Name: Nanodisc脂質粒子にABCトランスポーターの再構成のためのステップ·バイ·ステップ方式 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-31T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: 学ぶABCトランスポーターMalFGK2をナノディスク脂質粒子に再構成する方法。膜タンパク質を可溶化環境で研究し、ゲル濾過クロマトグラフィーで精製する安定した複合体を作製する技術です。

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この作品は、保健研究のカナダの研究所によってサポートされていました。 CSCは、自然科学とカナダの工学研究評議会からのポスドクによって賄われていた。 FDはティアIIカナダリサーチチェアです。

<html>全体の再構築プロセス再構成プロセスは、洗剤で可溶化したリン脂質の存在下で精製MalFGK 2複合体と膜骨格タンパク質（MSP）を混合することによって開始されます。ステップは、Bio-ビーズまたはアンバーライト（ 図1）と呼ばれるポリスチレン系吸着材による洗剤の遅い除去のあとに続いています。自動組立工程が原因疎水性リン脂質、MalFGK 2錯体とMSP両親媒性タンパク質の表面との間の非極性相互作用の可能性が高くなります。最終製品はMalFGK 2錯体を包み込むMSPの2分子からなる円盤状の粒子である。粒子は、超遠心分離および分析用サイズ排除クロマトグラフィーにより付加物および凝集体から分離される。粒子はネイティブゲル電気泳動および動的光散乱分光法によって特徴付けられる。 膜足場タンパク質、MSPのタイトル &quot;&gt; 1。準備<ol><li> hisタグMSPは、（バージョンMSP1D1 1） 大腸菌におけるプラスミドpMSP1D1から生産され大腸菌 BL21（DE3）OD 600に誘起〜0.5mMのイソプロピル-β-D-1-チオガラクトピラノシドを37℃で3時間℃で0.5 </li><li>細胞は4℃で10分間5000×gで℃で遠心分離により回収し、100μMフェニルメタンスルホニルフッ化物を含むTSG10バッファーに再懸濁する。 </li><li>セルが8000 psiでフレンチプレス（3×）で溶解させ、不溶物を4℃で10分間5000 xgで遠心分離により除去されるMSPを含む可溶性画分を45分間125000×gで超遠心分離によって分離されています。 </li><li> MSPは、ニッケルキレートクロマトグラフィーTSG10バッファに〜1.5ミリリットルNiセファロースHPを用いて精製する。汚染物質を、50mMイミダゾールを含むTSG10バッファーで洗い流される。 MSPは600 mMを含むTSG10緩衝液で溶出されイミダゾール。精製したタンパク質はTSG10バッファに透析し、10月15日〜mg / mlのタンパク質濃度で-70℃に保存されています。 </li></ol> 2。 MalFGK 2複合体の調製<ol><li> MalFGK 2複合体は、MalKのC末端にHisタグ、 大腸菌におけるプラスミドpBAD22-FGKから発現される大腸菌 BL21（DE3）およびOD 600に誘起〜37℃で3時間で0.2％のL-アラビノース℃で0.5 </li><li>ステップ1.3のように、細胞溶解及び遠心分離後、膜ペレットを5 mg / mlの最終濃度でTSG20バッファーに再懸濁する。材料は、穏やかに振盪しながら4℃で3時間1％w / vのn-ドデシル-β-マルトピラノシド（DDM）℃で可溶化する。 </li><li>不溶性物質は、ステップ1.3および可溶化を含む上清のように超遠心分離により除去される MalFGK 2複合体を回収し、精製工程1.4のように、しかし、透析せずにされています。 </li><li> Furtherの浄化をSuperdex 200 HR 10 / 0.5ml /分の流速で300カラムでTSGDバッファーでゲルろ過クロマトグラフィーによって達成される。 </li></ol> 3。リン脂質の調製<ol><li> E.クロロホルムに溶解させた大腸菌総脂質抽出物は、スクリューキャップマイクロチューブは1,000 nmolのアリコートに分けられます。溶媒を窒素気流下で蒸発させ、真空デシケーター中でさらに一晩乾燥させる。 </li><li>脂質膜は、5 nMの最終濃度でTSバッファに溶解し、激しくボルテックスや超音波処理する。溶解した脂質が原因で水性TSバッファにおける彼らの一般的な不溶性に若干不透明に見えるでしょうが、彼らは、懸濁液のままにしてください。 DDMは、溶液が透明になる時0.5％（〜10mm）の最終濃度に添加される。 </li><li>脂質混合物を約5秒間5回超音波処理し、水浴及びパルスに配置されます。脂質混合物を1おしっこの最大4℃で保存されているK。 </li></ol> 4。バイオビーズの調製<ol><li>約10〜15ミリリットル（乾燥体積）バイオビーズを50mlチューブに入れています。 </li><li>ビーズを順次100％メタノール、95％エタノール、ミリQ H 2 O、および最終的にTSバッファ（二回）50mlで洗浄されています。 </li><li>洗浄したビーズは、4℃で保存するC〜10ミリリットルTSバッファインチ</li></ol> 5。 Nanodisc再構成<ol><li> MSPは〜7 mg / mlの（〜0.3 mM）の最終濃度でTSGD緩衝液中で希釈されています。 </li><li> MSP：TSGDバッファ内1:3:60または1:3:400の脂質比精製MalFGK 2複合体の約2 nmolのはタンパク質で混合される。最終濃度は6μmMalFGK 2、18μMのMSPおよび360μMの脂質（1:3:60）または2.4 mMの脂質（1:3:400）です。最終容量は300μlです。