Name: 並列共焦点顕微鏡を使用して複数のセルの動力学的データの取得の高速化、高解像度、MTPA-GFPベースのミトコンドリア融合アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: 学ぶ並列共焦点顕微鏡を用いたMTPA-GFPベースのミトコンドリア融合アッセイ法。複数細胞の高解像度動力学的データを自動化して効率的に取得し、糖尿病や神経変性疾患におけるミトコンドリア動態の研究に応用できます。

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我々は、神経科学研究のためのタフツセンター、P30 NS047243（ジャクソン）、ボストン大学メディカルキャンパス、リンク医学Corporationの学際的医学研究のためのエヴァンスセンターでサポートされているミトコンドリアアフィニティ研究協力（mtARC）と、この作業を支援するためのツァイスに感謝します。

1。イメージングプレートの準備<ol><li> 10パーセント標準のウシ胎児血清を含むRPMI培地で培養INS1細胞、1％ペニシリン-ストレプトマイシン、2mMのL-グルタミン、50μM2 -メルカプトエタノール、5mMのNaHCO 3を 、2 mMのHEPES、2mMのピルビン酸、11 mMグルコース80％コンフルエントに。 </li><li> 0.05％トリプシンおよびプレートそれらのポリ-D-リジンコートしたカバースリップ底イメージングプレート（30〜40％コンフルエント）上でINS1細胞培養をトリプシン処理。 </li><li> 24時間（MOI = 5）プレート60-80％のコンフルエント（〜2日）に到達し、ミトコンドリアのマトリックスが標的に追加する（COXVIII）アデノウイルスは、PA-GFPを可能にします。交換媒体、細胞、イメージングの前に別の2日間に成長することができます。 </li><li>イメージングの日に、イメージングプレートに7から15 nMのTMREを追加し、少なくとも45分間平衡化します。 </li><li>インキュベーターのこの時間のターン（ステージ上のインキュベータは、ここで使用されている）の間に、顕微鏡°Cで約1時間37に平衡化することができます。 5％のCO 2をオンにします。 </LI&gt; </ol> 2。ツァイスLSM 710共焦点顕微鏡用撮像パラメータ<ol><li>顕微鏡で平衡化した後、取得タブの下に、パネルを設定し、撮像を開き、 &quot;ショーマニュアルツール&quot;をクリックし、 &quot;チャネルモード&quot;を選択し、すべての &quot;フレーム&quot;を追跡する切り替えます。 </li><li>光パスパネルでは、LSMおよびチャネルモードを選択します。標本のアイコンから作業して上向きに、690 +、およびMBS 488 &quot;リア&quot;、MBSを選択します。パネルの下部にある、明るいフィールドまたはDICチャネルの可視化を有効にするには、 &quot;T-PMT&quot;を選択します。 </li><li> GFPの色素のために490から540 nmへとTMRE色素のために580から700 nmまでの範囲を設定することにより、光パスのパラメータを調整して終了します。 </li><li>アクイジション·モードでは、512×512ピクセルのスキャンフィールド、平均4倍を使用して、（キャリブレーションの目的のために一貫性を維持したい場合があります）ズーム倍率を選択します。 </li></ol> 3。撮像パラメータの最適化<ol><li> FOCは、プランアポクロマート100倍（1.4 NA）の対物レンズを使用して、毒性からミトコンドリア保護するためにハロゲンライトではなく、蛍光灯、とあなたの細胞上に私達。 </li><li> PA-GFPは最大限に開いたピンホールを用いて細胞を発現し、明るい緑色であるセルを見つけるためにスキャンするための画面が表示されます。 </li><li> PA-GFPを有効にして、信号が検出器を飽和させないことを保証する撮像パラメータを最適化するために必要な2光子レーザーの最も低消費電力を見つける。 PA-GFPシグナルはいくつかのZシリーズ用TMRE信号と共局在することを確認してください。 TMRE信号の損失は、ミトコンドリアの脱分極または毒性を示し、これらの特性を示す細胞を解析に使用すべきではありません。 </li><li> PA-GFP発現細胞を見つけて、ズームの倍率を指定します。 </li><li> 6スライス（特定のZ-フォーカスが各位置で設定されていない限り、この範囲がすべての10個の細胞を満足する必要があります）収集するためにZシリーズの範囲を設定します。 </li><li>各セル（セル1、セル2など）のイメージング法を保存します。 </li></ol> 4。自動化を調整するDプログラムの部分と、あなたが1時間ミトコンドリア融合アッセイのためにウィル·フォロー10セルを指定します<ol><li> multitimeウィンドウの左側のパネルで、 &quot;省エネルギー&quot;パネルを選択し、ファイルが保存される場所を指定します。 </li><li> &quot;取得&quot;パネルで、スキャン設定で、セル1のために保存、取得メソッドをロードおよびzスタックのチェックボックスをオンにします。また、 &quot;ZスタックのZ-中央マーク&quot;を選択します。 </li><li> &quot;ブロック&quot;パネルで、 &quot;それぞれの場所で単一のブロック&quot;を選択してください。測定する間隔ごとに &quot;追加のブロック&quot;をクリックしてください。 </li><li> &quot;タイミング&quot;パネルで、 &quot;最初の場所だけでブロックするまでの待機間隔&quot;の &quot;間隔を待つ&quot;と入力し、 &quot;0&quot;を選択してください。ブロック2-4は、このセクションの &quot;15分&quot;になります。 </li><li>場所パネルのと、 &quot;場所との間の位置をロードするためにフォーカスを移動&quot;を選択し &quot;&#39;次のLOC&#39;をクリックするか、 &#39;は、LOCに移動する&quot;ときに設定スキャン負荷の下で &quot;編集場所のリスト&quot;を選択し、 &quot;複数&quot;を選択して、 &quot;すべてをクリア場所は &quot;ステージを電動。 </li><li> UNDER &quot;ブリーチ&quot;パネルは、 &quot;漂白剤&quot;ボックスをクリックし、 &quot;設定&quot;で設定ファイルを指定するプルダウンメニューなどの主要なソフトウェアのウィンドウで指定された。そして、 &quot;漂白&quot;ウィンドウで、適切な光活性化の方法を保存します。地域のパネルでは、この特定のセルのROIを選択し、ウィンドウの &quot;ROIのリストに現在の領域を追加する&quot;を選択してmultitimeこのROIを追加します。 &quot;ROI&quot;のプルダウンメニュー内の同じ場所を選択してください。 </li></ol>タイミングが正しく機能するためには、各セルは15分間隔を持っているため、2つの方法が保存する必要があります。ブロックのリストには、一つ目は &quot;本当の&quot;光活性化の構成を持って、残りは二光子レーザーを使用していません &quot;モック&quot;の設定があります。最初のブロックはまた遅延（BKIntv = 0）を持っていないブロックのみとなります。したがって、このメソッドは、光活性化のスキャンに続いて1ベースラインスキャンで始まります。ブロックの残りの部分は、900秒BkIntvを持っており、各時点でタイミングの一貫性を維持するためにだけ一度に2つのスキャンが0秒、があります。 <ol start="7"><li>時間の経過後にされる10個の細胞のそれぞれについて、このシーケンスを実行します。 表現するPAGFP見つけるのイメージング法をセルを保存する 場所パネルのマークステージ位置は、撮像方法を指定 主なROIパネルを選択し、特定のROIをパネルに保存し、またROIボックスにそれを読み込む光活性化ブリーチように関心領域を： ROIを消去し、1スキャンズームをリセット 次のセルを見つけるとズームを設定 次の9セルのためのプロセスを繰り返します。 </li></ol>各ステージの場所とすべてのブロックが関連付けられている適切な撮像法（スキャン設定）を持っていることを確認してください。また、残りは &quot;モック&quot;メソッドが含まれていながら、それぞれの場所で最初のブロックは、適切な光活性化法に対応していることを確認してください。最後に、 &quot;実行&quot;を選択してください。 5。 