化学的に成層南極湖と炭素固定ポテンシャルの評価から微生物真核生物濃縮文化の確立

本手順の目的は、南極のボニー湖から原生生物の濃縮培養物を調製し、代謝多様性の初期プロキシの一環として炭素固定量を測定することです。まず、原生生物および植物プランクトンの既知のピークに対応するボニー湖の湖水深度からサンプリングを行います。その後、湖水サンプルをさまざまな増殖培地に接種し、温度調節機能と照明を備えた培養装置内で4〜6週間培養します。

培養物は必要に応じて4 °Cで輸送できます。次のステップは、濃縮培養物から粗細胞溶解液を抽出することです。この手順の最終ステップは、リブロース1,5-ビスリン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ（Rubisco）活性の放射性同位体アッセイを用いて、細胞溶解液中の炭素固定能を評価することです。

最終的に、プロテリスト濃縮培養により、天然のプロテリストコミュニティにおける炭素固定能に多様性があることが示されました。この手法は、湖の微生物生態学に関する重要な疑問への回答に役立ちます。例えば、成層化した南極の湖における炭素循環の様々な段階における、微生物真核生物の役割などが挙げられます。

後続世代の濃縮培養のための水柱サンプリングは頻繁に用いられる手法ですが、本手法には、予期せぬ問題が発生し得る極寒環境で運用するための変更が加えられています。私がこの手法を最初に考案したのは、天然の湖水サンプルを用いてRediscoアッセイを検証する方法を検討していた時でした。サンプリング地点が多くの研究者にとって馴染みのない環境にあるため、サンプリングの手順を具体的にイメージすることが困難であり、本手法の視覚的な実演は極めて重要です。

サンプルは、南極のマクマードドライバレーにある、通年氷に覆われた数多くの湖の一つであるボニー湖から採取します。水柱のサンプリングを行う1日前に、サンプリング地点を選択し、準備してください。これにより、掘削や氷穴の融解による乱れの後、水柱の成層構造が再形成される時間を確保できます。GPSを用いてドリル地点の位置を特定し、水柱へのアクセス経路を確保してください。

まず、4インチのJiffyフライトエクステンションとカッティングビットを取り付けたJiffy Iceオーガーを使用して、氷に穴を開けます。これは、穴の中でドリルが凍結するのを防ぐためです。水柱の頂点から約4〜6インチ上の位置で掘削を停止し、液状の水まで掘り進めないようにしてください。サンプリングのために、ドリルの穴を直径6インチから2フィートまで広げる必要があります。

これは、加熱したポリエチレングリコールを銅管に通して循環させる熱海モデルホールメルターを用いて行われます。溶解には通常、水柱のサンプリング前日に最大18時間かかります。必要なすべての機器と試料保存容器がサンプリング現場に揃っていることを確認してください。

サンプリング材料には、容量5〜10リットルのNICUボトル、深さ校正済みケーブルを備えたウィンチ、各サンプリング深度に対応する十分な数のサンプルボトル、メッセンジャー、およびサンプル輸送用のクーラーが含まれます。湖水のろ過をサンプリング当日に完了させる必要があるため、午前5時頃の早朝からサンプリングを開始してください。校正済みハンドウィンチに取り付けたキンサンプラーを使用してサンプリングを行います。

本研究で指定された深さから、1〜5 Lの水サンプルを採取します。サンプリング深さは、アイスホールのPI対称水位から測定して6 m、15 m、および18 mとします。採取した湖水サンプルはクーラーで保管し、採取地点からフィールドラボまで運搬します。

ATVに取り付けたソリを使用して、サンプルをフィールドラボで処理または安定化させます。サンプリング後、サンプルをフィールドラボに輸送した直後に、濃縮培養を開始してください。0.5〜1 Lの湖水を、孔径0.45 µmの47 mmフィルターで濃縮します。