最終DDMの濃度は0.08％（〜1.6 mm）です。グリセロールの最終濃度は脂質の量に依存する追加されましたが、周りに5から10パーセントV / Vのまま</lI&gt; <li> 〜バイオビーズ懸濁液50μlをチューブに添加し、混合物を4℃で揺動テーブルの上に一晩インキュベートする。 </li><li>ビーズは、重力により沈降し、溶液を、できるだけ多くのバイオビーズを避けるために、狭い先端から分注される。 </li><li>沈殿大は20分間100,000×gで超遠心分離により除去される。ディスクはTSG10バッファ内のステップ2.4​​のようにゲルろ過クロマトグラフィーにより精製される。ディスクを含む画分をプールし、アリコート製剤の安定性をテストするために、同じゲル濾過カラムに再注入する必要があります。 </li><li>精製されたディスクは、長時間にわたって-70℃で保存することができます。氷の上で解凍後、ディスクは潜在的な沈殿物を除去するために、ステップ5.5のように、超遠心分離を行うべきである。アリコートは有意な凝集や沈殿が解凍時に発生しなかったことを確認するためにゲルろ過クロマトグラフィーで分析する必要がありますプロセス。 </li></ol> 6。ネイティブゲル電気泳動<ol><li> nanodiscsの1μM（〜0.2㎎/ ml）を再構成する（ 図3A）の品質を評価するためのネイティブPAGE 6,7（トリス-HCl pH 8.8、4-12％）によって分析される。 </li><li> 2複雑なMalFGKに男性の結合（1μM）はnanodiscsで再構成はまた、未変性PAGE（ 図3A）により評価される。 </li><li>泳動後、ゲルを10分間クマシーブルーで染色されており、約1時間脱色した。 </li></ol> 7。動的光散乱（DLS） <ol><li> Nanodiscsを​​Superdex 200 HR 10 / 0.1ml /分の流速で300カラムを用いてTSG10バッファ内のステップ2.4​​のように、ゲルろ過クロマトグラフィーにより精製される。 nanodiscsを​​含む画分をプールし、アミコン遠心フィルターで〜10 mg / mlに集中している。 </li><li>サンプルは使用DLSによって分析前（0.22μmフィルター）2回濾過さ1μlの内部体積石英キュベットでDynaPro nanostar楽器（ワイアットテクノロジー）。データは直径、粒子の分子量を推定するためにDynamicsソフトウェア（ワイアット·テクノロジー）を使用して装着されている。 </li></ol> 8。 ATPase活性測定<ol><li> MalFGK 2 -再構成nanodiscsのATPase活性は比色分析8を用いて決定される。 </li><li>精製されたディスクと1mMのATP1μMのは20分間、男性と37℃での増加量と一緒に混合されています。無機リン酸塩の放出は660 nmで測定する。 </li><li>解放リン酸の量は、リン標準溶液を用いて作成した標準曲線と比較されます。 </li></ol> 9。代表的な結果 nanodiscsは、ゲルろ過クロマトグラフィー（ 図2A、左 ）によって精製される。クロマトグラムを示し、その再構成されたdの過半数ISCS（黒のトレース）の単一ピークとして溶出し、一方、過剰な脂質（赤いトレース）ボイドボリュームに溶出して、広範な一連のピークとして作らディスク。 nanodiscsの質はさらに、ネイティブゲル電気泳動および動的光散乱法（DLS）によって分析されます。脂質の過剰の存在下で再構成されたものはスミア（ 図2A、右 ）のように移行するのに対し、適切に再構成されたディスクには、ゲル上の鋭いバンドとして移行されます。 DLSによる分析は、ディスクの人口は11.4 nmの（ 図2B）の平均粒径が均一であることを示しています。再構成されたディスクはDLS近似に基づいた215 kDaの見かけの分子量を有する。過剰な脂質の存在下で再構成したサンプルは、非均質な試料のために典型的である100nmであり、周囲に広く分布している半径を表示します。 MalFGK 2複合体の質がATPアーゼによるネイティブ·ゲル電気泳動し、その活性によって評価される測定結果（ 図3）。マルトース結合タンパク質の男性はMalFGK 2輸送9,10への高親和性で結合する。非変性ゲル電気泳動を使用して、それは男性とMalFGK 2（ 図3A）との複合体を検出することが可能である。男性がMalK 2 ATPase活性の刺激は、 図3Bに示されている。 <img src="/files/ftp_upload/3910/3910fig1.jpg" alt="図1"/> 図1。再構成プロトコルのための典型的なフローチャート。 <img src="/files/ftp_upload/3910/3910fig2.jpg" alt="図2"/> 図2。 nanodisc準備。Aの品質管理または高脂質比（1/3/400、赤いトレース）; nanodiscsのゲル濾過分析（スーパーデックス200 HR 10/300カラム）は、低脂質比（黒トレース1/3/60）で再構成した。同じディスクの準備のネイティブゲル電気泳動。モルkDaでecular量マーカーが表示されている。同じディスクの準備B.動的光散乱分析。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3910/3910fig2large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img src="/files/ftp_upload/3910/3910fig3.jpg" alt="図3"/> 図3。 MalFGK 2 nanodisc粒子の分析。A. MalFGK 2 nanodisc粒子の量が増加するとともにインキュベート男性のゲルシフト解析。男性の濃度の関数としてMalFGK 2 nanodisc粒子BのATPase活性。

