TCRとそれに関連するシグナル伝達タンパク質のリアルタイムの同時イメージングのための全反射顕微鏡法

このビデオでは、2チャンネル同時取得を用いてT細胞受容体のシグナリングイベントを追跡する手順について説明します。全内部反射蛍光顕微鏡（TIRF顕微鏡）を用います。まず、T細胞にGFPタグ付きZAP 70をコードするプラスミドをトランスフェクションします。次に、脂質アンカーペプチド、MHC複合体、接着分子、および共刺激分子を組み込んだガラス支持脂質二重層を調製します。

T細胞受容体がペプチドMHC複合体によって活性化された際に、ZAP 70を導入したT細胞を二重層に添加します。T細胞受容体に関連するCD3鎖がSrcファミリーキナーゼのLCKによってリン酸化され、キナーゼであるZAP 70が細胞質からリクルートされます。その後、T細胞受容体を蛍光標識し、細胞をカバーグラスよりも屈折率の低い培地に浸し、全反射が起こる角度でレーザー光を照射してイメージングを行います。

これにより、ガラスと水の界面にエバネッセント波が生成されます。この波は媒質中を指数関数的に減衰し、浸透深さは100から200 nanometersとなります。したがって、細胞膜上またはその極めて近くにある蛍光分子のみが励起されます。得られた画像を解析すると、シグナリングがT細胞受容体マイクロクラスター内で起こっていることが明らかになります。

TIRF顕微鏡法（全内反射照明蛍光顕微鏡法）または従来の共焦点顕微鏡法の主な利点は、分解能が向上するため、TCRマイクロクラスターなどのシグナリングクラスターやシグナリング複合体を容易に可視化できることです。私の研究室のポストドクターであるTravis CritesとChenが、maxi nucleofector技術を用いてマウス一次T細胞にトランスフェクションを行い、その後、抗原を含むガラス支持脂質二分子膜で刺激し、TIRF顕微鏡を用いてイメージングする方法を実演します。

この手法は、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、マスト細胞を含む様々な免疫細胞におけるシグナリングの研究に広く用いられてきました。本手法は汎用性が高く、哺乳類細胞のほとんどの受容体システム、特にクラスター内でシグナリングが発生する場合の研究に適用可能です。T細胞はトランスフェクションが非常に困難であるため、この手法に不慣れな方は、最初は苦労する可能性があります。

さらに、T細胞の生存率とトランスフェクション効率、バイラーの品質、および顕微鏡の調整が基準を満たすよう、精密な調整が必要です。本手順の最初のステップでは、AM maxa mouse T-cell nucleo effector kitを用いて、ナイーブT細胞またはin vitroで活性化させた一次T細胞に、発現プラスミドおよびGFPタグ付きのシグナル伝達分子をコードする配列をトランスフェクションします。本研究で使用したすべてのT細胞は、KのMHC分子IEに見られるMCCペプチドを認識するA-N-D-T-C-Rを発現しています。ここで示すトランスフェクション手順は、製造元の推奨事項に従って実施しています。

ただし、トランスフェクション後のT細胞の生存率を高めるためのいくつかのコツを紹介します。生存率とトランスフェクション効率は、ナイーブ細胞よりもin vitroで活性化したT細胞の方が高いため、本プロトコルでは開始前にin vitroで活性化したT細胞を使用します。2 mLチューブに、キット付属の培地1.9 mL、コンポーネントA 20 µL、コンポーネントB 20 µL、および胎児牛血清100 µLを合わせ、トランスフェクション1回あたり2 mLの補充済みT細胞培地を調製します。

12ウェルプレートの各ウェルに、培地を2 mLずつ分注します。培地を平衡化させるため、プレートを37 °Cの加湿インキュベーター内に少なくとも1時間置きます。転染細胞を、低温またはpH 7.2以外の培地で再懸濁すると、細胞死を招きます。転染混合液を調製するには、マウスT細胞用ヌクレオエフェクター溶液 82 µL、サプリメント2 18 µL、および濃度 0.5 µg/µL 以上のエンドトキシンフリープラスミドDNA 5 µgを合わせ、タッピングにより十分に混合します。

500万から1,000万個の細胞を15 mL centrifuge tubeに移し、室温で75 ×gで5分間遠心分離します。遠心後、真空吸引器を用いて上清を可能な限り除去し、細胞ペレットをトランスフェクション混合液で再懸濁させます。細胞の大きな凝集体がなくなるまで、細胞ペレットを3～4回ゆっくりと丁寧に吸引します。ピペットを使用して、気泡が入らないように注意しながら、懸濁液を認定済みのamaxa veteに慎重に移します。

