Name: ワクチンには、マウスの応答における鼻咽頭関連リンパ網内系組織（NALT）の役割を調べる (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: 学ぶマウスNALT手術モデルによる鼻内ワクチン免疫応答の解析方法。組織培養と組織学的評価を用いて局所および全身性体液免疫応答を評価し、ワクチン開発への応用可能性を示す。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

サポートは、ベクトン·ディッキンソンの技術によって提供されました。この申請において示された見解は著者のものであり、米国政府の公式方針を反映するように意図されません。研究は、動物福祉法と実験動物のケアと使用するためのガイド 、国家研究評議会、1996年に述べた原則に動物や付着を伴う動物実験に関連する他の連邦法および規制を遵守して実施されました。本研究が実施された施設は完全に実験動物ケア·インターナショナルの評価と認定協会の認定を受けています。

1。 NALTの収集と培養<ol><li>承認されたIACUCガイダンスを使用してマウスを安楽死させる。 NALTに影響を与える可能性吸入麻酔薬の使用は避けてください。無菌スペースまたは生物学的安全性キャビネットにマウスを転送します。マウスの下顎を外して、アルコールとヨウ素ワイプと上部口蓋エリアを清掃してください。 </li><li>慎重にマウス切歯と臼歯の内側の輪郭に従うことによって、上部口蓋を削減し、消費税にメスハンドルに11号​​手術ブレードを使用しています。 </li><li>口蓋を引き裂くないように注意しながらピンセットでそっと背中の皮口蓋、。 </li><li>このステップでは、文化の汚染を低減する必要があると、複数の味覚を処理するために設計されています。 10％ウシ胎児血清を含むRPMI 1640、100μg/ mlのストレプトマイシン、100から成る完全培地（37℃）を250μLの滅菌48ウェルプレートにあらかじめ入力の最初の列の個々のウェルに配置する味覚UI / mLペニシリン、50μg/ mLのゲンタマイシン1μg/ mLのファンギゾン/アムホテリシン。メディアは、味覚を5％CO 2/95％湿度の高い空気インキュベーター（37℃）で培養し、あるいは非CO 2培養用の10 mM HEPES pH 7.4を使用している場合はバッファリングされ、炭酸でなければなりません。 </li><li>味覚を洗浄するために、口蓋は8回の洗浄の合計を受けているまで、慎重に、洗浄の間に板をタップ、行の連続した​​各ウェルに味覚を移動するために鉗子を使用しています。 </li><li>ウェル内の新鮮な完全培地（37℃）の250μLを含む新しい滅菌48ウェルプレートに味覚を転送します。 </li><li>研究の期間培養し、37℃のインキュベーターに味覚を含むプレートを配置します。 </li><li>無菌的に新鮮な37°Cの培養液100μLで置き換え、エッペンドルフチュー​​ブ、24時間ごとに培養ウェルから培地100μLを転送することによって分析のためのサンプルを収集します。 </li><li>ペレットの破片〜10分、4℃、380 xgで培地サンプルを遠心します。 </li><li>分析する準備ができるまで-20℃で新鮮なエッペンドルフチュー​​ブや店舗を遠心分離し、試料から上清を移します。 </li><li>抗原特異的IgG、IgMおよびIgAの、または分泌されるサイトカインは、標準的な酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）によって組織培養上清で測定されます。 </li></ol> 2。 NALTの外科的アブレーション<ol><li>雌性BALB / cマウス、年齢の7から9週では、適切な科目であるが、他の株も許容されます。ポスト操作投与される食料や水代わりにマウスを順応するのに三日、手術前にゲル状のウェットフードを提供しています。 </li><li>手術前に口腔内にメタカムの疼痛緩和薬（1.5 mg / mlまたはは0.05 mg /ドロップ）1滴を管理します。 </li><li>乾燥を防ぐために、ケタミン、アセプロマジン、およびキシラジンの混合物（KAX）とは、例えば、承認されたIACUCのガイダンスを使用してマウスを麻酔し、眼にPuralube獣医軟膏を適用します。 NALTに影響を与える可能性吸入麻酔薬の使用は避けてください。 Anesthesiaは、つま先の穏やかなピンチに反射反応の有無によって確認することができます。 </li><li>皮下手術後のマウスの潜在的な脱水を防ぐために22から28ゲージの注射針とシリンジを用いて肩甲骨の間1 mLの生理食塩水（0.9％塩化ナトリウム注射USP）を管理することができます。また、手術中と後に健康な呼吸を促進するために22から28ゲージの注射針とシリンジを用いて肩甲骨の間に皮下Respiramの0.1 mLを管理することができます。 </li><li>後続のすべての操作中にマウスに熱サポートを提供しています。 </li><li>仰臥位で麻酔にマウスを置き、ゆっくりと口をこじ開けるように上限と下限歯の周囲に縫合糸の2つの別々のループを使用して、上部の口蓋を公開しています。 </li><li> NALTのサイトの上部口蓋の正中線の下の長さの切開が約3ミリメートルを作るために11番手術ブレードを使用しています。 </li><li>切開に0.5 mmのmicrocuretteを差し込んで、静かに縁の下に落とすNALTを混乱させる。 </li><li>熱焼灼装置のストレート細かいループを使って出血を止めるために切開を焼灼する。 </li><li>マウスが完全な意識と活動に復帰しながら熱のサポートを続行します。 </li><li> 3日後の手術のために一日に一回必要と経口鎮痛剤として脱水を防ぐために、皮下まで一日三回、肩甲骨の間の注入あたり1 mLの生理食塩水でマウスを提供しています。皮膚の膨圧をチェックするために皮膚テントテストを実行することにより脱水を決定します。それがつながったケースまでされるように、肩甲骨の間に皮膚や毛をつかみます。皮膚はすぐに正常、前の位置に返した場合、マウスは脱水ではありません。皮膚が上昇したまま、ゆっくりと移動した場合、マウスは脱水の状態であり、生理食塩水が必要になります。回復のための十分な時間を可能にするために、手術後少なくとも3日間ウェットフードを提供しています。 </li><li>すべての実験手順の前に、体重増加を追跡することによって、8月10日日間マウスを観察します。貧しい重量の回復通常不完全口蓋治癒を示し、これらのマウスは、さらなる研究から撤退しなければなりません。 </li></ol> 3。組織学のためにNALTを準備し、NALT手術の成功を評価する<ol><li>後述するようにNALT手術の成功は、組織によって確認する必要があります。すべての実験的研究を完了した後、承認されたIACUCガイダンスを使用して安楽死で、頭蓋のコレクションのためにマウスを準備します。 NALTに影響を与える可能性吸入麻酔薬の使用は避けてください。 </li><li>安楽死させたマウスの首筋をつかみます。両側にハサミで下顎頭プロセスを経てsnippingによって頭蓋骨の残りの部分から下顎骨を削除します。 </li><li>うなじから始まり、徐々に剥離し、頭蓋骨の腹側に向かってカットして頭蓋骨から、皮膚や毛皮を削除します。 </li><li>慎重に鼻の領域の周りの皮膚を除去し、完全に削除するには、鼻の先端から皮膚を切り取る。 </li><li>脊椎ウィットから頭蓋を切り離すはさみのHAスニップ。 </li><li>大後頭孔にハサミを挿入し、固定時の軟組織にホルマリンの浸透を可能にするために正中線に沿って頭蓋骨の下半分カット。 </li><li>室温で24時間（NBF）緩衝ホルマリン、10％中性に頭蓋を固定します。 </li><li>石灰を除去するためには、ギ酸混合物と瓶の中に、骨に触れてからRexynを防ぐためにガーゼに包まれた、サンプル、別のカセットを配置します。室温で12時間インキュベートし、その後約20分間、水道水の下に連続的に洗い流してください。 </li><li>かみそりの刃を持つ隔壁と過去の目の軌道にサンプルをトリミングします。 </li><li>サンプルおよびカセットを10％NBFの短期保存できます。 </li><li>一晩処理のための組織·プロセッサにサンプルを置きます。これは、パラフィン包埋の準備のために、試料から水分を除去するために行われます。 </li><li>ダウン鼻のパラフィンブロックに埋め込む処理組織を削除し、それを冷却することができます。 </li><li>トリムR自動化されたミクロトームを持つブロックのウワーッ15μmの断面は、NALTのおおよその位置に近づくと、44.3℃の水浴中でガラススライド上にマウントするための5μmの切片に切断し続けています。 </li><li>ヘマトキシリン​​およびエオシン（H＆E）組織染色は、NALTアブレーションを評価するために使用されるべきである。 </li></ol> 4。マウス由来の生体試料の収集 4.1血清<ol><li>慎重にヒートランプで体温を上昇させると、血流が増加します。手術ブレードを横尾静脈をニッキングにより血液を収集します。血液がMicrotainer血清セパレータチューブに自由に滴下することができます。 </li><li>血流を停止するには、そのようなガーゼやタオルなどの吸収性材料とのニックネームに穏やかな圧力を適用します。 </li><li> 30分間Microtainersで血液凝固を可能にし、少なくとも90秒間、6月15日×1,000 gの間遠心します。 </li><li>のためのクリーンなエッペンドルフチュー​​ブにMicrotainerからの血清に分離譲渡ストレージ-80℃ </li></ol> 4.2唾液<ol><li>頬と歯茎の線の間に緩衝生理食塩水（PBS）20から30μL滅菌リン酸をピペッティングしながら垂直に麻酔マウスを保持します。頬と歯茎の間にピペットチップを向けることによって、希釈唾液を収集します。 </li><li> -20℃で2倍のプロテアーゼ阻害剤とストアの10μLを含む新しいチューブに希釈した唾液を転送</li></ol> 4.3鼻汁<ol><li>承認されたIACUCガイダンスを使用して、鼻の分泌物を収集する前に、マウスを安楽死させる。 NALTに影響を与える可能性吸入麻酔薬の使用は避けてください。 </li><li>垂直方向にマウスを持って、慎重に鼻孔に滅菌したPBSの30μLをピペットで収集他の鼻孔からすすいでください。 </li><li> -20℃で2倍のプロテアーゼ阻害剤とストアの10μLを含む新しいチューブにリンス転送</li></ol> 4.4膣分泌物<ol><li>番目の開口部に、マイクロピペットの先端を挿入します。安楽死させたマウスのe外陰部は、滅菌したPBSを50μLと膣を洗浄し、マイクロピペットですべての流体を収集します。 </li><li> -20℃で2倍のプロテアーゼ阻害剤とストアの10μLを含む新しいチューブにリンス転送</li></ol> 5。採取した試料中の抗原特異的抗体やサイトカインをELISA法または他の定量法によって測定することができる。 6。代表的な結果 図1は、ex vivoでの解析のための NALTを含む組織の処理に必要な手順の一般的な回路図を提供しています。 図2（A、B）では、口蓋のサイズは、点線で示され、アブレーション手術中に切開の場所（）と同様に、表示されます。 NALTの場所は、並列組織を示す図2の切り出し、ヘマトキシリン染色口蓋（C）、上の小臼歯領域の矢印で示されています。 図3上部のNALTにアクセスするための口蓋（A、B）、アブレーション（C）と、切開の最終的な焼灼（D）の露出を示す、NALT混乱手術の手順を示します。直接手術後microcuretteによってNALT混乱のイメージは、 図3Fに表示されている間に手術前にNALTを囲む副鼻腔領域の典型的なH＆E断面は、図3Eに示されています。手術から回復するための十分な時間ができるように、切開部を閉じる必要がありますし、NALT（ 図3G）の鼻腔欠いている。 これらの技術を用いて得られた典型的な実験結果は、ブドウ球菌サブユニットワクチン（STEBVax）の研究から組織培養上清と生物学的試料を比較すると、 図4に示されています。マウスは鼻腔（IN）または腹腔内（IP）経路によりSTEBVax投与した。ワクチンは、Toll様受容体4の経路3,1を活性化するアジュバントで策定された<html> 4、およびコントロールは、生理食塩水またはワクチンアジュバントなしで与えられた。実験群から得られた培養NALTには、ELISA法による測定だった培地中に抗原特異的免疫グロブリンを分泌する。この例では（ 図4A）、結果はIgAの最大量は、アジュバントと組み合わせたサブユニットワクチンとではワクチン接種したマウスから得られたNALTによってリリースされたことを示しています。 コントロールやNALTフリーマウスから得られた生体試料（例えば、血清、唾液、鼻汁、膣分泌液など）は組織培養の結果との比較のために鼻の抗原に対する生体の免疫応答内のプロファイルに使用することができます。 図4Bに、予防接種INへのIgAおよびIgG応答が大幅に機能NALTずに減少した。抗原特異的IgAのレベルは、ワクチン接種したマウスの粘膜の分泌物（唾液、鼻洗浄）中のIgGよりも一般的に大きかった。 upload/3960/3960fig1.jpg &quot;/&gt; 図1。NALTの収集およびex vivoでの培養の模式図。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3960/3960fig2.jpg" /> 図2。NALTおよび手術切開の位置を示すマウス口蓋の可視化。点線（）で表される手術切開と上部口蓋のサイズと位置、口蓋の前方側（口蓋の小臼歯領域で染色された濃い紫色を並列NALTを表示するには、上部の切り出し、口蓋（B）またはヘマトキシリン​​で染色し（C） 。） NALTは矢印で示された。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3960/3960fig3.jpg" /> 図3手術NALTの中断。 NALT混乱手術の主要な段階：手術前にマウスの上部口蓋の仰臥位ビュー（）; NALT（B）にアクセスするために、上部口蓋に行わ正中切開。でNALT構造を破壊するために正中切開を通して挿入microcuretteプローブtegrity（C）、手術の終了時に切開の焼灼（D）。鼻腔の顕微鏡画像、H＆E染色、手術（E）の前に、手術直後（F）の後、および首尾よく癒され、NALTフリーマウス（G）。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3960/3960fig4.jpg" /> 図4培養NALT、唾液、鼻汁からワクチン特異的抗体は、ワクチン接種したマウスから採取した。 NALTフリーまたは正常対照マウスは、INまたはSTEBVaxとIP予防接種を受けていたし、生体試料を採取した。トリプリケートサンプルの抗体レベルをELISAを用いて測定した。 （A）NALTは、コントロールマウス（外科的に操作しない）から削除され、抗体応答を調べるために培養した。ワクチンを接種したマウスでは培養のワクチン特異的IgA応答はコントロール（スチューデントのt検定、p≤0.01、無アジュバントなしのワクチンに比べて）から統計的に異なっていた。 （B）NALTの混乱は、実質的に特異的な抗体応答を減少させ予防接種をINに。特定の抗体レベルの間に有意差が認められたNALTとNALT唾液IgGの結果（スチューデントのt検定、p≤0.05）を除くすべての比較のために+グループ（非手術またはコントロール手術）。

