Name: Nanodisc脂質粒子にABCトランスポーターの再構成のためのステップ·バイ·ステップ方式 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-31T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: 学ぶABCトランスポーターMalFGK2をナノディスク脂質粒子に再構成する方法。膜タンパク質を可溶化環境で研究し、ゲル濾過クロマトグラフィーで精製する安定した複合体を作製する技術です。

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この作品は、保健研究のカナダの研究所によってサポートされていました。 CSCは、自然科学とカナダの工学研究評議会からのポスドクによって賄われていた。 FDはティアIIカナダリサーチチェアです。

<html>全体の再構築プロセス再構成プロセスは、洗剤で可溶化したリン脂質の存在下で精製MalFGK 2複合体と膜骨格タンパク質（MSP）を混合することによって開始されます。ステップは、Bio-ビーズまたはアンバーライト（ 図1）と呼ばれるポリスチレン系吸着材による洗剤の遅い除去のあとに続いています。自動組立工程が原因疎水性リン脂質、MalFGK 2錯体とMSP両親媒性タンパク質の表面との間の非極性相互作用の可能性が高くなります。最終製品はMalFGK 2錯体を包み込むMSPの2分子からなる円盤状の粒子である。粒子は、超遠心分離および分析用サイズ排除クロマトグラフィーにより付加物および凝集体から分離される。粒子はネイティブゲル電気泳動および動的光散乱分光法によって特徴付けられる。 膜足場タンパク質、MSPのタイトル &quot;&gt; 1。準備<ol><li> hisタグMSPは、（バージョンMSP1D1 1） 大腸菌におけるプラスミドpMSP1D1から生産され大腸菌 BL21（DE3）OD 600に誘起〜0.5mMのイソプロピル-β-D-1-チオガラクトピラノシドを37℃で3時間℃で0.5 </li><li>細胞は4℃で10分間5000×gで℃で遠心分離により回収し、100μMフェニルメタンスルホニルフッ化物を含むTSG10バッファーに再懸濁する。 </li><li>セルが8000 psiでフレンチプレス（3×）で溶解させ、不溶物を4℃で10分間5000 xgで遠心分離により除去されるMSPを含む可溶性画分を45分間125000×gで超遠心分離によって分離されています。 </li><li> MSPは、ニッケルキレートクロマトグラフィーTSG10バッファに〜1.5ミリリットルNiセファロースHPを用いて精製する。汚染物質を、50mMイミダゾールを含むTSG10バッファーで洗い流される。 MSPは600 mMを含むTSG10緩衝液で溶出されイミダゾール。精製したタンパク質はTSG10バッファに透析し、10月15日〜mg / mlのタンパク質濃度で-70℃に保存されています。 </li></ol> 2。 MalFGK 2複合体の調製<ol><li> MalFGK 2複合体は、MalKのC末端にHisタグ、 大腸菌におけるプラスミドpBAD22-FGKから発現される大腸菌 BL21（DE3）およびOD 600に誘起〜37℃で3時間で0.2％のL-アラビノース℃で0.5 </li><li>ステップ1.3のように、細胞溶解及び遠心分離後、膜ペレットを5 mg / mlの最終濃度でTSG20バッファーに再懸濁する。材料は、穏やかに振盪しながら4℃で3時間1％w / vのn-ドデシル-β-マルトピラノシド（DDM）℃で可溶化する。 </li><li>不溶性物質は、ステップ1.3および可溶化を含む上清のように超遠心分離により除去される MalFGK 2複合体を回収し、精製工程1.4のように、しかし、透析せずにされています。 </li><li> Furtherの浄化をSuperdex 200 HR 10 / 0.5ml /分の流速で300カラムでTSGDバッファーでゲルろ過クロマトグラフィーによって達成される。 </li></ol> 3。リン脂質の調製<ol><li> E.クロロホルムに溶解させた大腸菌総脂質抽出物は、スクリューキャップマイクロチューブは1,000 nmolのアリコートに分けられます。溶媒を窒素気流下で蒸発させ、真空デシケーター中でさらに一晩乾燥させる。 </li><li>脂質膜は、5 nMの最終濃度でTSバッファに溶解し、激しくボルテックスや超音波処理する。溶解した脂質が原因で水性TSバッファにおける彼らの一般的な不溶性に若干不透明に見えるでしょうが、彼らは、懸濁液のままにしてください。 