PA-GFPシグナル強度を解析する<ol><li&gt;の光活性化GFP-信号が赤TMRE信号に局在している細胞については、PAGFP画像（ここではmetamorphを使用します）のバックグラウンドを減算します。 </li><li>その後、データをExcelにエクスポートし、各時点で、Z-スタックの平均強度を計算します。無信号を持たない光学切片を破棄します。 </li><li>オリジナルの光活性化信号の割合を計算することによって、各Z-スタック内の信号の希釈を測定します。 </li></ol>各データポイントは、各時点の重複Z-スタック情報、その結果、2回スキャンされ、記録されます。 Z-スタックの値が一致していることを確認してください。そうでない場合は、これは問題（例えば、フォーカス、細胞運動）の指標である。 6。代表的な結果融合イベントが活性化および非活性化されたPA-GFPミトコンドリアの間で発生した場合には、ミトコンドリアのマトリックス内PAGFPは、非標識マトリックスと混合し、より大きな領域の上に希釈してなり、信号を減少させる強度（ 図1A）。ミトコンドリア融合の平衡に達するまで、INS1細胞では、信号強度の有意な減少は、（約1時間）、15分ごとに発生します。 図1Bのセルでは、PA-GFPとTMRE信号のほぼ完全な局在を示すことに注意してください。これらのアッセイでTMREの非常に低濃度（15 nM）をPAGFPの光活性化を標的とするための、また、細胞の健康を監視するために使用されています。脱分極ミトコンドリアが豊富な細胞がPAGFPとTMREの不完全な局在があります、これは死にかけている状態で、光毒性、または細胞のいずれかを示しているため、分析すべきではありません。 ミトコンドリアの融合のための平衡時間は、通常、ミトコンドリアの体積の約15％がアクティブになっているINS1細胞における1時間です。時には、小さな領域が点灯している場合であっても、ミトコンドリアのほとんどは、さらなる融合を検出することは困難である場合には、高度にネットワーク化されているために光活性化になる。他の細胞型は、異なる平衡化時間を示すことが、ミトコンドリアのダイナミクスを特徴づけるために短い間隔で、長い期間にわたってテストする必要があります。ミトコンドリアの融合を阻害するために、細胞をlipotoxic環境内に配置することができます。それは以前に0.4 mMのは、断片はミトコンドリアパルミチン酸、及びミトコンドリアの融合9を阻害することが実証されている。この効果は、ミトコンドリアが断片化され、 図2に見られることができますが、mtPAGFPの信号強度は、通常の条件（ 図1）の下でできるだけ変更されません。したがって、PA-GFPシグナルの希釈は、ミトコンドリアの融合ではなく、核分裂によるものである可能性があります。他の細胞タイプでは、我々はこのようなミトコンドリアの融合14が必要であるOPA1を黙らせるようにミトコンドリアの断片化を誘導する他の既知の方法を使用して、お勧めします。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3991/3991fig1.jpg" /> 図1。 </stroNG&gt;ミトコンドリア融合アッセイ中の光活性化後のPA-GFP信号の典型的な希釈。A. PA-GFPは、徐々に暗くこれらの投影画像に見られるように増加する領域の上にタンパク質の希釈につながるミトコンドリアの融合イベントのためになります15分ごとに定量化6光のセクション。PA-GFPとB. TMREは、ミトコンドリア脱分極アクティブではないことを示しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3991/3991fig1large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3991/3991fig2.jpg" /> 図2ミトコンドリア融合が0.4mMのパルミチン酸で阻害は、PA-GFPの希釈を減少させます。時間の経過とともに変化しない信号強度で短いミトコンドリアを示す6光学切片のA.投影 。TMREとPA-GFPのBの局在はミトコンドリアではないことを示していますド偏光。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3991/3991fig2large.jpg" target="_blank">拡大図を見るにはここをクリック</a> 。