<ol><li>Wiley, J. A., Tighe, M. P., Harmsen, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upper+respiratory+tract+resistance+to+influenza+infection+is+not+prevented+by+the+absence+of+either+nasal-associated+lymphoid+tissue+or+cervical+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Upper respiratory tract resistance to influenza infection is not prevented by the absence of either nasal-associated lymphoid tissue or cervical lymph nodes.</a> J. Immunol. 175, 3186-3196 (2005).</li>
<li>W, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranasal+immunisation+with+conjugate+vaccine+protects+mice+from+systemic+and+respiratory+tract+infection+with+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Intranasal immunisation with conjugate vaccine protects mice from systemic and respiratory tract infection with Pseudomonas aeruginosa.</a> Vaccine. 24, 4333-4342 (2006).</li>
<li>Fernandez, S., Cisney, E. D., Hall, S. I., Ulrich, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nasal+immunity+to+staphylococcal+toxic+shock+is+controlled+by+the+nasopharynx-associated+lymphoid+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Vaccine+Immunol%22%5BJournal%5D)">Nasal immunity to staphylococcal toxic shock is controlled by the nasopharynx-associated lymphoid tissue.</a> Clin. Vaccine Immunol. 18, 667-675 (2011).</li>
<li>Asanuma, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+mouse+nasal-associated+lymphoid+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of mouse nasal-associated lymphoid tissue.</a> J. Immunol. Methods. 202, 123-131 (1997).</li>
<li>Casteleyn, C., Broos, A. M., Simoens, P., Van den Broeck, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NALT+%28nasal+cavity-associated+lymphoid+tissue%29+in+the+rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+Immunol.+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">NALT (nasal cavity-associated lymphoid tissue) in the rabbit.</a> Vet. Immunol. Immunopathol. 133, 212-218 (2010).</li>
<li>Debertin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nasal-associated+lymphoid+tissue+%28NALT%29%3A+frequency+and+localization+in+young+children%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Nasal-associated lymphoid tissue (NALT): frequency and localization in young children.</a> Clin. Exp. Immunol. 134, 503-507 (2003).</li>
<li>Csencsits, K. L., Jutila, M. A., Pascual, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nasal-associated+lymphoid+tissue%3A+phenotypic+and+functional+evidence+for+the+primary+role+of+peripheral+node+addressin+in+na%C3%AFve+lymphocyte+adhesion+to+high+endothelial+venules+in+a+mucosal+site%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Nasal-associated lymphoid tissue: phenotypic and functional evidence for the primary role of peripheral node addressin in naïve lymphocyte adhesion to high endothelial venules in a mucosal site.</a> J. Immunol. 163, 1382-1389 (1999).</li>
<li>Zuercher, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nasal-associated+lymphoid+tissue+is+a+mucosal+inductive+site+for+virus-specific+humoral+and+cellular+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Nasal-associated lymphoid tissue is a mucosal inductive site for virus-specific humoral and cellular immune responses.</a> J. Immunol. 168, 1796-1803 (2002).</li>
<li>Park, H. S., Francis, K. P., Yu, J., Cleary, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membranous+cells+in+nasal-associated+lymphoid+tissue%3A+a+portal+of+entry+for+the+respiratory+mucosal+pathogen+group+A+streptococcus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Membranous cells in nasal-associated lymphoid tissue: a portal of entry for the respiratory mucosal pathogen group A streptococcus.</a> J. Immunol. 171, 2532-2537 (2003).</li>
<li>Tyrer, P., Foxwell, A. R., Cripps, A. W., Apicella, M. A., Kyd, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+pattern+recognition+receptors+mediate+M-cell+uptake+of+a+gram-negative+bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Microbial pattern recognition receptors mediate M-cell uptake of a gram-negative bacterium.</a> Infect. Immun. 74, 625-631 (2006).</li>
<li>Wu, A. W., Russell, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nasal+lymphoid+tissue%2C+intranasal+immunization%2C+and+compartmentalization+of+the+common+mucosal+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Res%22%5BJournal%5D)">Nasal lymphoid tissue, intranasal immunization, and compartmentalization of the common mucosal immune system.</a> Immunol. Res. 16, 187-201 (1997).</li>
<li>Harmsen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+organogenesis+of+nasal-associated+lymphoid+tissue+%28NALT%29+occurs+independently+of+lymphotoxin-alpha+%28LT+alpha%29+and+retinoic+acid+receptor-related+orphan+receptor-gamma%2C+but+the+organization+of+NALT+is+LT+alpha+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: organogenesis of nasal-associated lymphoid tissue (NALT) occurs independently of lymphotoxin-alpha (LT alpha) and retinoic acid receptor-related orphan receptor-gamma, but the organization of NALT is LT alpha dependent.</a> J. Immunol. 168, 986-990 (2002).</li>
<li>Rangel-Moreno, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+CXC+chemokine+ligand+13%2C+CC+chemokine+ligand+%28CCL%29+19%2C+and+CCL21+in+the+organization+and+function+of+nasal-associated+lymphoid+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Role of CXC chemokine ligand 13, CC chemokine ligand (CCL) 19, and CCL21 in the organization and function of nasal-associated lymphoid tissue.</a> J. Immunol. 175, 4904-4913 (2005).</li>
<li>Morefield, G. L., Hawkins, L. D., Ishizaka, S. T., Kissner, T. L., Ulrich, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+Toll-like+receptor+4+agonist+enhances+vaccine+efficacy+in+an+experimental+model+of+toxic+shock+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Vaccine+Immunol%22%5BJournal%5D)">Synthetic Toll-like receptor 4 agonist enhances vaccine efficacy in an experimental model of toxic shock syndrome.</a> Clin. Vaccine Immunol. 14, 1499-1504 (2007).</li>
</ol>