DDMは、溶液が透明になる時0.5％（〜10mm）の最終濃度に添加される。 </li><li>脂質混合物を約5秒間5回超音波処理し、水浴及びパルスに配置されます。脂質混合物を1おしっこの最大4℃で保存されているK。 </li></ol> 4。バイオビーズの調製<ol><li>約10〜15ミリリットル（乾燥体積）バイオビーズを50mlチューブに入れています。 </li><li>ビーズを順次100％メタノール、95％エタノール、ミリQ H 2 O、および最終的にTSバッファ（二回）50mlで洗浄されています。 </li><li>洗浄したビーズは、4℃で保存するC〜10ミリリットルTSバッファインチ</li></ol> 5。 Nanodisc再構成<ol><li> MSPは〜7 mg / mlの（〜0.3 mM）の最終濃度でTSGD緩衝液中で希釈されています。 </li><li> MSP：TSGDバッファ内1:3:60または1:3:400の脂質比精製MalFGK 2複合体の約2 nmolのはタンパク質で混合される。最終濃度は6μmMalFGK 2、18μMのMSPおよび360μMの脂質（1:3:60）または2.4 mMの脂質（1:3:400）です。最終容量は300μlです。最終DDMの濃度は0.08％（〜1.6 mm）です。グリセロールの最終濃度は脂質の量に依存する追加されましたが、周りに5から10パーセントV / Vのまま</lI&gt; <li> 〜バイオビーズ懸濁液50μlをチューブに添加し、混合物を4℃で揺動テーブルの上に一晩インキュベートする。 </li><li>ビーズは、重力により沈降し、溶液を、できるだけ多くのバイオビーズを避けるために、狭い先端から分注される。 </li><li>沈殿大は20分間100,000×gで超遠心分離により除去される。ディスクはTSG10バッファ内のステップ2.4​​のようにゲルろ過クロマトグラフィーにより精製される。ディスクを含む画分をプールし、アリコート製剤の安定性をテストするために、同じゲル濾過カラムに再注入する必要があります。 </li><li>精製されたディスクは、長時間にわたって-70℃で保存することができます。氷の上で解凍後、ディスクは潜在的な沈殿物を除去するために、ステップ5.5のように、超遠心分離を行うべきである。アリコートは有意な凝集や沈殿が解凍時に発生しなかったことを確認するためにゲルろ過クロマトグラフィーで分析する必要がありますプロセス。 </li></ol> 6。ネイティブゲル電気泳動<ol><li> nanodiscsの1μM（〜0.2㎎/ ml）を再構成する（ 図3A）の品質を評価するためのネイティブPAGE 6,7（トリス-HCl pH 8.8、4-12％）によって分析される。 </li><li> 2複雑なMalFGKに男性の結合（1μM）はnanodiscsで再構成はまた、未変性PAGE（ 図3A）により評価される。 </li><li>泳動後、ゲルを10分間クマシーブルーで染色されており、約1時間脱色した。 </li></ol> 7。動的光散乱（DLS） <ol><li> Nanodiscsを​​Superdex 200 HR 10 / 0.1ml /分の流速で300カラムを用いてTSG10バッファ内のステップ2.4​​のように、ゲルろ過クロマトグラフィーにより精製される。 nanodiscsを​​含む画分をプールし、アミコン遠心フィルターで〜10 mg / mlに集中している。 </li><li>サンプルは使用DLSによって分析前（0.22μmフィルター）2回濾過さ1μlの内部体積石英キュベットでDynaPro nanostar楽器（ワイアットテクノロジー）。データは直径、粒子の分子量を推定するためにDynamicsソフトウェア（ワイアット·テクノロジー）を使用して装着されている。 </li></ol> 8。 ATPase活性測定<ol><li> MalFGK 2 -再構成nanodiscsのATPase活性は比色分析8を用いて決定される。 </li><li>精製されたディスクと1mMのATP1μMのは20分間、男性と37℃での増加量と一緒に混合されています。無機リン酸塩の放出は660 nmで測定する。 </li><li>解放リン酸の量は、リン標準溶液を用いて作成した標準曲線と比較されます。 </li></ol> 9。代表的な結果 nanodiscsは、ゲルろ過クロマトグラフィー（ 図2A、左 ）によって精製される。クロマトグラムを示し、その再構成されたdの過半数ISCS（黒のトレース）の単一ピークとして溶出し、一方、過剰な脂質（赤いトレース）ボイドボリュームに溶出して、広範な一連のピークとして作らディスク。 