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この記事への生産とフリーアクセスは、ツァイス社が主催している

買収は、光活性化後、15分ごとに発生した場合、このメソッドは、一度におよそ10細胞のイメージングを可能にします。細胞の正確な数は1つがどのように迅速に培養皿内でmtPAGFP発現する細胞を見つけて、マークすることができ、どのように迅速に1つのすべてのソフトウェアのパラメータを設定することができますによって異なります。指定されたZ-スタックマージンはすべてのセルに対して適用されるので自動化がスムーズに実行できるように細胞の均一な層を使用する必要があります。 この初期の光活性化領域のサイズは、平衡時間を制御します。ミトコンドリアの融合を測定することができるようにするには、それが残りのネットワークへの信号の広がりは経時的にモニターすることができるようなネットワークの唯一の10-20％、光活性化することが重要である。ネットワークのあまりに多くが光活性化されている場合は、それは完全な融合が速すぎると発生する可能性があり、イベントがキャプチャされません。 細心の注意を払う必要があり二光子レーザーのレーザパワーだけでなく、ミトコンドリアの脱分極を引き起こす毒性を避けるためにTMRE濃度を調整します。 mtPAGFP信号はTMRE信号と共局在することを保証することは、毒性と一般的な細胞の健康8,15を評価するのに役立ちます。 epifluoerescent光照射は避けるべきである。 mtPAGFPを発現する細胞を捜している間、低消費電力488nmの励起でスキャンしながら、ピンホールを最大限に開いている必要があります。 PA-GFPは1時間かけて信号を測定することではなく、セルのいずれかが8トリッキーなことができoversaturateないように十分な光活性化するために2つの光子レーザパワーを調整します。一度自動化されたプログラムが開始されたしかし、時間は、この最適化のステップに費やさなければならない、それは複数のセルを選択するには、それを停止し、再開するのは面倒です。 品質管理のため、微分干渉コントラスト（DIC）の買収は、セルにフォーカスを監視するための画像（または透過光）は非常にすることができます親切にも、スキャン中に浸油に形成された気泡を検出するための良い方法、これは時々ステージの動きから発生します。 このmtPAGFPメソッドを使用すると、ラベルが付いていないされているものに光活性化ミトコンドリアからのミトコンドリアのマトリックスタンパク質の単方向の動きにデータを収集しますが、それは他のプロセスを研究するためにこのテクニックを利用することが考えられる。の融合は、可溶性マトリックスタンパク質15の混合とは異なる時間スケールで発生し、ABC-私のために示されているようにたとえば、特定の蛍光色素は、核融合イベント時に、その特定の動きを観察し、膜タンパク質に結合することができます。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> COXIII-アデノPA-GFP </td><td>博士リッピンコット - シュワルツ</td><td></td></tr><tr><td> TMRE </td><td>インビトロジェン</td><td> T669 </td></tr><tr><td>ツァイスLSM 710共焦点</td><td>ツァイス</td><td></td></tr></tbody></table>

並列共焦点顕微鏡を使用して複数のセルの動力学的データの取得の高速化、高解像度、mtpa-gfpベースのミトコンドリア融合アッセイ

A Faster, High Resolution, mtPA-GFP-based Mitochondrial Fusion Assay Acquiring Kinetic Data of Multiple Cells in Parallel Using Confocal Microscopy