利害の衝突が宣言されません。

我々は、生物学的サンプル、NALTに関連した免疫応答の1-4を調べるためのアッセイを得て、動物モデルを開発するための集団的方法を提示している。これらのメソッドの実行中に考慮すべきその他の要因があります。手術や組織培養のための標準無菌テクニックに従うべきである。単離および培養と同様に、滅菌した器具、作業領域、および消毒味覚を維持する時に使用される抗菌剤および抗真菌剤の組み合わせは、汚染の危険性を減らすことができます。血清抗体は一般的に高い濃度で検出されたとして唾液、鼻洗浄と同じような粘膜分泌物のサンプルは、血液中の潜在的な汚染を検査する必要があります。抗体の低濃度は、血清に比べ、これらのサンプル中に存在するので、さらに、粘膜の分泌物は、ほんの少しだけ分析のために希釈する必要があります。 マウスは、事前に直​​接、手術後に保温する必要があります潜在的な麻酔誘発性低体温を発散。不規則な呼吸を最小限に抑えるために手術後の療養中に、その両側に別の安静時のマウス。手術を行う1、口を開けて、マウスは麻酔から回復するように手術後のケアを提供するための1つを保持して支援するためにいずれかの手術では、これらのタスクを完了するために一緒に仕事を3人の方が効率的です。 これは、各マウスの手術の成功したかどうかを確認するために、すべての実験手順や研究の終了時に頭蓋の断面のH＆E染色を使用する必要があります。可能な限り手術の成果は、以下のとおりです。完全な二国間のNALTアブレーション、不完全切除、または無傷のNALT。すべての手術は、NALTの完全な損失になりますので、残留または無傷のNALTを持つ動物は、内部コントロールとして使用することができます。別の潜在的な結果は、口蓋、鼻と口腔をつなぐ開口部を残して、完全に治癒してしまうことである。不完全口蓋の治癒は、低体重と成長障害が発生し、これらの個人は、研究から削除する必要があります。 マウスモデルを持つ最初のワクチンの応答を調べると、意図した研究結果（抗体応答、生存率など）にNALTの役割を確立するのに役立つでしょう。外科的にNALTを削除すると、ローカルおよび全身性免疫に鼻の貢献の決定を容易にします。ここで説明した外科的アプローチは、NALTの欠けているマウスモデルを得るための最も直接的な方法です。選択したノックアウトマウスモデルが欠けてNALTに報告したが、これらの動物はまた、他の二次リンパ組織の発達に不可欠なサイトカインやケモカインの欠乏であり、追加の欠陥12,13を抱いていることがされています。さらに、ここで説明する方法は、鼻腔内に元の免疫応答のいくつかの側面を調べるために開発されました。我々の実験結果は、全体の上限palatを用いた研究に基づいています。組織培養のためのマウスからの電子、それはセクションが使用されている可能性がありますが。最後に、培養されたNALTモデルは、組織培養で完全に実験を行うのに便利です。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>ステンレススチール滅菌外科ブレード、第11号</td><td> Miltex </td><td> 4から311 </td><td></td></tr><tr><td>ナイフのハンドル、第3号</td><td> Miltex </td><td> 4月7日</td><td></td></tr><tr><td> 48ウェル細胞培養プレート</td><td>共演者</td><td> 3548 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td>インビトロジェン</td><td> 11875-093 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清、不活化熱</td><td> GIBCO / Invitrogen社</td><td> 16000-044 </td><td>最終濃度：10％体積の培地に</td></tr><tr><td>硫酸ストレプトマイシン</td><td>シグマ</td><td> S9137 </td><td>最終濃度：100μg/ mLの</td></tr><tr><td>ペニシリン</td><td>シグマ</td><td> P7794 </td><td>最終濃度：100 UI / mLの</td></tr><tr><td>ゲンタマイシン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> G1397-10ML </td><td>最終濃度：50μg/ mLの</td></tr><tr><td>ファンギゾン</td><td> GIBCO / Invitrogen社</td><td> 15290-018 </td><td>最終濃度1μg/ mLの</td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> H0887 </td><td>最終濃度10 mMの</td></tr><tr><td>エッペンドルフ微量遠心チューブ</td><td>エッペンドルフ</td><td> 022364111 </td><td></td></tr><tr><td>ニュートラゲルチェリー風味マウスウェットフード</td><td>バイオサーブ</td><td> S4798-TRAY </td><td></td></tr><tr><td>メタカム</td><td>ベーリンガーインゲルハイム</td><td> 601531000 </td><td> 1.5 mg / mLの経口懸濁液の一滴</td></tr><tr><td>ケタミン</td><td>ファイザー</td><td> 00856440301 </td><td>最終的な共同NC：6.06 mg / mLの</td></tr><tr><td>アセプロマジン</td><td> Vedco </td><td> VEDC207 </td><td>最終濃度：0.061 mg / mLの</td></tr><tr><td>キシラジン</td><td>ロイド</td><td> 4811 </td><td>最終濃度：0.667 mg / mLの</td></tr><tr><td> Puralube獣医軟膏</td><td> Pharmadermアニマルヘルス</td><td> 1621 </td><td></td></tr><tr><td> 0.9％塩化ナトリウム注射液USP </td><td>バクスター</td><td> 2B1302 </td><td></td></tr><tr><td> 0.5ミリメートルMicrocurette </td><td> Roboz </td><td> RS-6350 </td><td></td></tr><tr><td>熱焼灼装置</td><td>ガイガー</td><td> 150-S/150A-S </td><td></td></tr><tr><td> TCUの交換チップ、ストレートファインループ</td><td>ガイガー</td><td> 214 </td><td></td></tr><tr><td>外科はさみ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 10％中性緩衝化ホルマリン</td><td>シグマ</td><td> HT501128 </td><td></td></tr><tr><td>ギ酸</td><td>フィッシャー</td><td> A119P-4 </td><td> 1047 mLの水道水に426 mLのギ酸を混ぜて、その後45mLのRexyn 101（H）を追加する</td></tr><tr><td> Rexyn 101（H） </td><td>フィッシャー</td><td> R231-500 </td><td></td></tr><tr><td>組織テックVIP E150/E300 </td><td>桜</td><td></td><td></td></tr><tr><td>回転式ミクロトーム</td><td>ライカ</td><td> RM2255 </td><td></td></tr><tr><td>マイヤーのヘマトキシリン</td><td>シグマ</td><td> MHS16-500ML </td><td></td></tr><tr><td>ギルNo.1のヘマトキシリン</td><td>シグマ</td><td> GHS116 </td><td></td></tr><tr><td>エオシンB </td><td>シグマ</td><td> 2853 </td><td></td></tr><tr><td> Microtainer血清セパレータ</td><td> BD Medical </td><td> 365956 </td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td></td><td></td><td> 100mMののNaH 2 PO 4、140mMのNaCl、pH7.4の</td></tr><tr><td>プロテアーゼインヒビターカクテル、EDTA-フリー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> 78415 </td><td></td></tr></tbody></table>

