タンパク質の折り畳みを研究するためのマイクロ流体ミキサー

この手順の全体的な目的は、2つの溶液を迅速に混合し、マイクロ秒の時間スケールで生化学反応を開始させることです。これはまず、マイクロ流体ミキサーを作製することで達成されます。次のステップでは、チップをカバーガラスに接合してチャネルを密封します。

次に、チップを溶液リザーバーを含むマニホールドに取り付けます。最後のステップは、共焦点蛍光顕微鏡を用いて混合溶液をイメージングすることです。最終的に、出口チャネルに沿った距離を時間に変換することで、マイクロ秒の時間スケールで生化学反応を捉えます。

ストップフロー混合などの既存の方法と比較した本手法の主な利点は、混合が乱流に制限されず、数マイクロ秒で完了することです。この方法は、疎水性崩壊がいつ起こるかなど、タンパク質折りたたみ分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。マイクロ流体混合チップの作製を開始するため、私の研究室のポストドクターであるLing Wooが手順を実演します。

まず、このビデオに付随する書面プロトコルに記載されている通り、新鮮なピラニア溶液を用いて4インチのFU石英ウェハを洗浄します。次に、低圧化学気相成長（LPCVD）炉を用い、最終的なマイクロ流体チャネルの想定深度10 µmにつき約1 µmの厚さでポリシリコンコーティングを施します。テキストに記載されているウェハのさらなる処理の後、Z 52 14フォトレジストを900 nmの厚さでスピンコートし、ホットプレート上で直接90 °Cで1分間、またはオーブンにて110 °Cで30分間ソフトベイクします。

フォトマスクをアライメントした後、フォトレジストに数秒間UV光を照射して、ハードコンタクトおよび真空コンタクトを行います。次に、書面によるプロトコルに従って、フォトレジスト内のパターンを現像します。ウェハー上の微細構造を顕微鏡で検査し、ホットプレート上で直接115 °Cで2分間ハードベイクします。

次に、Asherまたは酸素プラズマを用いて、RF出力100 Wで2.5分間、ウェハのDCU（有機物除去）を行います。深反応性イオンエッチング装置を用いて、ポリシリカ層を下の合成石英まで完全にエッチングします。残存するフォトレジストを除去し、本文の指示に従ってウェハを処理してください。

エッチング深さを測定し、ポリコーティングを完全に貫通していることを確認します。酸化膜対応の深反応性イオンエッチャーを使用し、ポリコーティングの厚さ 1 µm あたり約 10 µm の深さまで合成石英をエッチングします。マトリックスアッシャーを用いて、RF電力 100 W で 4 分間ウェハを洗浄し、その後キセノンジフルオリドエッチャーでポリシリコンを除去します。ウェハに穴をあける前に、その後のハンドリング中にチャネルを保護するため、新たに 1 µm のフォトレジスト層をスピンコートします。

次に、Aqua Bond 55を用いて、ウェハの機能面を下にして犠牲ガラスプレート上にマウントします。ボンダー内に気泡が入らないように注意しながら、micro 90洗浄液で冷却されたコンピュータ制御のダイヤモンドチップドリルを使用して処理します。これにより、小さなガラス片がチャネルに付着し、使用中にチップが詰まるのを防ぎます。

各チップに入口孔と出口孔をドリルで開けます。シリンジを用いて各孔に水を注入し、ウェハーを脱イオン水で洗浄します。その後、フォトレジストを除去し、石鹸水に1時間浸漬させます。

本文中に記載されている通りにレジストとボンダーを処理します。ウェハを脱イオン水と温石鹸水で洗浄します。ウェハに窒素を流した後、エッチングされた箇所を避けながら、シリンジを用いて各孔を再度洗浄します。

120 °Cに設定した真空乾燥機で乾燥を続けます。穴の中に粒子状の異物が残っていないかを確認し、必要に応じて洗浄工程を繰り返します。以下の手順はクリーンルーム内で実施してください。

光学式または機械式の表面プロファイラーを用いて、チャネルの深さを測定します。クリーンルーム内で、本文の記載に従ってウェハおよび溶融石英カバーガラスを洗浄します。窒素ガスを用いて、ウェハを少なくとも5分間十分に乾燥させます。

次に、小さなガラス板などの硬くて平らな表面の上に、クリーンルームワイパーを3〜4枚重ねて置き、その上にウェハのパターン面を上にして置きます。カバーガラスでも同様の操作を行います。カバーガラスを端から持ち上げ、研磨面がウェハに向けて下になるように反転させます。

平坦なエッジを慎重に合わせ、カバーガラスをウェハー上にゆっくりと載せ、自然に馴染ませます。位置を調整する場合は、水平方向にのみわずかに動かしてください。ウェハーの中央を指一本で押し下げます。すると、ボンディングフロントが外側に向かって広がり始めるのが確認できます。

必要に応じて、ウェハの周囲の他の箇所にさらに圧力を加え、接合界面を前進させます。密閉したウェハを、本文に記載された温度プロファイルに設定した高温オーブンに配置した後、ウェハダイシングソーを用いてウェハを個々のチップに切り出します。ミキシングチップと溶液を保持するためのマニホールドは、レクサ（Lexan）やプレキシグラスなどのプラスチック、またはアルミニウムで製作できます。