ミトコンドリア融合は、ミトコンドリアのカルシウム恒常性、バイオエナジェティクス、オートファジー、および品質管理において不可欠な役割を果たしています。融合の定量化は、一部のミトコンドリアにおいてマトリックス標的型光変換可能GFP（mtPAGFP）を光変換させることで、生細胞内で行われます。光変換された分子がミトコンドリア集団全体にわたって平衡に達する速度が、融合活性の指標として用いられます。これまで、測定は単一細胞のタイムラプスアプローチで行われ、1つの細胞における1時間の平衡化を定量化していました。本研究では、mtPAGFPと低濃度のTMRE（15 nm）を用いた、既報の生細胞法をスケールアップし、自動化します。この手法では、ミトコンドリアネットワークのごく一部を光活性化させ、15分ごとに1時間の合計で高解像度の共焦点断面スタックを収集し、信号強度の変化を定量化します。PAGFP発現細胞の発見の容易さや光活性化領域の信号などのいくつかの要因によりますが、15分の間隔で約10個の細胞を収集することが可能です。これにより、高解像度な細胞内定量および、本来の細胞構造環境におけるミトコンドリア挙動の詳細を捉えるために必要な速度論的パラメータを維持しつつ、このアッセイの時間効率を大幅に向上させることができます。
ミトコンドリアダイナミクスは、呼吸、カルシウム調節、アポトーシスなどの多くの細胞プロセスにおいて役割を果たしています1,2,3,13。ミトコンドリアネットワークの構造は、ミトコンドリアの機能および細胞の他の部位との相互作用に影響を与えます。ミトコンドリアネットワークは絶えず分裂と融合を繰り返しており、高度に融合したネットワークから、より断片化した状態まで、さまざまな形態をとります。興味深いことに、アルツハイマー病、パーキンソン病、シャルコー・マリー・トゥース病2A型、および優性視神経萎縮症は、ミトコンドリア形態の変化、具体的にはネットワークの断片化と相関していることが示されています4,10,13。多くの場合、断片化に伴いミトコンドリアは脱分極し、それが蓄積することで細胞機能の低下を招きます18。ミトコンドリア分裂は、細胞にアポトーシスへと進行させるシグナルとなることが示されています。また、脱分極した不活性なミトコンドリアを分離することで、ネットワーク全体の大部分を堅牢に維持するメカニズムとしても機能します14。一方で、ミトコンドリアの融合は、マトリックスタンパク質、溶質、mtDNA、および電気化学的勾配の共有をもたらし、アポトーシスへの進行を抑制すると考えられています9。ミトコンドリアの分裂と融合が細胞の恒常性、そして最終的に個体の機能にどのように影響するかについてはさらなる理解が必要であり、そのため、これらの現象に関する情報を収集する方法の継続的な開発と最適化が不可欠です。
既存のミトコンドリア融合アッセイにより、ミトコンドリア生理学に関するさまざまな知見が得られており、それぞれに利点があります。ハイブリッドPEG融合アッセイ7では、異なるラベルを付けた2つの細胞集団（mtRFPとmtYFP）を混合し、融合して多核化した細胞内における蛍光物質の混合量と共局在を解析します。この手法から貴重な情報が得られていますが、すべての細胞型が融合できるわけではなく、融合を促進させる条件に毒性のある薬剤の使用が含まれているため、通常の融合プロセスに影響を及ぼしている可能性があります。より最近では、ルシフェラーゼアッセイに基づいて孤立ミトコンドリアを用いて融合イベントを観察する、セルフリー法が考案されました1,5。2つのヒト細胞株に、混合時に二量体化を確実にするためのロイシンジッパーと共に、Renillaルシフェラーゼのアミノ末端またはカルボキシ末端部分を標的化させます。各細胞株からミトコンドリアを単離し、融合させます。融合反応は、エネルギー、適切な温度、およびミトコンドリア内膜電位が存在する生理的条件下において、細胞質がなくとも起こり得ます。興味深いことに、細胞質が融合の程度を調節することが判明しており、細胞シグナル伝達が融合プロセスを制御していることが示されました4,5。このアッセイは、融合装置の構成要素や、ミトコンドリアダイナミクスに影響を与える可能性のある薬理学的化合物を特定するためのハイスループットスクリーニングに非常に有用です。しかし、これらのイベントを細胞内環境で観察するためには、このin vitroアッセイを補完する、より詳細な全細胞ミトコンドリアアッセイが必要となります。