ワクチンには、マウスの応答における鼻咽頭関連リンパ網内系組織（nalt）の役割を調べる

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue (NALT) in Mouse Responses to Vaccines

人間、齧歯類、および他の哺乳動物に見られる鼻咽頭関連リンパ細網組織（NALT）が、1月3日副鼻腔内免疫に貢献しています。 NALTは、硬口蓋、上記の鼻腔にある2つの平行な釣鐘型の構造であり、通常、粘膜関連リンパ系4-6の二次成分であると考えられている。 NALT内に位置し、抗原提示樹状細胞4,7,8が点在し、BおよびTリンパ球の離散的コンパートメントである。これらの細胞は、空気通路9,10の粘膜表面から抗原検索のための責任があるM細胞にインターカレートした上皮細胞層に囲まれています。 NALTを介して循環するナイーブリンパ球は、呼吸器病原体7で最初の出会いに対応するために態勢を整えています。 NALTは2歳で人間に消えている間、ワルダイヤー輪と同様に構造化されたリンパ器官は目を保持し続けるライフ6 roughout。人間とは対照的に、マウスは、このように副鼻腔11内に元の免疫応答の研究のための便利な動物モデルを提供し、生涯を通じてNALTを保持します。 NALTの単細胞懸濁液の培養は、単核細胞の収率が低いために実用的ではありません。しかし、NALT生物学は、無傷の器官のex vivoで培養することにより検討し、このメソッドは自然な組織構造を維持するための付加的な利点を持っていることができます。 in vivo試験では、NALTに限ら欠陥を提示する遺伝子ノックアウトモデルでは、発達経路の理解不足のため現在利用できません。リンホトキシン-αノックアウトマウスはNALTが萎縮している一方、例えば、パイエル板、末梢リンパ節、濾胞樹状細胞やその他のリンパ組織はまた、これらの遺伝子操作マウスを12,13に変更されています。遺伝子ノックアウトマウスの代わりに、外科的アブレーションのpとして常に承認、他の組織に影響を与えることなく、鼻腔からNALTを排除します。その結果マウスモデルは、ワクチン1,3にNALTと免疫応答の間の関係を確立するために使用されています。血清、唾液、鼻洗浄と膣分泌物のシリアルコレクションは、NALTから直接発信免疫応答は組織培養によって確認することができますが、予防接種へのホストの応答の基礎を確立するために必要である。次の手順では、鼻腔（IN）ワクチン接種局所および全身体液性免疫応答を検討するために必要な手術は、組織培養とサンプルコレクションの概要を説明します。

鼻腔内ワクチンマウスの鼻腔内および全身の免疫応答に鼻咽頭関連リンパ細網組織（NALT）の寄与を調べるためのメソッドが記述されています。我々はNALTに依存するマウスモデルを確立するために外科手術を発揮し、<em&gt; ex vivoで</em抽出されたNALTの&gt;文化。

