ハイブリダイゼーション領域に滴下し、22 mm × 40 mmのカバーガラスで覆い、1時間静置します。気泡が入らないように注意しながら、カバーガラスの端をラバーセメントで密封し、加湿チャンバー内で37 °Cで48〜72時間インキュベートします。カバーガラスを慎重に取り除き、45 °Cに予熱した新鮮な洗浄液が入ったカップリングジャーにスライドを入れます。45 °Cに設定したシェーキングウォーターバスを用い、45 rpmで5分間の洗浄を3回繰り返します。次に、スライドを45 °Cの洗浄液2で、振盪しながら5分間ずつ2回洗浄し、続いて45 °Cの洗浄液3で振盪しながら5分間洗浄します。次に、ブロッキング剤を80 µL添加します。その後、カバーガラスを被せ、37 °Cのインキュベーターで30分間インキュベートします。カバーガラスを取り除き、液を排出させます。sci-fi染色試薬を80 µL滴下します。カバーガラスを被せ、37 °Cで40分間インキュベートします。インキュベーション後、45 °Cに加温した洗浄液3を用いて、振盪しながら5分間の洗浄を3回行います。次に、PS 5.5染色試薬を80 µL滴下します。カバーガラスを載せ、37 °Cで40分間インキュベートした後、前述と同様に洗浄液3で3回洗浄します。最後に、スライドを傾けて液体を排出させます。Antifa dappy試薬を20 µL滴下し、24 mm × 60 mmのカバーガラスを載せます。気泡が生じている場合は慎重に取り除いてください。スライドはすぐにイメージングするか、4 °Cの暗所で1週間以内に保存してください。野生型マウスの正常な中期分裂像のこの画像は、60倍油浸レンズを搭載したOlympus顕微鏡を使用して撮影されました。スペクトラルキューブとして知られるカスタム設計のトリプルバンドパスフィルター、ダッピーフィルター、およびCCDカメラを備えたSAC干渉計モジュールを使用した。スペクトラル核型分析はskyviewソフトウェアを用いて実施した。左上のパネルはラベル付けされた中期分裂像を、右上のパネルはその明視野像を示している。下のパネルは、skyviewソフトウェアを用いて昇順にソートされた染色体を示しています。pkd1ホモ接合型ノックアウトマウスの中期分裂像のこのSKY画像では、本来40本であるべき染色数が68本となっており、染色数異常が認められます。また、第8染色体の欠失などの染色体異常や、第5染色体と第16染色体間、および第11染色体と第19染色体間の転座などの染色体転座も見られます。非A-D-P-K-D患者の血管組織から得られたヒト染色体の中期メタフェーズ像（SKY像）であり、44本の常染色体と2本のXXX染色体を持つ正常な女性核型を示しています。この最終的なSKY像は、A-D-P-K-D患者の血管組織から得られた中期メタフェーズ像であり、88本の常染色体と4本のXXXX性染色体という異常な核型を示しています。マスター1枚。この手法は、適切に実施すれば5日間で完了させることができます。

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Research

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Medicine

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PNA-FISHによるマウスのBリンパ球における染色体異常の迅速分析

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人間の病気に関連する遺伝子の変異は明らかになるを開始するにつれて急速に識別された亜種の生物学的意義を評価するシステムの開発がますます重要になっております。このプロトコルでは、私はマウス卵母細胞を使用して女性の減数分裂の間人間遺伝子の働きを評価する方法について説明します。...

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マウス腎臓の インビボ 分析のための3Dロボット超音波の使用

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血管疾患の研究のためのマウスにおける同所性大動脈移植

学ぶスペクトル核型分析（SKY）による多発性嚢胞腎疾患におけるヒトとマウスの染色体異常検出法。この技術は複雑な染色体転座を可視化し、遺伝性疾患のメカニズム解明に貢献します。

多発性嚢胞腎疾患で、ヒトとマウスの染色体異常を研究するためにスペクトル核型分析

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