全細胞ミトコンドリアダイナミクスをモニタリングする手法が以前から用いられており、これはミトコンドリア標的型光活性化GFP (mtPAGFP)6,11に基づいています。mtPAGFPを発現させ、ミトコンドリアネットワークのごく一部（10-20%）を光活性化し、信号が残りのミトコンドリアネットワークへ拡散する様子を、タイムラプス共焦点イメージングを用いて15分おきに1時間記録します。融合イベントが発生するたびに信号強度が希釈されるため、融合速度の定量化が可能になります。細胞内では融合と分裂が絶えず起こっていますが、分裂ではPAGFP信号の希釈が起こらないため、この手法では融合のみをモニタリングします6。低濃度のTMRE（INS1細胞では7-15 nM）で共標識することで、ミトコンドリアの膜電位を定量化できます。ミトコンドリアが過分極するとより多くのTMREを取り込み、脱分極するとTMRE染料を喪失します。脱分極したミトコンドリアは十分な膜電位を保持しておらず、融合効率が低下するか、あるいは全く融合しなくなります。したがって、低濃度のTMREを用いることで、活発に融合しているミトコンドリアを追跡できます9,15。TMRE信号を欠く脱分極ミトコンドリアの蓄積は、光毒性または細胞死の兆候である可能性があります。高濃度のTMREを使用すると、ミトコンドリアがレーザー光に対して非常に過敏になるため、TMREの過剰標識を避けるよう細心の注意を払う必要があります。ミトコンドリアの脱分極の影響に関心がある場合は、やや高濃度のTMREとより強いレーザー光を用いて、制御された方法でミトコンドリアを脱分極させる手法が利用可能です（Mitra and Lippincott-Schwartz, 2010）。TMREによる毒性が問題にならないことを確認するため、標識した細胞（3-15 nM TMRE）をアッセイで使用するイメージング条件（例えば、6枚の光学セクションを1セットとして7スタック連続で撮影）にさらし、2時間後に細胞の状態を評価することを推奨します。ミトコンドリアが断片化しすぎているか細胞が死滅している場合は、TMREの代わりにdsREDやMitotracker redなどの他のミトコンドリアマーカーを使用してください。
mtPAGFP法により、他の手法では可視化できなかったミトコンドリアネットワークの挙動に関する詳細が明らかになりました。例えば、ミトコンドリアの融合には、完全な融合と、ネットワーク全体の形態を変化させずにマトリックスの内容物のみが混合する一過性の融合があることが分かっています。さらに、融合の確率は、接触時間やオルガネラのサイズとは無関係であり、オルガネラの運動性、膜電位、および過去の融合活動の履歴に影響されることが分かっています8,15,16,17。
本論文では、サブセルラー解像度を損なうことなく、一度に複数の細胞を観察し、データ収集の時間効率を向上させるため、mtPAGFPと15nM TMRE8を用いた既報のプロトコルをスケールアップさせる手法について述べる。これは、自動顕微鏡ステージとプログラム可能な画像取得ソフトウェアの使用によって実現した。Zeiss社のZenソフトウェアを使用することで、mtPAGFPを発現する特定の細胞を複数指定し、マークして追跡することができる。これらの各細胞について、特定の関心領域（ROI）で光活性化を行い、指定した間隔でmtPAGFP信号およびTMREの共焦点スライススタックをモニタリングすることが可能である。プログラム可能な自動ステージ、CO2インキュベーター、およびPAGFPを光活性化させる手段（マルチフォトンレーザーまたは405 nmダイオードレーザーのいずれか）が備わっていれば、他の共焦点システムを用いて本プロトコルを実施することも可能である。