<ol><li>Denisov, I. G., Ginkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+self-assembly+of+monodisperse+phospholipid+bilayer+Nanodiscs+with+controlled+size%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Directed self-assembly of monodisperse phospholipid bilayer Nanodiscs with controlled size.</a> J. Am. Chem. Soc. 126, 3477-3487 (2004).</li>
<li>Boldog, T., Grimme, S., Li, M., Sligar, S. G., Hazelbauer, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanodiscs+separate+chemoreceptor+oligomeric+states+and+reveal+their+signaling+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Nanodiscs separate chemoreceptor oligomeric states and reveal their signaling properties.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 11509-11514 (2006).</li>
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<li>Glück, J. M., Koenig, B. W., Willbold, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanodiscs+allow+the+use+of+integral+membrane+proteins+as+analytes+in+surface+plasmon+resonance+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Nanodiscs allow the use of integral membrane proteins as analytes in surface plasmon resonance studies.</a> Anal. Biochem. 408, 46-52 (2011).</li>
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<li>Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochromes+P450+in+Nanodiscs%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Cytochromes P450 in Nanodiscs.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1814, 223-229 (2011).</li>
<li>Zhang, X. X., Chan, C. S., Bao, H., Fang, Y., Foster, L. J., Duong, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanodiscs+and+SILAC-based+mass+spectrometry+to+identify+a+membrane+protein+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Nanodiscs and SILAC-based mass spectrometry to identify a membrane protein interactome.</a> J. Proteome Res. , Forthcoming (2011).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