nanodiscsの質はさらに、ネイティブゲル電気泳動および動的光散乱法（DLS）によって分析されます。脂質の過剰の存在下で再構成されたものはスミア（ 図2A、右 ）のように移行するのに対し、適切に再構成されたディスクには、ゲル上の鋭いバンドとして移行されます。 DLSによる分析は、ディスクの人口は11.4 nmの（ 図2B）の平均粒径が均一であることを示しています。再構成されたディスクはDLS近似に基づいた215 kDaの見かけの分子量を有する。過剰な脂質の存在下で再構成したサンプルは、非均質な試料のために典型的である100nmであり、周囲に広く分布している半径を表示します。 MalFGK 2複合体の質がATPアーゼによるネイティブ·ゲル電気泳動し、その活性によって評価される測定結果（ 図3）。マルトース結合タンパク質の男性はMalFGK 2輸送9,10への高親和性で結合する。非変性ゲル電気泳動を使用して、それは男性とMalFGK 2（ 図3A）との複合体を検出することが可能である。男性がMalK 2 ATPase活性の刺激は、 図3Bに示されている。 <img src="/files/ftp_upload/3910/3910fig1.jpg" alt="図1"/> 図1。再構成プロトコルのための典型的なフローチャート。 <img src="/files/ftp_upload/3910/3910fig2.jpg" alt="図2"/> 図2。 nanodisc準備。Aの品質管理または高脂質比（1/3/400、赤いトレース）; nanodiscsのゲル濾過分析（スーパーデックス200 HR 10/300カラム）は、低脂質比（黒トレース1/3/60）で再構成した。同じディスクの準備のネイティブゲル電気泳動。モルkDaでecular量マーカーが表示されている。同じディスクの準備B.動的光散乱分析。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3910/3910fig2large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img src="/files/ftp_upload/3910/3910fig3.jpg" alt="図3"/> 図3。 MalFGK 2 nanodisc粒子の分析。A. MalFGK 2 nanodisc粒子の量が増加するとともにインキュベート男性のゲルシフト解析。男性の濃度の関数としてMalFGK 2 nanodisc粒子BのATPase活性。

<ol><li>Denisov, I. G., Ginkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+self-assembly+of+monodisperse+phospholipid+bilayer+Nanodiscs+with+controlled+size%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Directed self-assembly of monodisperse phospholipid bilayer Nanodiscs with controlled size.</a> J. Am. Chem. Soc. 126, 3477-3487 (2004).</li>
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<li>Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochromes+P450+in+Nanodiscs%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Cytochromes P450 in Nanodiscs.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1814, 223-229 (2011).</li>
<li>Zhang, X. X., Chan, C. S., Bao, H., Fang, Y., Foster, L. J., Duong, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanodiscs+and+SILAC-based+mass+spectrometry+to+identify+a+membrane+protein+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Nanodiscs and SILAC-based mass spectrometry to identify a membrane protein interactome.</a> J. Proteome Res. , Forthcoming (2011).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