ワクチンには、マウスの応答における鼻咽頭関連リンパ網内系組織（NALT）の役割を調べる

ヒト、げっ歯類、およびその他の哺乳類に見られる鼻咽頭関連リンパ組織（NALT）は、鼻腔における免疫に寄与している1-3。

この手順の目的は、マウスの鼻腔内ワクチン接種に対する鼻腔および全身の免疫応答における、鼻咽頭関連リンパ組織（nalt）の寄与を調べることです。これは、無傷のnaltのex vivo培養を調べることで達成されます。マウスモデルを用いて、無傷のnaltを採取し、逐次洗浄および清浄化を行います。その後、組織を培養し、一定の間隔で分注して採取します。これらのサンプルは遠心分離して保存し、後で免疫反応の証拠があるかを確認します。マウスの鼻腔からNatを外科的に除去する際は、周囲の組織を損傷しないよう慎重に行います。外科処置を施したマウスに実験を行った後、組織学的検査により手術の成否を評価します。最終的に、これらの結果は鼻腔内接種に対する局所的および全身的な体液性免疫応答の評価に使用されます。nullの発生経路は少なくとも部分的に記述されていますが、単一遺伝子ノックアウトに基づくnullのストーリーのマウスモデルは現在利用不可能です。単一遺伝子ノックアウトの代替として、外科的切除により、組織に影響を与えることなく鼻腔からnullを完全に除去しました。このマウスモデルは、ワクチンや抗原と、局所および全身免疫との関係を明らかにするために用いられてきました。この手法は、マウスへの経鼻ワクチンの宿主反応の基礎を理解するのに役立つだけでなく、鼻腔免疫に影響を与えるアジュバントやその他の医薬品の研究にも適用可能です。この手法の可視化は極めて重要です。なぜなら、手術手順自体は一般的ですが、視認性の低い狭い領域での操作となり、また動物の健康を維持するために処置を完了させるまでの時間が限られているため、困難を伴うからです。alt fillを回収する前に、48ウェル培養プレートのすべてのウェルに250 microlitersの温めた培地を満たします。2枚目の48ウェルプレートの1列についても同様に行い、使用するまで両方のプレートを保温します。承認されたIACUCの指針に従い、非吸入性の麻酔剤を注入してマウスを安楽死させます。無菌的なワークスペースで、まずマウスの下顎を取り除き、naltを回収します。次に、11番の外科用メスを使用して、上顎口蓋領域をアルコールおよびヨード綿で清浄します。マウスの切歯および臼歯の内側の輪郭に沿って、慎重に上顎口蓋を切り出し、切除します。ピンセットを用いて、口蓋を静かに剥がします。パレットを破らないように注意しながら、培地を満たした48ウェルプレートの1列目の各ウェルにパレットを回収します。パレットをその行の各ウェルに順次移動させ、洗浄します。洗浄の合間にパレットを丁寧にタッピングします。8回の洗浄後、パレットを2枚目のプレートの培地が入ったウェルに移動させます。プレートを37 °Cで培養します。研究期間中、24時間ごとに各培養物から100 µLの培地サンプルを回収します。プレートをインキュベーターに戻す前に、培地を100 µLの新鮮で加温した培養液に交換します。培養液サンプルを遠心分離し、デブリをペレット化します。上清を新しいチューブに移し、すべてのサンプルをELISAで測定できるまで-20 °Cで保存します。抗原特異的なIgG、IgM、およびIgA、または分泌サイトカインを測定する場合、手術の3日前から、麻酔をかける前に、7〜9週齢のマウスにゲル状のウェットフードを与え、術後に投与される食物および水代替物に慣れさせます。7〜9週齢のマウスの口腔内に鎮痛剤を投与します。承認されたIUCガイダンスに従って、マウスを麻酔します。眼にパラルブベト軟膏を塗布し、その後再度塗布してください。動物が足指のつまみ刺激に反応しなくなった時点で吸入麻酔薬の使用を停止し、22〜28ゲージの針を用いて、肩甲骨の間に生理食塩水を1 mL皮下投与します。これにより、術後のマウスの脱水を防ぎます。同様の手順で、肩甲骨の間にRinger液を0.1 mL皮下投与してください。これにより、手術中および手術後の健全な呼吸が促進されます。マウスを保温装置の上に仰臥位で配置します。手術の間、常に保温状態を維持してください。上顎と下顎の切歯に外科用縫合糸を2つのループ状にかけ、口をゆっくりと押し広げて上顎口蓋を露出させます。11番の外科用メスを使用し、Kの部位において上顎口蓋の正中線に沿って約3 mmの切開を加えます。次に、0.5 mmのマイクロキュレットを挿入し、切開創の両端の下をゆっくりと掻き出し、knutを破壊します。サーマルクォーターユニットのストレートファインループを用いて、止血のために切開部位を焼灼します。マウスをサーマルサポートの上で、完全に意識が回復するまで安静にします。その後3日間にわたり、脱水を防ぐために生理食塩水1 mLをマウスに注射します。水分状態を評価するため、皮膚の緊張度（スキンテント）を確認するスキンテントテストを実施してください。必要に応じて、1日3回まで行ってください。同様に、経口鎮痛剤を1日1回投与してください。あらゆる実験手順を行う少なくとも3日前から、ウェットフードを提供してください。体重増加を追跡し、8〜10日間マウスを観察します。体重の回復が不十分な場合は、通常、口蓋の治癒が不完全であることを示しており、これらのマウスは以降の研究から除外する必要があります。手術の成功は組織学的検査によって確認する必要があります。すべての実験終了後、前述の手順に従ってマウスを安楽死させ、頸椎脱臼で処置を完了させます。次に、はさみで関節突起を切断し、下顎骨を頭蓋骨から取り出します。両側で同様に操作します。項から始めて、頭蓋骨から皮膚と被毛を、頭蓋の腹側に向かってゆっくりとはがしながら切り取り、除去します。鼻腔周囲の皮膚は慎重に取り除いてください。次に、吻端の皮膚を切り取り、完全に除去します。その後、ハサミを使用して頭蓋骨を脊椎から切り離します。ハサミを頭蓋骨の大後孔に挿入し、頭蓋骨正中線の半分まで切断します。これにより、固定中にフォルミンが軟組織へ浸透します。頭蓋骨を10%中性緩衝ホルマリンに24時間浸して固定します。翌日、室温にて、サンプルをカセットに入れ、そのカセットをガーゼで包んでギ酸混合液のボトルに入れることで脱灰を行います。サンプルを室温で12時間インキュベートした後、さらに12時間置いてください。サンプルを洗浄し、水道水で20分間すすぎます。カミソリを使用して、サンプルを中隔および眼窩までトリミングします。短期間の保存の場合、サンプルとカセットは10%NBFに浸して保存できます。包埋の際は、ssam末端がパラフィンの中に埋め込まれ、カセット末端が眼窩末端の上に配置されるようにしてください。その後、カセットの上部までパラフィンを充填し、ミクロトームに設置する前に冷却させます。準備が整ったら、標準的な組織学的検査を実施してください。吻部の5 µm厚の横断切片を作成し、H&amp;E染色を行います。組織学的検査による嗅神経切除の確認は、結果を解釈する上で不可欠であり、すべての実験を正常に完了した後に実施する必要があります。反対側に単球細胞の集積が見られないことが、切除が成功した指標となります。KNT周辺の鼻腔領域のH&amp;E染色横断切片では、通常、柱状上皮細胞層に囲まれた有核細胞クラスターが観察されます。手術後には、上顎蓋およびNATの整合性に顕著な破綻が認められるはずです。術後の回復後、切開部は閉鎖し、鼻腔内にNATが存在しない状態になります。マウスに、Toll様受容体4を活性化するアジュバントを配合したSTXワクチンを投与します。パスウェイ対照群には、生理食塩水のみ、またはアジュバントを含まないワクチンのみを投与して培養しました。実験群から得られたNALTは、ELISAで測定可能な抗原特異的免疫グロブリンを培地中に分泌しました。2つのワクチン投与経路を比較した結果、サブユニットワクチンを経鼻投与したマウスから得られたNALTによって、最大量のIgAが放出されることが示されました。コントロール群またはMALT欠損マウスから得られたBALT含有生物学的サンプルを併用することで、鼻腔抗原に対するin vivo免疫応答のプロファイリングが可能です。組織培養の結果と比較すると、経鼻接種に対するIgAおよびIgG応答は、機能的なMALTがない場合に有意に低下しました。抗原特異的IgAのレベルは、一般的にワクチン接種したマウスの粘膜分泌物においてIgGよりも高い値を示しました。手技に習熟すれば、1匹のマウスにつき、1回の24時間時点の採取を含め、組織採取と培養を約30分で完了できます。適切に行えば、熟練した作業者は1日で数匹のnatを回収し、培養することが可能です。natを剥離させるには、口蓋の下を十分に掻き出す必要があります。この処置を行う際は、出血を抑えるために迅速に作業することが重要です。これにより、切開部位を明確に可視化でき、動物の健康状態を維持することが可能になります。このビデオを視聴することで、鼻腔内ワクチン接種後の局所的および全身的な免疫応答に対するマウス粘膜関連リンパ組織（MALT）の寄与を研究する方法について、十分に理解できるはずです。