核エフェクターデバイス上で、qve選択核エフェクタープログラムX 0 0 1をキャッピングします。veteをQ veteホルダーに挿入し、ボタンを押して選択したプログラムを適用します。その後、すぐにveteとあらかじめ平衡化した培地をフードへ移します。

付属のプラスチック製ピペットを使用して、あらかじめ平衡化した培地を約500 microliters、veteに加えます。次に、プレート内の培地に細胞懸濁液を、1滴ずつ滴下して加えます。

GFPタグ付きタンパク質を低レベルで発現させ、過剰発現によるアーティファクトの発生を最小限に抑えるため、細胞を37 °Cで4時間インキュベートします。このセクションでは、顕微鏡のすべてのコンポーネントに電源を入れる前に、2チャンネル同時イメージングのための顕微鏡調整方法について説明します。コンピューターとソフトウェアを起動してください。

次に、すべてのハードウェアコンポーネントがソフトウェアによって認識されていることを確認します。ソフトウェアがエラーメッセージなしに起動したため、すべてのコンポーネントが検出されています。サブ解像度の溶液を1 µL希釈します。

共局在化標準として使用するため、Flores bright multi fluorescent microspheresを2 mLのPBSに懸濁します。次に、このマイクロスフィア懸濁液0.25 mLを、Lab Tech社製の8ウェルチャンバーカバーガラスシステムの各ウェルに添加します。チャンバースライドシステムを対物レンズ上のプラットフォームに設置します。

次に、ライブプレビューでガラス上のビーズ吸着部をフォーカスします。左側のペインはGFP導入細胞が見えるチャンネルです。右側のペインには、ライブセルイメージング実験中の標識TCRが表示されます。

XY ZファイバーランチャーのY方向調整を用いて、レーザービームが対物レンズから射出し、天井に投影されるようにビームの位置を調整します。この操作は、対物レンズがガラス面でフォーカスが合う位置にある時に行うことが重要です。天井上のビームが拡散している場合は、ビームがコリメートされていません。

実験に使用する各レーザーラインについて、Zマイクロメーターを調整し、完全なコリメーションテストコリメーションを実現させます。次に、レーザーパワーメーターを用いて、各チャネルのレーザー出力を20〜30 µWに調整します。T細胞はレーザー放射に極めて敏感であるため、合計照射強度は50 µWに制限してください。

次に、ターフの角度を設定します。ファイバーローンチのY方向アライメントマイクロメーターを回して、対物レンズの光軸に対するビームの角度が90度に近づくまで、ビームを天井から遠ざけます。

全反射の臨界角に達すると、レーザー光は対物レンズから出なくなります。ターフのアライメントが達成されているかを確認するために、カバーガラスの平面を挟んで上下にピントを合わせてください。ここで、表面に吸着したビーズのピントが外れると、多くのビーズが溶液中に浮遊しているのが見えることに注意してください。良好なターフアライメントを実現するには、対物レンズに対するビームの角度を大きくする必要があります。

ビームの角度を大きくすると、表面付近に浮遊しているビーズが見えなくなり、界面に吸着したビーズの強度が上昇します。ここで、界面に吸着したビーズをフォーカスから外すと、溶液中に浮遊しているビーズは一切見えなくなります。この時点で、カバースリップに吸着したビーズのみがフォーカスに入るため、ステージの調整が適切に完了したことになります。

次に、赤色と緑色の蛍光チャンネルを互いに整合させるため、ビーズに焦点を合わせ、両チャンネルで作成された画像内の識別可能な特徴の位置を比較します。片方のカメラスタンドにあるXおよびYマイクロメータネジを使用して、ビーズの相対的な位置を可能な限り近づけます。ここで、両方の画像の左下四分面にある明るいビーズを確認し、2つのチャンネル間の空間的な整合性を確保してください。

この特徴を、両方の画像で同じ相対位置に合わせます。両方のチャンネルから画像をキャプチャして保存してください。これらの画像は、2つのチャンネルを整列させるための共局在標準として使用されます。

このアライメントの例として、アライメント前の状態をここに示します。サブ解像度ビーズの2つのチャンネルからの画像を重ね合わせたこの画像に見られるように、一方のチャンネルが他方に対して回転しています。調整後、画像はここに示すようにアライメントされます。

GFPを導入した生細胞の画像を比較することで、アライメントの精度をさらに詳細に確認できます。2つのチャンネルにおけるLailaポディウムが完全に一致していることに注目してください。これは、蛍光マイクロビーズを用いて確立したキャリブレーションに基づき、2つの画像をアライメントした結果です。