ミトコンドリアの融合は、時間をかけてネットワークを介してミトコンドリアのマトリックスphotoconvertedをターゲットとしたGFPの平衡を追跡することによって測定した。これまでのところ、1つだけのセルが同時に時間の長い運動解析に供することができます。我々はこれにより、データ収集プロセスをスピードアップ、同時に複数のセルを測定する手法を提案する。

並列共焦点顕微鏡を使用して複数のセルの動力学的データの取得の高速化、高解像度、MTPA-GFPベースのミトコンドリア融合アッセイ

ミトコンドリアの融合は、ミトコンドリアのカルシウム恒常性、生体エネルギー論、オートファジー、およびクオリティコントロールにおいて不可欠な役割を果たしている。融合の定量化は...で行われる。

本実験の全体的な目的は、複数の細胞におけるミトコンドリアの融合を、高解像度の3D画像を用いて並行して測定することです。これは、まず標的細胞に光活性化GFP（photoactivatable GFP）を発現させ、次に、各細胞のミトコンドリア集団のうち狭い領域でGFPを光活性化させることで達成されます。その後、信号が平衡状態に達するまで15分ごとに各細胞の6つの光学断面を収集し、ミトコンドリア融合の程度、すなわち最終的なミトコンドリア標的光活性化GFP強度の希釈を評価します。蛍光信号の定量化に基づき、ミトコンドリア融合を起こしている細胞におけるGFP強度の評価が可能です。この手法の主な利点は、自動化されているため、複数の細胞の高解像度データをより迅速に収集できることです。本法ではINS-1細胞を用いて実演し、糖尿病への知見を提供しますが、他の細胞型にも適用して、老化や代謝性疾患、神経変性疾患におけるミトコンドリア融合全体を研究することが可能です。イメージングの自動化ステップは他で説明されていないため、本手法の視覚的な実演が不可欠です。INS-one細胞を80%コンフルエンスまで培養した後、0.05%trypsinで細胞を剥離し、再懸濁した細胞をポリリシンコートされたカバーガラス底イメージングプレートに播種します。2日間の培養後、ミトコンドリアマトリックス標的のアデノウイルス光活性化GFPをプレートに添加します。その後、細胞を24時間培養し、培地を交換してさらに2日間細胞を増殖させます。イメージング当日に、イメージングプレートに7～15 nMのTMREを添加し、少なくとも45分間培養液を平衡化させます。この間に、5%二酸化炭素、インキュベーター、および平衡化した顕微鏡の電源を入れます。「Acquisition」タブで、「Show manual tools」をクリックします。「Imaging setup」パネルを開き、「Channel mode」と「Switch」を選択してください。「Light path」パネルで、すべてのフレームを追跡します。LSMおよびチャンネルモードを選択します。次に、検体アイコンから上に進み、パネル下部のrear MBS six 90 plusとMBS 4 88を選択し、TPMTをチェックして明視野またはDICチャンネルの可視化を有効にします。GFP染料の範囲を490～540 nmに、TMRE染料の範囲を580～700 nmに設定し、光路パラメータの調整を完了します。最後に、撮像モードを開き、フレームサイズで512×512ピクセルのスキャン領域を設定し、平均化回数のメニューで4回に設定します。次に、対物レンズを使用して、ハロゲン光で細胞に焦点を合わせます。ピンホールを最大まで開き、スキャンして、明るい緑色の光活性化GFP発現細胞を探します。任意のレーザー出力の写真を設定して細胞を活性化し、Zスタックの光学切片を撮影して活性化が十分であるかを確認します。次に、良好なSN比を維持するため、検出器のゲインを最大限に上げすぎないようにして、イメージング用の488 nmレーザーを低出力に調整します。信号が飽和していないことを確認した後、光活性化GFP信号がTMRE信号と共局在していることを確認します。最後に、ピンホールを開き、検出器のゲインを上げ、次に新しい光活性化GFP発現細胞を探してズーム倍率を指定します。次に、6枚のスライスを収集するようにZシリーズの範囲を設定し、イメージング方法を保存します。これで、左パネルのマルチタイムウィンドウを開きます。保存パネルを選択し、[select image folder]をクリックして、ファイルを保存する場所を指定します。次に、撮影パネルの[scan configuration]プルダウンメニューから、先ほど保存したイメージング手法を選択します。続いて、Zスタックの中央にマークされたZの中間点を選択してください。次に、ブロックパネルを開き、各位置でシングルブロックを選択します。