我々はnanodiscsにマルトーストランスポーターの再構成のための簡単​​な手順を説明します。トランスポーターは、ATPアーゼ活性であり、水溶性の結合パートナーの男性との相互作用が（ 図3）再現することができます。 nanodiscsにトランスポーターの成功した再構成には、追加の生物物理学的および生化学的解析のための道を開く。特に興味深いのは、体系的な分析洗剤、リポソームとnanodiscsでMalK ATPaseおよびマルトース輸送活性になります。 ABCトランスポーターは、トランスポート·サイクル中のコンフォメーションを変更しますが、これらのコンフォメーション変化に脂質の寄与が模索されていない。 nanodiscの製作は比較的簡単ですが、まだ最適な条件からのわずかなずれは、不可逆的なタンパク質凝集につながることができます。脂質の過剰量はproductioにつながるので、脂質比：本稿では、正しいタンパク質を選択することの重要性を強調nanodiscの生物物理学的な資格に応答しない大多分散リポソーム状粒子のn。マルトーストランスポーター（1/1...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td>アミコンウルトラ-4 50K遠心フィルター</td><td>ミリポア</td><td> UFC805008 </td><td>適切な使用については、製造元のプロトコルに従ってください</td></tr><tr><td>バイオビーズSM-2吸着剤</td><td>バイオ·ラッド</td><td> 152-3920 </td><td></td></tr><tr><td> 大腸菌総脂質</td><td>アヴァンティ極性脂質</td><td> 100500C </td><td>クロロホルムに溶解し、有機溶剤に応じて扱う</td></tr><tr><td> NiセファロースHPの樹脂</td><td> GEヘルスケア</td><td> 17-5268-01 </td><td></td></tr><tr><td>リン標準溶液</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P3869 </td><td></td></tr><tr><td> pMSP1D1 </td><td> Addgene </td><td> 20061 </td><td></td></tr><tr><td>たSuperdex 200 HR 300分の10 </td><td> GEヘルスケア</td><td> 17-5172-01 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 表Iに特異的な試薬。 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> 名前 </td><td> 構図 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> DDMの株式</td><td>の10％w / vのDDM </td><td> -20℃でミリQ水とストアに再懸濁</td></tr><tr><td> MalFGK 2株式</td><td> 1から2 mg / mlの 50mMトリス-HCl、pH7.9 100mMのNaCl 10％v / vのグリセロール 0.03パーセントw / vのDDM </td><td> -70℃で保存精製後</td></tr><tr><td> MSPの株式</td><td> 10から15 mg / mlの 50mMトリス-HCl、pH7.9 100mMのNaCl 10％v / vのグリセロール</td><td> -70℃で保存&lt;1mlのアリコートで精製後や過度の凍結/融解サイクルを避ける</td></tr><tr><td>リン脂質株式</td><td> 5nMのE.大腸菌総脂質 0.5パーセントw / vの（10mM）を、DDM 50mMのトリス-HCl、pH 7.9 50mMのNaCl </td><td> 1週間に4℃で保存</td></tr><tr><td> TSバッファ</td><td> 50mMのトリス-HCl、pH 7.9 50mMのNaCl </td><td> 4℃で保存</td></tr><tr><td> TSG10バッファ</td><td> 50mMトリス-HCl、pH7.9 100mMのNaCl 10％v / vのグリセロール</td><td> 4℃で保存</td></tr><tr><td> TSG20バッファ</td><td> 50mMトリス-HCl、PH8 100mMのNaCl 20パーセントv / vグリセロール</td><td> 4℃で保存</td></tr><tr><td> TSGDバッファ</td><td> 50mMトリス-HCl、pH7.9 100mMのNaCl 10％v / vのグリセロール 0.03パーセントw / vのDDM </td><td> 4℃で保存し、使用直前にDDMを追加</td></tr><tr><td colspan="3"> 表II。ソリューションレシピ。 </td></tr></tbody></table></td></tr></tbody></table>