穏やかなろ過法を用いて、ポリエーテルスルホンフィルターでろ過します。自然コミュニティの多様性を調べたい場合は、2つ目のサンプルを直径 47 mm、孔径 0.45 µm のフィルターでろ過してください。

ポリエーテルスルホンフィルターを液体窒素で急速凍結させます。各フィルターを、フィルターと同じ採取深さから採取したろ過済み湖水約 20 milliliters を含む 50 milliliter の滅菌ファルコンチューブに移します。

異なる培養培地で濃縮するため、細胞懸濁液を25 cm四方の滅菌済み細胞培養フラスコに移します。各サンプリング深度について、複数の反復試料を準備します。各培養フラスコに、Bold Basal Medium、BG 11、およびF/2の各滅菌済み培養培地溶液を50 x分添加します。

混合栄養不全生物の培養が必要な場合は、F2補充済み容器を2つ用意し、そのうちの1つの培養フラスコに滅菌済み米粒を2～3粒加えます。米国研究室への配送前に、温度制御機能付きの育成インキュベーター内で、低温かつ低照度条件下で少なくとも4週間培養してください。濃縮培養液を滅菌済みの50 mL Falconチューブに移します。配送依頼時には、「冷凍禁止」および「要冷蔵」の配送要件を指示してください。米国に到着後、各濃縮培養液5 mLを、125 mLフラスコに入れた45 mLの適切な増殖培地に移します。

滅菌済みスポンジで蓋をした滅菌済みエルレンマイヤーフラスコを使用します。4 °Cに制御された環境成長チャンバー内で濃縮培養液を静置培養し、30日ごとに新鮮な培地へ継代します。細胞溶解物の抽出操作を開始するため、緩やかな真空吸引を用いて、5 Lの濃縮培養液を25 mmのWhatman GFFフィルターでろ過します。

次に、滅菌済みの鋼製鋏を用いて、フィルターを4〜5つのセクションに切り分けます。その後、滅菌済みのピンセットを使用して、切り分けた断片を、0.1 mm径の溶液が5分の1量まで満たされた2 mLスクリューキャップチューブに移します。

ジルコニア・シリカビーズ。チューブに 1.25 milliliters のフィルター抽出バッファーを加え、ミニビーズビーターを用いて速度設定 48 で 30 seconds 間細胞を破砕し、その後 1 minute 間氷上で静置します。サンプルの加熱を防ぐため、ビーズビーターによる処理と 1 minute 間の氷上インキュベーションを、さらに 2 回繰り返します。

4°Cで3000×gで2分間、フィルターで遠心分離します。これにより、GFFフィルター繊維と細胞壁の残渣からなる緩いペレットが形成されます。このペレットから200 µLを分取し、氷冷した90%アセトン800 µLに浸漬させます。

残りの上清を1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。分光光度計を用いて、波長664 nmおよび647 nmで抽出可能なクロロフィルAを測定します。残りの上清を4 °Cで15,000 ×gにて2分間遠心分離します。

不溶性の細胞膜のペレットおよび残存するGFFフィルター繊維を避けて、Sを清潔な1.5 milliliterマイクロ遠心チューブに移します。この可溶性細胞溶解液を、次に説明するルビスカルボキシラーゼ活性測定に使用できます。この測定を開始するために、各可溶性溶解液125 microlitersを、氷上で冷却した1.5 screw capマイクロ遠心チューブに移します。

陰性対照サンプルには、1.5 mLスクリューキャップ付きマイクロ遠心チューブに125 µLの可溶性ライセートを添加し、基質は添加しないでください。その後、すべてのサンプルおよび陰性対照について、2連の反応を行います。アッセイバッファー10 mLを調製し、新鮮な状態で氷上で冷却しておきます。

すべてのサンプルおよび陰性対照に十分な量の分析バッファーを5 mLチューブに分注します。ここからのすべての手順は、ドラフトチャンバー内で行ってください。割り当てられたバッファーに$^{14}\text{C}$標識重曹（炭酸水素ナトリウム）を加え、バッファーを氷上で保持します。