顕微鏡のセットアップが完了したら、抗原を提示するガラス支持脂質二重層を含むフローチャンバーを調製し、まず基質と相互作用するTRANSFECTED T細胞を可視化するためにturf Mを実施します。AnaおよびDustinによって記述されたプロトコルに従い、Ni-NTA脂質、接着分子ICAM-1、およびペプチドMHC複合体を含むガラスカバースリップ上に平面脂質二重層を形成してフローチャンバーを組み立てます。MCCをロードしたIEFKは、ヒスチジンタグを介して二重層に組み込まれます。

共刺激分子CD 80を組み込みます。GPIアンカーを用いてフローセルを顕微鏡のステージ上に配置し、チャンバーをテンションバーで固定して顕微鏡ステージ上のアダプタープレートに取り付け、安定させます。次に、温度を制御するため、メーカー提供の加熱要素をフローセルに取り付けます。

対物レンズをバイレイヤー上に配置し、バイレイヤー平面に焦点を合わせます。その後、フローセルおよび対物レンズのヒーターをオンにし、チャンバーの温度を37 °Cに調整します。4時間のインキュベーション後、分断したT細胞を15 milliliterチューブに移し、80 ×gで遠心分離します。細胞を300 µLのH-B-S-B-S-A緩衝液で再懸濁します。次に、TCRを標識するために、H 57 FABを最終濃度10 µg/mL、またはH 57シングルチェーン可変フラグメントを最終濃度20 µg/mLとなるように添加します。

細胞を5 mLのファルコンチューブに移します。次に、1 mLのスリップチップシリンジを用いて、三方コックを介して細胞をフローチャンバーに注入します。デュアルチャンネルでのライブキャプチャにより、TCRおよびGFPチャンネルのライブプレビューが表示されるようにイメージング条件を設定し、トランスフェクションされた細胞が存在する視野を探します。

TCRとGFPの間で強度に差があるため、両方のチャネルで細胞を可視化できるように、画像のスケーリングをリアルタイムで調整する必要がある場合があります。ここで行っているように、ガラス面までフォーカスを上げて側面の膜染色が検出されるかを確認し、ターフ照明を確認してください。側面の膜にフォーカスが合わなければ、ターフのアライメントは良好です。

このライブプレビューでは、カバースリップの平面上および、顕微鏡を良好なz軸方向の調整（turf alignment）に合わせるためにカバースリップの焦点をずらした際の両方で、側方膜の染色が確認できます。対物レンズに対するレーザーの角度を大きくすると、側方膜の焦点が外れます。10秒の間隔で、個別の画像およびタイムラプスシーケンスのキャプチャを開始してください。

細胞を、1平方マイクロメートルあたり6分子のペプチドがロードされたヒスタグ付きIEFKを含むガラス支持INTAバイレイヤー上で5分間インキュベートした。また、1平方マイクロメートルあたり100分子のAlexa 647結合ヒスタグ付きICAM-1および1平方マイクロメートルあたり100分子のGPIアンカー型CD80を添加した。Alexa 546結合H57 FABフラグメントを継続的に存在させた状態で、デュアルチャンネル同時取得TIRF顕微鏡観察を行った。

TCRを染色するため、細胞はバイレイヤーと最初に接触してから最大1時間後にイメージングされました。細胞あたりのZAP 70クラスター数は、自動クラスターカウントソフトウェアを用いて解析されました。各ケースにおいて、少なくとも40個の細胞が解析されました。

ロードされたペプチドをインセットに示します。ICAM 1は、Alexa 647が共役したHisタグ付きICAM 1を1平方マイクロメートルあたり100分子含むバイレイヤー上の細胞を指します。図に示すように、zap 70依存性シグナリングはTCRマイクロクラスター内で発生し、本動画（1フレームあたり10秒で撮影）に見られるように、アゴニストリガンドに反応してのみ起こります。

アゴニストペプチドに応答したTCRシグナリングは、接触領域の周辺部においてZAP 70をリクルートするTCRマイクロクラスターが持続的に形成されることで維持されます。このビデオを視聴することで、maxa核導入技術を用いて初代T細胞にトランスフェクションし、TIRF顕微鏡を用いてGFPTシグナリング分子のTCRマイクロクラスターへのリクルートを適切にイメージングする方法を十分に理解できるはずです。この技術を習得すれば、適切に実施することで7時間以内に完了させることができます。

この手順を行う際は、初代細胞を非常に慎重に扱うことが重要です。実験の各段階で細胞の状態が良好であるほど、トランスフェクション効率が高まり、イメージングで捕捉できる細胞数も増加します。T細胞は運動性が非常に高く、その結果、TCRチャンネルとGFPチャンネルを順次イメージングすると、TCRマイクロクラスターおよび細胞の移動により、2つの画像が完全に一致しなくなります。

この課題を克服するため、我々はデュアルチャンネル同時取得ターフ顕微鏡を開発しました。