nanodisc脂質粒子にabcトランスポーターの再構成のためのステップ·バイ·ステップ方式

A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles

nanodiscは、円盤状の粒子（〜10月12日NM大）リン脂質二重層の小さなパッチにトラップ膜タンパク質ということです。 nanodiscは特にリガンド - 受容体相互作用の文脈では、膜タンパク質を研究するために特に魅力的な選択肢である。 Sligarらによって開拓方法はアポリポタンパク質A1由来組み換え高ヘリカル足場タンパク質の両親媒性の性質に基づいている。極地は、水性環境に直面し、一方足場タンパク質の疎水性面は、脂質二重層の脂肪アシル側鎖と相互作用する。粒子が小さく、均質かつ水溶性であるためnanodiscsにおける膜タンパク質の解析がリポソーム上の重要な利点を持っています。また、通常は水溶性タンパク質に予約生化学的および生物物理学的手法を適用し、膜のいずれかの側からすることができます。この視覚的なプロトコルでは、我々はよく特性のステップ·バイ·ステップの再構成を提示terized細菌のABCトランスポーター、男性MalFGK 2複合体。ディスクの形成は、洗剤の進歩的な除去の際に行われている疎水性相互作用に依存して自己組織化プロセスである。私たちは本質的な手順を説明し、私たちは集合体と大きい多分散リポソーム状粒子の形成を制限するために、正しいタンパク質対脂質比を選択することの重要性を強調。単純な品質は、そのようなディスクが正しく再構成されていることを確認し、ゲル濾過クロマトグラフィー、天然ゲル電気泳動および動的光散乱分光法として制御します。

Nanodiscsはリン脂質二重層の小さなパッチに膜タンパク質を組み込んだ小さな円盤状の粒子である。我々は、ディスクへのMalFGK2ポーターのステップ·バイ·ステップの取り込みを示し視覚プロトコルを提供します。

Nanodisc脂質粒子にABCトランスポーターの再構成のためのステップ·バイ·ステップ方式

The nanodisc is a discoidal particle (~ 10-12 nm large) that trap membrane proteins into a small patch of phospholipid bilayer. The nanodisc is a ...

この手順の全体的な目的は、A, b, Cトランスポーター（この場合はマルトーストランスポーターmalf GK 2）を可溶性膜ナノディスク粒子に組み込むことです。これはまず、膜スキャフォールドタンパク質MSPを、トランスポーターおよび適切な量の脂質とともに界面活性剤ミセル内で混合することで達成されます。第2ステップでは、ポリスチレンビーズを添加し、混合物を一晩緩やかに揺動させます。これにより、界面活性剤が徐々にビーズに吸収され、ナノディスク粒子が形成されます。次に、沈降によってビーズを除去します。最終ステップとして、ゲルろ過クロマトグラフィーを用いて、適切に形成されたディスクを、凝集体および未アセンブリのスキャフォールドタンパク質から分離します。最後に、ネイティブゲル電気泳動または光散乱分光法によりディスクの品質を評価します。リポソームなどの他の手法と比較した本手法の主な利点は、膜タンパク質とディスクが水溶液中で完全に可溶であることです。さらに、タンパク質ドメインの両側からアクセスが可能になります。膜コンパートメントを必要としないため、異なる長さの膜スキャフォールドタンパク質を用いることで、膜タンパク質のさまざまなリガンド状態を捕捉し研究することができました。最も重要な点は、この手法がABCトランスポーターの新規結合パートナーの同定など、膜プロテオミクス分野における重要な疑問への回答に寄与できることです。実際、この技術の意義は治療法への応用にも及び、膜タンパク質や受容体の活性化剤または阻害剤の発見に役立つ可能性があります。この方法は単純に見えますが、適切なタンパク質と脂質の比率を選択する際には注意が必要です。一般的に、この方法に不慣れな人は、適切なモル比の算出や、調製の品質を保証するための適切なコントロールの設定に苦労することがあります。したがって、この方法を視覚的に実演することは、新しい学生がさまざまな手順や潜在的な困難を学ぶ上で非常に有用です。大腸菌BL21(DE3)株を用い、プラスミドpMSSP1D1からヘキサヒスチジンタグ付きMSPを発現させます。600 nmにおける吸光度（OD₆₀₀）が約0.5に達した時点でタンパク質発現を誘導し、37 °Cで3時間培養後、4 °Cにて5,000 ×gで10分間遠心分離して細胞を回収します。得られたペレットを100 µM PMSFを含むTSG10バッファーで再懸濁し、フレンチプレスを用いて8,000 psiで3回細胞を破砕します。4 °Cにて5,000 ×gで10分間遠心分離して不溶性物質を除去します。その後、125,000 ×gで45分間超遠心分離を行い、MSPを含む可溶性画分を分離します。TSG 10緩衝液を用い、約1.5 mLのNickel Sepharose High Performanceを使用したニッケル

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JoVE Journal

Biology

生物学

脂質膜にプロトタイプ電位依存性カリウムチャネルの完全な再構成のための手順が説明されています。再構成されたチャネルは、生化学的アッセイ、電気録音、リガンドのスクリーニングおよび電子結晶学的研究に適している。これらの方法は、他の膜タンパク質の構造的および機能的研究の一般的なアプリケーションを有することができる。...