我々はnanodiscsにマルトーストランスポーターの再構成のための簡単​​な手順を説明します。トランスポーターは、ATPアーゼ活性であり、水溶性の結合パートナーの男性との相互作用が（ 図3）再現することができます。 nanodiscsにトランスポーターの成功した再構成には、追加の生物物理学的および生化学的解析のための道を開く。特に興味深いのは、体系的な分析洗剤、リポソームとnanodiscsでMalK ATPaseおよびマルトース輸送活性になります。 ABCトランスポーターは、トランスポート·サイクル中のコンフォメーションを変更しますが、これらのコンフォメーション変化に脂質の寄与が模索されていない。 nanodiscの製作は比較的簡単ですが、まだ最適な条件からのわずかなずれは、不可逆的なタンパク質凝集につながることができます。脂質の過剰量はproductioにつながるので、脂質比：本稿では、正しいタンパク質を選択することの重要性を強調nanodiscの生物物理学的な資格に応答しない大多分散リポソーム状粒子のn。マルトーストランスポーター（1/1...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td>アミコンウルトラ-4 50K遠心フィルター</td><td>ミリポア</td><td> UFC805008 </td><td>適切な使用については、製造元のプロトコルに従ってください</td></tr><tr><td>バイオビーズSM-2吸着剤</td><td>バイオ·ラッド</td><td> 152-3920 </td><td></td></tr><tr><td> 大腸菌総脂質</td><td>アヴァンティ極性脂質</td><td> 100500C </td><td>クロロホルムに溶解し、有機溶剤に応じて扱う</td></tr><tr><td> NiセファロースHPの樹脂</td><td> GEヘルスケア</td><td> 17-5268-01 </td><td></td></tr><tr><td>リン標準溶液</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P3869 </td><td></td></tr><tr><td> pMSP1D1 </td><td> Addgene </td><td> 20061 </td><td></td></tr><tr><td>たSuperdex 200 HR 300分の10 </td><td> GEヘルスケア</td><td> 17-5172-01 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 表Iに特異的な試薬。 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> 名前 </td><td> 構図 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> DDMの株式</td><td>の10％w / vのDDM </td><td> -20℃でミリQ水とストアに再懸濁</td></tr><tr><td> MalFGK 2株式</td><td> 1から2 mg / mlの 50mMトリス-HCl、pH7.9 100mMのNaCl 10％v / vのグリセロール 0.03パーセントw / vのDDM </td><td> -70℃で保存精製後</td></tr><tr><td> MSPの株式</td><td> 10から15 mg / mlの 50mMトリス-HCl、pH7.9 100mMのNaCl 10％v / vのグリセロール</td><td> -70℃で保存&lt;1mlのアリコートで精製後や過度の凍結/融解サイクルを避ける</td></tr><tr><td>リン脂質株式</td><td> 5nMのE.