C 14を含むアッセイバッファーを10 µL取り出し、1 mLのアッセイバッファーで希釈し、反転させて混合する。希釈した混合液100 µLを、3 mLのBios Safe 2シンチレーションカクテルが入ったシンチレーションバイアルに加え、反転させて混合する。Beckman LS 6, 500カウンターを用いてC 14のカウント数を測定する。アッセイを続行する前に、シンチレーションカウントが18, 000 cpm以上であることを確認する。

アッセイバッファーに十分な量のC 14標識炭酸水素ナトリウムを加えたら、反応チューブを25 °Cに設定したドライバスに移し、3〜5分間インキュベートします。次に、ライセートに100 µLのアッセイバッファーを加え、25 °Cで5分間インキュベートします。5分後、各サンプルにリブルロース-1,5-ビスリン酸を加え、25 °Cで5〜10分間反応させます。

反応を停止させるため、100 µLの100%プロビオティック酸を添加し、2000 ×gで1時間遠心分離して、未結合のC 14を除去します。最後に、サンプルの全量を、3 mLのBios Safe-2シンチレーション計数カクテルを含むシンチレーションバイアルに移し、酸安定した1分間あたりの計数値を測定します。

シンチレーション計数法による最終産物の測定。南極のボニー湖の3つの水深から、新規の低温適応性光合成および混合栄養プロティストを単離するために、富栄養化培養を用いた。より多様な生物を選別するため、Bold's Basal Medium (BBM) または BBMF-2、マリン培地、および BG 11 培地という様々な種類の増殖培地を使用した。

この表に示す栄養塩濃度および光合成有効放射（PAR）は、試料採取時の条件を表しています。光顕微鏡による濃縮培養物の目視確認により、ほとんどの細胞にクロロフィル色素が存在することから、培養物は光合成原生生物が優占していることが明らかになりました。また、培養物には、接種源となった採取深度や培養に使用した培地に応じて、多様な細胞形態が含まれていました。

炭素固定の指標として、rubis酵素によって触媒されるカルボキシラーゼ活性の最大速度を濃縮培養液中で測定しました。また、ここに示すように、光合成原生生物のバイオマスの推定値として、潜在的なクロロフィルa量もモニタリングしました。

すべての培養物を同じ温度と光条件下で培養したにもかかわらず、炭素固定能および光合成生物バイオマスは、濃縮培養物間で劇的に異なっていた。最大の rubis O 活性は、BBM培地で増殖した濃縮培養物4および6と、BG 11培地で増殖した濃縮培養物13および14で観察された。対照的に、F2増殖培地で濃縮した培養物1921および23が示した最大カルボキシラーゼ活性は、4〜34倍低かった。

カルボキシラーゼ活性をクロロフィルa量あたりで算出したため、これらの差はF two培養物のバイオマスレベルが低かったことに起因するものではありませんでした。さらに、ピアソン相関分析により、rubis co活性はクロロフィルa濃度と相関しないことが明らかになりました。BBM培養物には、水深6mおよび15mからの湖水が接種されました。

濃縮のフォーラム5で最も高いクロロフィルAレベルが示されましたが、他のすべての培養液では、rubis酵素活性に関わらずクロロフィルaは相対的に低い値を示しました。習得すれば、湖のサンプリング技術の実施には約2時間を要します。採取するサンプル数によりますが、正しく実施すれば、カルボキシラーゼアッセイにも同様に2時間かかります。この手順に続いて、異栄養性酵素活性アッセイなどの他の手法を用いることで、異栄養生物がどの深さに存在するかといった追加の疑問に答えることができます。さて、このビデオを視聴したことで、湖のサンプルの採取、生産のための濃縮、およびrubisカルボキシラーゼ活性のアッセイ方法について十分に理解できたはずです。