続いて、測定する各インターバルに対して「add blocks」をクリックし、タイミングパネルを開いて「weight interval」を選択し、「before block at first location only」のウェイトインターバルに0を入力します。ロケーションパネルを選択した後、「move focus to load position between locations」と、edit locationsリストの下にある「load scan config when move to LO or next LO clicked」を選択します。「clear all」を選択し、その後、ブリーチパネルで「multiple locations motorized stage」を選択してください。ブリーチボックスをクリックし、configプルダウンメニューで構成ファイルを指定します。次に、メインソフトウェアの漂白ウィンドウにおいて、リージョンパネルに適切な光活性化方法を保存します。この特定の細胞のROIを選択し、「add current region to ROI list」ウィンドウを選択して、このROIをマルチタイムに追加します。ROIのプルダウンメニューで同じ場所を選択していることを確認してください。最後に、経時的に追跡する10個の細胞それぞれについて、以下の手順で行います。まず、細胞を見つけたら、ロケーションパネルでステージ上の位置を示し、アクイジションパネルで個別のスキャン構成方法を指定します。すべてのブロックでスキャン構成を指定してください。次に、メインリージョンパネルで、光活性化させる関心領域（ROI）を選択します。続いて、ブリーチパネルでROIを保存し、ROIウィンドウに読み込みます。その後、メインリージョンウィンドウでROIを消去し、スキャンをリセットします。ズームを1に設定し、次の細胞を見つけたらズームを設定します。同様の操作を残り9つの細胞で繰り返し、各ステージの位置とすべてのブロックに適切なスキャン構成が指定されていること、また、各位置の最初のブロックに適切な光活性化法が設定され、それ以外のブロックに模擬法（mock method）が設定されていることを確認します。その後、光活性化GFP信号が赤色のTMRE信号と大部分に共局在している細胞を選択して実行します。光活性化GFP画像の背景を減算し、領域測定の設定を平均強度で報告するように構成します。次に、ZSスタックの各スライスにおいてデータをExcelファイルにエクスポートします。シグナルのない平面を除外した後、各タイムポイントのZSスタック強度を初期の光活性化強度で除算し、単一のINS細胞における元のシグナルの割合を算出します。ミトコンドリア融合の平衡状態に達するまで、1時間の間、15分ごとに信号強度の著しい低下が起こります。これは、典型的なミトコンドリア融合アッセイ中に15分ごとに定量化した6つの光学切片の投影画像に示されています。これらのアッセイでは、光活性化GFPの光活性化を標的にし、細胞の健康状態をモニターするために、非常に低濃度のTMREが使用されています。細胞において、緑色の光活性化GFPと赤色のTMREシグナルがほぼ完全に共局在していること、また、これらの染料の共染色により、低ミリモル濃度においてミトコンドリアが活性であり、脱分極していないことが示されています。パルミチン酸はミトコンドリアを断片化し、ミトコンドリア融合を抑制します。したがって、パルミチン酸処理した細胞のこれらの光学切片に見られるように、ミトコンドリアは断片化しており、マトリックス標的型光活性化GFPのシグナル強度は、前図で示された正常な条件下ほど変化しませんでした。したがって、本図で見られる光活性化GFP信号の希釈は、分裂ではなくミトコンドリア融合によるものである可能性が高いと考えられます。本手法を確立する際は、信号を維持するのに十分な量のGFPを光活性化しつつ、ミトコンドリア融合イベントを見逃さない程度の量に留めるため、GFPとTMREが共局在している細胞を選択すること、および光学切片内でミトコンドリアの全体積を回収することを留意してください。特定の調節タンパク質やシグナル分子が存在しない場合にミトコンドリアネットワークにどのような変化が起こるかを決定するために、本アッセイは、遺伝子をサイレンシングさせた群や、さまざまな薬剤で処理した群など、複数の実験群で実施することが可能です。ミトコンドリア融合を定量化し、パラメータを統計的に分析できることで、疾患状態におけるミトコンドリアダイナミクスの研究が可能となり、治療法の開発を促進します。

a-faster-high-resolution-mtpa-gfp-based-mitochondrial-fusion-assay

Research

JoVE Journal

Biology

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