大腸菌総脂質 0.5パーセントw / vの（10mM）を、DDM 50mMのトリス-HCl、pH 7.9 50mMのNaCl </td><td> 1週間に4℃で保存</td></tr><tr><td> TSバッファ</td><td> 50mMのトリス-HCl、pH 7.9 50mMのNaCl </td><td> 4℃で保存</td></tr><tr><td> TSG10バッファ</td><td> 50mMトリス-HCl、pH7.9 100mMのNaCl 10％v / vのグリセロール</td><td> 4℃で保存</td></tr><tr><td> TSG20バッファ</td><td> 50mMトリス-HCl、PH8 100mMのNaCl 20パーセントv / vグリセロール</td><td> 4℃で保存</td></tr><tr><td> TSGDバッファ</td><td> 50mMトリス-HCl、pH7.9 100mMのNaCl 10％v / vのグリセロール 0.03パーセントw / vのDDM </td><td> 4℃で保存し、使用直前にDDMを追加</td></tr><tr><td colspan="3"> 表II。ソリューションレシピ。 </td></tr></tbody></table></td></tr></tbody></table>

nanodisc脂質粒子にabcトランスポーターの再構成のためのステップ·バイ·ステップ方式

A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles

nanodiscは、円盤状の粒子（〜10月12日NM大）リン脂質二重層の小さなパッチにトラップ膜タンパク質ということです。 nanodiscは特にリガンド - 受容体相互作用の文脈では、膜タンパク質を研究するために特に魅力的な選択肢である。 Sligarらによって開拓方法はアポリポタンパク質A1由来組み換え高ヘリカル足場タンパク質の両親媒性の性質に基づいている。極地は、水性環境に直面し、一方足場タンパク質の疎水性面は、脂質二重層の脂肪アシル側鎖と相互作用する。粒子が小さく、均質かつ水溶性であるためnanodiscsにおける膜タンパク質の解析がリポソーム上の重要な利点を持っています。また、通常は水溶性タンパク質に予約生化学的および生物物理学的手法を適用し、膜のいずれかの側からすることができます。この視覚的なプロトコルでは、我々はよく特性のステップ·バイ·ステップの再構成を提示terized細菌のABCトランスポーター、男性MalFGK 2複合体。ディスクの形成は、洗剤の進歩的な除去の際に行われている疎水性相互作用に依存して自己組織化プロセスである。私たちは本質的な手順を説明し、私たちは集合体と大きい多分散リポソーム状粒子の形成を制限するために、正しいタンパク質対脂質比を選択することの重要性を強調。単純な品質は、そのようなディスクが正しく再構成されていることを確認し、ゲル濾過クロマトグラフィー、天然ゲル電気泳動および動的光散乱分光法として制御します。

Nanodiscsはリン脂質二重層の小さなパッチに膜タンパク質を組み込んだ小さな円盤状の粒子である。我々は、ディスクへのMalFGK2ポーターのステップ·バイ·ステップの取り込みを示し視覚プロトコルを提供します。

Nanodisc脂質粒子にABCトランスポーターの再構成のためのステップ·バイ·ステップ方式

The nanodisc is a discoidal particle (~ 10-12 nm large) that trap membrane proteins into a small patch of phospholipid bilayer. The nanodisc is a ...

この手順の全体的な目的は、A, b, Cトランスポーター（この場合はマルトーストランスポーターmalf GK 2）を可溶性膜ナノディスク粒子に組み込むことです。これはまず、膜スキャフォールドタンパク質MSPを、トランスポーターおよび適切な量の脂質とともに界面活性剤ミセル内で混合することで達成されます。第2ステップでは、ポリスチレンビーズを添加し、混合物を一晩緩やかに揺動させます。これにより、界面活性剤が徐々にビーズに吸収され、ナノディスク粒子が形成されます。次に、沈降によってビーズを除去します。最終ステップとして、ゲルろ過クロマトグラフィーを用いて、適切に形成されたディスクを、凝集体および未アセンブリのスキャフォールドタンパク質から分離します。最後に、ネイティブゲル電気泳動または光散乱分光法によりディスクの品質を評価します。リポソームなどの他の手法と比較した本手法の主な利点は、膜タンパク質とディスクが水溶液中で完全に可溶であることです。さらに、タンパク質ドメインの両側からアクセスが可能になります。膜コンパートメントを必要としないため、異なる長さの膜スキャフォールドタンパク質を用いることで、膜タンパク質のさまざまなリガンド状態を捕捉し研究することができました。