examining-role-nasopharyngeal-associated-lymphoreticular-tissue-nalt

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

ここで、我々は、肺に先天性免疫細胞を常駐し、無水物ナノ粒子との共培養に応答して活性化を検討しているマウスの肺胞マクロファージを採取するためのプロトコルについて説明します。...

マウス肺胞マクロファージを採取し、無水物ナノ粒子により誘導される細胞活性化を評価する

マウス生殖管からリンパ球を分離するための効率的な方法が記載されている。この方法では、効率的な分離を可能にするために酵素消化し、パーコール勾配分離を利用しています。この手法は、他の種で使用するためにもに適応可能である...

マウス生殖管粘膜からのリンパ球の単離

宿主免疫応答を評価するためのマウスへのマウスヘルペスウイルス経鼻感染法

予防的および治療的ワクチン接種は、多くの場合、週のリンパ節へのワクチンの排水および免疫細胞の関与の結果として、乏しいによる強力な免疫応答を刺激することができない。リンパ節へのワクチンの直接注射することによって、いわゆるリンパ内注射は、ワクチンの有効性を強く改善することができ、ワクチン用量を低減することができる。...

マウスのリンパ管内免疫療法やワクチン

私たちは、ワクチン接種のマウスモデルにおいて、ナノ粒子による免疫に対する抗原特異的CD8+...

ナノ粒子ワクチン接種後の抗原特異的CD8 + T細胞応答の分析のための全動物イメージングとフローサイトメトリー技術

ワクチンがどのように機能するかについての知識は全体的に不足しています。ここでは、逆遺伝学と骨髄キメラマウスの併用を提案するとともに、樹状細胞とT細胞免疫に特に焦点を当てて、ワクチンに対する初期の宿主免疫応答についての洞察を得ることを提案します。...

キメラマウスモデルにおける組換えインフルエンザワクチンの鼻腔内投与は、粘膜免疫を研究するために、

ここでは、マウスモデルにおけるBCGによる鼻腔内および皮下免疫によって誘発される防御効果と肺免疫応答を比較するための方法論について詳しく説明します。私たちの結果は、肺ワクチン接種の利点を示しており、ワクチン誘発性防御におけるIL17媒介反応の役割を示唆しています。...

防御効力および肺免疫応答は、マウスに皮下および鼻腔内BCG投与後の

標準的な免疫学的技術のアプリケーションをご紹介 (CFSE 染色 OT-私増殖) 急速に補助を介した細胞傷害性 T リンパ球 (CTL) の生成をモニターするつもり体内。CTL...

急速なIn Vivo評価補助の細胞傷害性 T リンパ球生成機能のワクチン開発のため

ここで生体内でワクチンの評価のためのエレガントなプロトコルの有効性と宿主免疫応答を提示します。このプロトコルは、ウイルス、細菌、ワクチンのモデルまたは寄生病原体に対する適応ことができます。...

宿主-病原体応答とマウスでワクチンの有効性の評価

2型炎症に関与するグループ2の自然リンパ系細胞(ILC2)は、主に蠕虫感染、アレルギー疾患、代謝恒常性、および組織修復に応答します。この研究では、マウス鼻粘膜からILC2を分離し、CD226の発現を検出する手順が実証されています。...

CD226の発現を検出するためのマウス鼻粘膜からのグループ2自然リンパ系細胞の単離

本プロトコルは、マウスの鼻洗浄液(NLF)の血液汚染を回避するための新しい方法を説明しています。この方法により、血液汚染のないNLF収集が保証されるため、免疫成分やさまざまな呼吸器病原体をより正確に検出できます。...

血液汚染のないマウス鼻洗浄液コレクション

学ぶマウスNALT手術モデルによる鼻内ワクチン免疫応答の解析方法。組織培養と組織学的評価を用いて局所および全身性体液免疫応答を評価し、ワクチン開発への応用可能性を示す。

ワクチンには、マウスの応答における鼻咽頭関連リンパ網内系組織（NALT）の役割を調べる

さらに動画を探す