温度制御のため、小さなOリングを用いてチップをマニホールドに取り付け、チップの中心部を光学的に明確に観察できるリテイニングリングで固定します。Oリングの溝は、チップに過度な圧力をかけずに良好に密着させるため、標準よりも浅く設計してください。チップの装着後、中心および側面のリザーバーに溶液を注入し、ウェルの底に溜まった気泡を完全に取り除くように注意してください。

マニホールドを倒立顕微鏡の上に設置し、接眼レンズまたはカメラ出力で混合領域を確認します。マニホールドの上に白熱式フラッシュライトを配置すれば、十分な光量を確保できます。中心チャネルに染料または高屈折率溶液を使用し、ジェットを観察してください。

このミキサーで使用される容量は非常に小さいため、溶液ウェルの上部に空気圧をかけることで流れを制御できます。ジェットを可視化するには、まずサイドチャネルの圧力を0 psiにし、センターチャネルと同じ圧力になるまでゆっくりと上昇させてください。サイドチャネルのいずれかが詰まっている場合、ジェットは出口チャネルの壁面のいずれかに押し付けられます。

目視で詰まりが確認された場合は、シリンジを用いて出口チャネルに圧力または真空をかけることで除去できる可能性があります。タンパク質やその他の有機物によってチップが詰まった場合は、ピラニア溶液に一晩浸漬することで洗浄可能です。ダイクロイックミラーを用いて、顕微鏡内部または直外から研究用顕微鏡にコーティングされたレーザービームを導入します。

接眼レンズまたはカメラで、混合領域の近くに焦点が見えるようにレーザーを調整します。ミキサー内のタンパク質からの蛍光は対物レンズで収集され、ダイクロイックミラーを通過し、レンズで集光されてピンホールへと送られ、フォトンカウンタで結像されます。ピエゾ電気スキャナーを用いてチップをx方向およびy方向に走査し、混合領域をイメージングします。

ジェット上の位置を選択し、X方向およびY方向にスキャンして、チャネル中心の垂直方向のフォーカスを合わせます。顕微鏡の被写界深度はチャネルの深さに比べて非常に小さく、壁面から1 µm以内を除いてチャネル内の流速は均一です。したがって、観察される蛍光の時間分解能は、主に共焦点スポットのサイズによって決定されます。

出口チャンネル内を、ジェットに沿って100 µm刻みで水平にスキャンし、各位置で約1 msの間観察します。その後、より遅い時間を捉えるために、顕微鏡ステージをジェットに沿って80～90 µm移動させます。あるいは、ダイクロイックミラーの後段にレンズを配置して光を入射スリットに集光させ、分光計とCCDで光を検出することも可能です。

データ収集速度が光子計よりも遅いため、通常はまず光子計でジェットの撮像を行い、次に分光計を用いてジェットに沿った各点の測定を行います。光子計のデータは、各位置でジェット周囲の3〜5ピクセルを合算することで解析し、強度対距離のプロットを作成します。時間は、印加圧力に基づいて算出された速度を用い、距離から計算されます。

最終ステップとして、本文に記載されている手法のいずれかを用いて分光器からのデータを解析します。ここに、フォトンカウンターで測定された混合領域における強度のコンタープロットを示します。ジェット外の出口チャネルにおける背景信号は検出器のノイズフロアに近いため、通常は減算しません。

背景が高すぎる場合は、アライメントが不十分であるか、タンパク質がチャネル壁に吸着している可能性があります。逆に、特に混合領域付近でジェットが屈曲していたり歪んでいたりする場合は、ノズルのエッチングが不十分であることを示しています。Alexa 488およびAlexa 647でラベル化したタンパク質ACell coenzyme a binding protein（A CBP）の時間分解スペクトルが示されています。

緑色と赤色の長方形は、それぞれドナーチャネルおよびアクセプターチャネルとして指定された波長を示しています。このデータは、ダークチャージとレーザー信号を除去するために背景減算処理が行われています。背景信号は、センターチャネルの圧力を0 psiなどの状態で測定しました。

混合時間は、ヨウ化カリウムによるトリプトファン蛍光の消光など、混合よりもはるかに速い急速反応を測定することで測定できます。ジェットが顕微鏡の光学分解能よりも小さいため、混合領域では強度が大幅に低下します。ジェットが形成される際、溶液条件を変化させないコントロール測定を行うことで、この装置応答を除去できます。

この図は、N-アセチルトリプトファンアミド蛍光の混合および非混合実験の比率を示しています。直線は、COMSOL Multiphysicsによるモデリングとシミュレーションから予測されたヨウ化カリウムの濃度を表しています。濃度が80%減少するまでにかかる時間として測定された混合時間は、8マイクロ秒です。

このプロットは、変性剤を6 molarから0.06 molarに希釈した後のタンパク質A CBPにおけるFRET変化を示しています。このデータにコントロール実験は必要ありません。FRETはすでに比率であり、装置の応答も除去されているため、T＝0付近の急速な跳ね上がりは、混合時間内でのFRET信号の急速な変化を表しています。

この開発を経て、本手法はタンパク質折りたたみ分野の研究者が、タンパク質構造形成における極めて初期の段階を探索する道を切り拓きました。