構造と機能研究のための脂質膜へのKvチャネルの再構築

サポートされている脂質二重層と天然膜粒子は、細胞膜の特性を近似することができると分析種々の戦略に組み込むことが好都合システムである。ここでは、サポートされている脂質二分子膜でコーティングされたSiO 2ビーズ、リン脂質小胞または天然の膜粒子からなるマイクロアレイを調製するための方法を実証する。...

スキージベースアセンブリ法による生体膜マイクロアレイの形成

多くのタンパク質は、膜表面に付着するとその機能を果たします。ナノディスク膜上の外因性タンパク質の結合は、透過型電子顕微鏡によって間接的に画像化することができます。我々は、ネガティブ染色のリンスホタングステン酸ナトリウムによって誘発されるナノディスクの特徴的なスタッキング(rouleau)が、外部タンパク質の結合によって防止されることを示す。...

透過型電子顕微鏡により膜相互作用タンパク質を視覚化し、分析するための方法

固相担、タンパク質-無料、ダブル リン脂質二重膜 (DLBM) 複雑で動的な脂質ナノチューブ ネットワークに変換することができます、小胞体の 2 D のボトムアップ...

自発的な形成と小胞体のボトムアップ モデル人工脂質ナノチューブ ネットワークの転位

ミトコンドリア融合は、ミトコンドリアダイナミクスの基礎となる重要なホメオスタティック反応である。ここで説明する インビトロ...

ミトコンドリア膜動態を再構成するためのモデル膜プラットフォーム

このプロトコルでは、蛍光顕微鏡を使用して再構成された膜テザー細胞骨格ネットワークのダイナミクスを研究するための、支持された脂質二重層の形成、および細胞骨格フィラメントとモータータンパク質の添加について説明します。...

支持脂質二重層上の膜テザー最小アクチン皮質の再構成

本稿では、F-アクチン細胞骨格を巨大な単層脂質小胞(リポソームとも呼ばれる)に封入する実験技術と、リポソーム膜の内小葉に皮質生物模倣型F-アクチン層を形成する方法を示す。...

インビトロ 巨大単層小胞内のアクチン細胞骨格の再構成

無細胞再構成は、細胞骨格アセンブリを理解するための重要なツールであり、過去10年間の研究は、最小限の系におけるセプチンダイナミクスを研究するためのアプローチを確立した。ここでは、異なる膜コンテキストでセプチンアセンブリを観察するための3つの相補的な方法、すなわち平面二重層、球状支持体、およびロッド支持体を提示する。...

生物物理学的特性と機能を研究するための膜でのセプチンアセンブリの再構成

このプロトコルはステロールの運送者ABCG5/G8の結晶化のための組み立てを記述する。ABCG5/G8は、ハンギングドロップ結晶化のためにバイセルに再構成されます。このプロトコルは特殊な材料や基質を必要としないため、X線結晶構造解析によってタンパク質の構造を決定するために、あらゆる実験室でアクセスしやすく、簡単に適応できます。...

脂質バイセル環境下でのABCG5/G8結晶化によるX線結晶構造解析

膜タンパク質を再構成し、酵素やその他の水溶性成分をサブマイクロメートルおよびマイクロメートルサイズの脂質小胞にカプセル化するためのプロトコルを提示します。...

ナノ・マイクロメートル小胞における非平衡代謝ネットワークの構築

本研究は、膜タンパク質であるTWIK関連酸感受性K+...

ナノディスク内の膜タンパク質を安定化する技術

学ぶABCトランスポーターMalFGK2をナノディスク脂質粒子に再構成する方法。膜タンパク質を可溶化環境で研究し、ゲル濾過クロマトグラフィーで精製する安定した複合体を作製する技術です。

Nanodisc脂質粒子にABCトランスポーターの再構成のためのステップ·バイ·ステップ方式

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