最も重要な点は、この手法がABCトランスポーターの新規結合パートナーの同定など、膜プロテオミクス分野における重要な疑問への回答に寄与できることです。実際、この技術の意義は治療法への応用にも及び、膜タンパク質や受容体の活性化剤または阻害剤の発見に役立つ可能性があります。この方法は単純に見えますが、適切なタンパク質と脂質の比率を選択する際には注意が必要です。一般的に、この方法に不慣れな人は、適切なモル比の算出や、調製の品質を保証するための適切なコントロールの設定に苦労することがあります。したがって、この方法を視覚的に実演することは、新しい学生がさまざまな手順や潜在的な困難を学ぶ上で非常に有用です。大腸菌BL21(DE3)株を用い、プラスミドpMSSP1D1からヘキサヒスチジンタグ付きMSPを発現させます。600 nmにおける吸光度（OD₆₀₀）が約0.5に達した時点でタンパク質発現を誘導し、37 °Cで3時間培養後、4 °Cにて5,000 ×gで10分間遠心分離して細胞を回収します。得られたペレットを100 µM PMSFを含むTSG10バッファーで再懸濁し、フレンチプレスを用いて8,000 psiで3回細胞を破砕します。4 °Cにて5,000 ×gで10分間遠心分離して不溶性物質を除去します。その後、125,000 ×gで45分間超遠心分離を行い、MSPを含む可溶性画分を分離します。TSG 10緩衝液を用い、約1.5 mLのNickel Sepharose High Performanceを使用したニッケルキレートクロマトグラフィーによりMSPを精製します。50 mMイミダゾールを含むTSG 10緩衝液で不純物を洗浄します。透析後、600 mMイミダゾールを含むTSG 10緩衝液を用いてMSPを溶出させます。TSG 10バッファーMSP中の精製タンパク質は、-70 °Cで、タンパク質濃度を約10から15 mg/mLにして保存することができます。MAL KのC末端にHisタグが付加されたMALF GK 2複合体は、プラスミドpED 22 FG Kから発現させます。E. coli株BL 21(DE3)で培養し、600 nmにおける吸光度（OD600）が約0.5に達した際に0.2% L-アラビノースを添加し、37 °Cで3時間誘導してタンパク質を産生させ、その後、細胞溶解および遠心分離を行います。前回と同様に、メンブレンペレットをTSG 20バッファーに懸濁し、最終濃度を5 mg/mLにします。次に、1% (w/v) GDMを用いて、4 °Cで3時間緩やかに振盪しながら材料を可溶化します。MAL FTK 2の精製時と同様に、超遠心分離によって不溶物を除去します。次に、可溶化されたmal FTK two複合体を含む上清を回収し、ニッケルキレートクロマトグラフィーで再度精製します。さらに、TSGDバッファーを用い、SUEx 200, HR ten three hundredカラムにて、流速0.5 milliliters per minuteでゲルろ過クロマトグラフィーを行い、複合体を精製します。リン脂質を調製するため、クロロホルムに溶解したe coli全脂質抽出物を、スクリューキャップ付きマイクロフィージチューブに1000 anomalずつ分注し、穏やかな窒素気流下で溶媒を蒸発させた後、真空状態で一晩さらに乾燥させます。次に乾燥させ、脂質膜を最終濃度 5 NMO の TS バッファーで溶解し、激しくボルテックスした後、約 5 秒間のパルスソニケーションを 5 回行います。溶解した脂質は、水溶性 TS バッファーに対する一般的な不溶性のためにわずかに不透明に見えますが、懸濁状態を維持している必要があります。DDM を最終濃度 0.5% になるように添加します。この時点で溶液は透明になります。脂質混合物をウォーターバスに入れ、約 5 秒間のパルスソニケーションを 5 回行います。脂質混合物は4°Cで最大1週間まで保存可能です。バイオビーズを準備するには、約10〜15 mLのバイオビーズを50 mLチューブに入れます。まず、100% methanol 50 mLでビーズを洗浄します。ビーズを重力で沈降させ、その後、溶液を静かに捨てます。この工程を、メタノールで1回、次に95% Ethanol、milli Q water、最後にTS bufferでそれぞれ2回ずつ繰り返します。MSPをTSGD bufferで希釈し、最終濃度を約7 mg/mLまたは0.3 mMにして、ナノディスクの構成を開始します。実験を成功させるためには、混合させる脂質とタンパク質の比率を正しく選択することが重要です。精製したmalf GK two complex 約2 µMを、タンパク質：MS P：脂質の比率を1:3:60としてTSGDバッファーで混合し、最終容量を300 µLにします。ここでは、陰性対照として、脂質を過剰に加えた1:3:400の比率のサンプルも調製します。チューブにbio bead懸濁液50 µLを加え、ロッキングテーブルを用いて4 °Cで一晩インキュベートします。翌日、重力でビーズを沈殿させます。ビーズが沈殿したら、bio beadを可能な限り取り込まないよう、細いチップを用いて溶液をピペッティングします。100,000 gで20分間の超遠心分離を行い、大きな沈殿物を除去します。その後、前述の手順に従い、TSG 10バッファーを用いてゲルろ過クロマトグラフィーによりディスクを精製します。次に、調製物の安定性を確認するため、同じゲルろ過カラムにEloquaを注入します。次に、ディスクを含む分画を回収します。調製物の品質は、ネイティブゲル電気泳動によって評価します。1 µMのナノディスクを分析し、再構成の品質を評価してください。また、ナノディスク内で再構成したmal Eとmal ftk 2複合体の結合を評価します。電気泳動後、ゲルをクマシーブルーで10分間染色し、約1時間脱色します。動的光散乱法（DLS）を行うには、まず前述と同様に、Superdex 200 Increase 10/300カラムを用い、流速0.1 mL/minでゲルろ過クロマトグラフィーによりナノディスクを精製します。ナノディスクを含む画分を回収し、AmCon遠心フィルターを用いて約10 mg/mLまで濃縮します。その後、サンプルを2回ろ過します。dynapro nano star装置を用い、内容量1 µLのクォーツキュベットでDLS分析を行います。ダイナミックソフトウェアを用いて粒子の直径と分子量を推定し、コロリメトリックアッセイを用いて、mal FTK 2で再構成したナノディスクのATPアーゼ活性を決定します。まず、1 µMの精製ディスクと1 mMのATPを、増加量のmal eと混合します。サンプルを37 °Cで20分間インキュベートします。次に、660ナノメートルで無機リン酸の放出量を測定します。放出されたリン酸量を、リン標準溶液を用いて作成した標準曲線と比較します。ナノディスクはゲルろ過クロマトグラフィーによって精製します。クロマトグラムから、再構成されたディスクの大部分が単一のピークとして溶出することがわかります。一方、過剰な脂質を用いて作製されたディスクは、空隙容量に溶出するか、あるいは一連のブロードなピークとして溶出します。ディスク調製の品質は、さらにネイティブゲル電気泳動によって分析されます。限定量の脂質で再構成されたディスクはネイティブゲル上でシャープなバンドとして移動しますが、過剰な脂質の存在下で再構成されたものはスマアリングとして移動します。DLS分析の結果、ディスク集団は均質であり、平均半径は5.0 nanometersであることが示されました。DLSの近似に基づくと、再構成されたディスクの見かけの分子量は215 kilodaltonsです。過剰な脂質の存在下で再構成されたサンプルは、100 nanometers付近に広く分布する半径を示しており、これは不均一なサンプルに典型的な結果です。MAL FTK2複合体の活性は、TP加水分解速度およびマルトース結合タンパク質であるMAL Eなどの相互作用パートナーへの親和性を測定することで評価されます。MAL Eは、非変性ゲル電気泳動を用いて、MAL FTK2トランスポーターに高い親和性で結合します。MAL EとMAL FTK2の間の複合体を検出することが可能であり、ここではMAL E濃度に応じたMAL KA TPA活性の促進が示されています。ナノディスクの作製は比較的単純ですが、最適条件からわずかに逸脱するだけで不可逆的なタンパク質の凝集につながる可能性があります。この手法を習得すれば、2日以内に完了させることができます。本手順を実施する際は、適切なタンパク質と脂質の比率を選択することが重要です。脂質が過剰になると、多分散性の大きなリポソーム様の粒子が生成されるためです。そのため、ゲルろ過以外の手法、例えば光散乱分光法、分析超遠心法、あるいはより簡便なネイティブPAGE（非変性ゲル電気泳動）などを用いて、再構成した物質の品質を慎重に分析することが極めて重要です。ディスクに組み込まれるリン脂質の種類や膜スキャフォールドタンパク質の種類が、再構成の効率に影響を与える可能性があることに留意してください。このビデオを通じて、目的の膜タンパク質を含む可溶性で均一なナノディスクを生成する方法について、十分に理解していただけたなら幸いです。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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