Name: 化学的に成層南極湖と炭素固定ポテンシャルの評価から微生物真核生物濃縮文化の確立 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 38 s
Description: 学ぶ南極ボニー湖の微生物真核生物濃縮培養法とRubisCO活性による炭素固定ポテンシャル評価。この手法は極限環境における微生物生態系の代謝多様性解明に貢献します。

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著者らは、J. Priscu、A. Chiuchioloと南極のサンプルの収集と保全の支援のためマクマードLTER陸チームに感謝します。我々は後方支援のためにRatheonポーラーサービスおよびPHIのヘリコプターに感謝します。光顕微鏡は、高度な顕微鏡とイメージングセンターのマイアミのセンターで生成されました。この作品は、極性のプログラム補助金0631659と1056396のNSF Officeによってサポートされていました。

1。サンプルの取得<ol><li>選択して水柱をサンプリングする前に、一日のサンプリングサイトを準備します。これは、水柱の成層は、掘削し、氷穴の融解に起因する障害の後に改革することができます。 GPSによるドリルサイトの場所を識別します。 </li><li>水柱にアクセスするには、4インチジフィー飛行拡張や切削ビットに取り付けられたジフィーアイスオーガーで氷に穴をあけることから始めます。穴のドリルの凍結を防ぐために、水柱の上端より上に掘削約4〜6インチを停止させることによって液体の水に掘削を回避しようとします。 </li><li>ドリル穴は、以前のサンプリング15〜60 cmの直径から拡大する必要があります。これは、銅管を介して加熱されたポリエチレングリコールを循環させる穴溶融装置（Hotsyモデル）の使用によって達成されています。穴の融点は、通常、18時間を要します。 </li><li>前の水柱をサンプリングし、確実に必要なすべての機器とサンプルのSTオレージ船は、サンプリング現場で組み立てられています。サンプリング素材が含まれます：Lニスキンボトル（5-10 L容量）、深さ校正ケーブルでウィンチ、メッセンジャー、それぞれのサンプリング深さのために十分なサンプルボトルとサンプル輸送のためのクーラーを。 </li><li>湖の水のフィルタリングは、サンプリングの完了日に完了する必要がありますので、早期の日（〜午前5時）のサンプリングを開始します。キャリブレーションに取り付けられたLニスキンサンプラーを使用して：（6-M、15-mと氷の穴で井戸水の水位から測定した18メートルのサンプリング深さ、この研究のための）は、所望の深さから水のサンプル（1-5 L）を収集ハンドウインチ。水柱の乱れを防止するためにはより深いものを前に、浅い深度を収集します。 </li><li>サンプルサイトからATV（全地形車両）に取り付けられたそりを使用してフィールド実験室にクーラーと輸送の店湖は、サンプル。フィールドラボすぐに次のサンプリング時：サンプルが処理されるか、（液体窒素中でフラッシュ凍結などのために）安定させてください。 </li></ol> 2。 Developme濃縮文化のNT <ol><li>濃縮培養の培養に、穏やかなろ過を（&lt;0.3気圧）を使用して、47ミリメートル0.45μmの細孔径ポリエーテルスルホンフィルター上に湖の水の0.5〜1 Lを集中。自然界の多様性が必要な場合は、47ミリメートル0.45μmの細孔径ポリエーテルスルホンフィルター上に第二の試料をフィルタ処理し、4真核生物の系統多様性のBielewicz らによるとプロトコルに従ってください。 </li><li>フィルタと同様のサンプリング深さから採取したフィルタ湖の水〜20 mLを含む50 mlの滅菌ファルコンチューブにフィルターを転送します。穏やかに滅菌ピペットを用いてフィルタから細胞を洗浄する。 </li><li> 25cm 2の滅菌細胞培養フラスコに細胞懸濁液を転送します。 45 mLに培養液量を増やすために、各サンプルの深さから採取したフィルタ湖の水を追加します。異なる培地上で濃縮が必要な場合は、複数の各サンプリング深さのために複製する設定を行います。 </li><li> 50X sで培養フラスコを補う太字の基礎培地、BG11とF / ​​2：次の培地の1Xの最終濃度にterileソリューションを提供しています。混合栄養生物の栽培が必要な場合は、2 F/2-supplemented血管を設定し、フラスコのいずれかに無菌米の2-3粒を追加します。 </li><li>あなたの米国の研究室への出荷前に南極には、少なくとも4週間温度制御された成長のインキュベーター内で低温（4℃）、低照度（20マイクロモル光子m -2 s -1で ）で、培養フラスコをインキュベートします。 2週間のインキュベーション後に、適切な増殖培地を含む寒天プレート上での増菌培養の分離菌株が必要な場合は、プレート250μL。 </li><li>米国への出荷のために、滅菌50 mlのFalconチューブに濃縮培養を転送します。の要求出荷の要件は、 &quot;凍結しないでください&quot;とリクエストを出荷し、 &quot;冷静さを保つ&quot;。南極からの出荷プロセスは比較的高速（商用飛行機で2週間）と信頼性の高いですが、潔癖臓器の損失の可能性がありますトランスポート·プロセス中にISMS。したがって、調査官は、出荷プロセスの間にある種の損失を評価することができるように出荷する前に、サブサンプルを保存することができます。 </li><li>米国に到着し、125 mLの滅菌三角フラスコ内の適切な増殖培地45 mLに濃縮文化の転送5 mLを滅菌スポンジで蓋をした。濃縮培養物は、4で温度制御された環境成長チャンバー（日周成長チャンバー、VWR）°C/20モル光子m -2 s -1での立っている培養として維持されるべきである。培養は30日ごとに新鮮なメディアに転送する必要があります。 </li></ol> 3。フィルタ処理された濃縮細胞ライセートから抽出<ol><li>穏やかな真空（&lt;10 PSI）を使用して、25ミリメートルワットマンGF / Fフィルター上に培養液のフィルターを5mL。フィルタは、°Cの前のRubisco活性を測定するに-80℃で数週間保存することができます。 </li><li>滅菌鋼製ハサミで4から5セクションにフィルタをカットし、転送2mLのスクリューキャップチューブに滅菌ピンセットを持つ部分は、0.1mm径のジルコニア/シリカビーズとの完全な方法の5分の1を満たした。 </li><li>フィルタの抽出バッファー（50 mMのビシン、10mMのMgCl 2、1mMのEDTA、5 mg / mLのBSA、0.1％トリトンX-100の1.25 mLを加え、新鮮な追加の10mMのNaHCO 3、10mMのDTT、アミノカプロン3.3 mMの酸、0.7 mMのベンズアミジンは、pH 7.8）13および速度の設定48代のためにMinibeadビーター三回を用いて細胞を破壊する。 1分氷のインキュベーションで、サンプルの加熱、代替beadbeatingを防ぐことができます。 </li><li> GF / Fフィルター繊維や細胞壁の破片の緩いペレットを形成するために4℃で3000×gで2分間フィルタースラリーを遠心分離します。 </li><li>氷冷90％アセトンの800μLに200μL分注し浸すを削除します。 664 nmと647 nmで14の波長値で分光光度計で抽出クロロフィル（CHL）を測定する。 1.5 mlのマイクロ遠心チューブに上清を移します。 </li><li> remainiを遠心4でngの上清°15000 xgで2分間、Cと1.5 mlのマイクロ遠心チューブに（不溶性の細胞膜と残りのGF / Fフィルター繊維のペレットを避けるため）、上清を移す。この可溶性細胞溶解液は、現在のRubiscoカルボキシラーゼ活性のアッセイに使用することができます。 </li><li>ライセートは-80℃で液体窒素で12.5％のグリセロールとフラッシュ凍結を添加した後保存することができます。活性の損失は、溶解物中の酵素の感度に応じて、複数の凍結/融解サイクル後に発生する可能性があります。したがって、新鮮な対凍結ライセートの活性は、大規模な細胞溶解液の抽出の前にテストする必要があります。 </li></ol> 4。ルビスコカルボキシラーゼ活性フィルターアッセイ<ol><li>氷上で冷却された15mLのスクリューキャップマイクロチューブ（キャップ​​は必要ありません）に水溶性の溶解液125μLを転送します。陰性対照サンプルについては、15mLのスクリューキャップマイクロチューブに125μL、可溶性溶解物を追加しますが、（ステップ4.7）基板を追加しないでください。実行すべてのサンプルとネガティブコントロールの反応を複製します。 </li><li>氷の上でアッセイ新鮮な緩衝液（50mMビシン-NaOHで、pH8.0で、50mMのNaHCO 3を 、25 mMのMgCl 2）、チル10mLを準備します。十分に5 mLのチューブにサンプルとネガティブコントロール（サンプル/コントロールに加えて100μL追加ごとに100μL）のすべてのアッセイ用緩衝液のアリコート。ヒュームフードの下のすべての後続の手順を実行します。 </li><li>等分バッファにNaHを加えアッセイ緩衝液あたり14 CO 3（500μCiの/ mL）を40μLを追加して、氷の上でバッファを保持します。 </li><li> 14 Cを含むアッセイ緩衝液10μLを削除して、アッセイ緩衝液1 mLに希釈します。混在させる反転した後、シンチレーションバイアル中でカクテルを数えるバイオセーフIIシンチレーションの3 mLに1:100希釈した混合物の100μLを追加します。混在させる反転します。シンチレーションカウント（ベックマンLS6500）は、アッセイを続行する前に、18000 CPM以上でなければなりません。 </li><li>のNaH 14 CO 3は、アッセイバッファーに追加されたときに十分な、3から5分間25℃でインキュベートしにプリセットされて乾燥した浴に反応管を移動します。 </li><li>ライセートに100μLをアッセイ緩​​衝液を追加し、25℃で5分間インキュベート℃、 </li><li>サンプルに、15mMのリブロースのビスリン酸20μLを追加し、反応は25℃で5-10分のために続行することができ℃の</li><li>反応を停止するには、100μLプロピオン酸（100％）（フィッシャー）を追加します。法人14℃を排気するために2000×gで1時間遠心</li><li> 3 mLのバイオセーフIIシンチレーションカウンティングカクテルを含むシンチレーションバイアルにサンプルの総量を転送します。シンチレーション計数による酸安定した最終製品のCPM（B.ヴィッテ、R. Tabita私信）を決定します。 </li><li> CHL基礎14上のRubisco活性率を計算します。 </li></ol> 5。代表的な結果我々は寒さに適応した光合成と南極Lに存在する混合栄養原生生物を分離する濃縮培養を利用しエイクボニー。太字の基礎培地（BBM）15、F/2-Siマリンミディアム16、17とBG11培地18：生物の多様性をキャプチャするために、我々は3つの成長のメディアタイプをテストしました。光顕微鏡による濃縮培養液の目視検査では、文化が光合成原生生物（ほとんどの細胞ではクロロフィル色素の存在によって示される）によって支配されたことを明らかにし、接種が取得されたサンプリング深さに応じて細胞の形態の多様性と抱いて培養に使用されるメディアの種類（ 図1）。 我々は、炭素固定ポテンシャルのプロキシとして酵素ルビスコによって触媒カルボキシラーゼ活性の最大レートを測定した。クロロフィルが豊富また、光合成原生生物のバイオマス（ 図2）の推定値としてモニターした。同じ温度/光領域（つまり、4°C/20モルm -2 s -1で ）、炭素固定ポテンシャルの下にあるすべての文化の育成にもかかわらず、と光合成バ​​イオマスの濃縮培養の間に劇的に変化した。文化4を示したF / 2培地（濃縮19、21、23）に濃縮されながら、最大のRubisco活性が、BBM（濃縮4および6）またはBG11（濃縮13および14）増殖培地のいずれかに成長して濃縮培養で観察された - 34倍低い最大カルボキシラーゼ活動へ。カルボキシラーゼ活性はクロロフィルaに基づいて発現していたように、これらの違いは、F / 2の文化ではバイオマスのレベルを下げることが原因ではありませんでした。また、Rubisco活性は、CHL濃度（;図2、挿入図はr = -0.023、P&gt; 0.1）と相関しなかった。他のすべての文化にかかわらず、ルビスコ酵素活性の（ 図2）比較的低いCHLを示しながら、6メートルと15メートル（濃縮4と5）から湖の水を接種したBBMの文化は、最高CHLレベルを持っていた。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3992/3992fig1.jpg" /> 図1。異なる生物の成長のために選択されている代表的な微生物真核生物濃縮培養。文化のアイデンティティーは、パネルの左下に記載されています。すべての画像は、1000Xの倍率で油浸を使用して生成された光顕微鏡写真を表しています。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3992/3992fig2.jpg" /> 図2南極微生物の真核生物濃縮培養のレベルボニー湖から分離され、様々な培地上に成長した潜在的な炭素固定能力と抽出クロロフィル。文化の詳細については、表1を参照して挿入図：クロロフィルとの間のピアソン相関南極微生物の真核生物濃縮培養における量と炭素固定の可能性。

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我々は、開示することは何もありません。

最近の分子生物学的研究は、環境3、19、20の範囲で単細胞真核生物の高い多様性を報告しているが、原生生物の生息地の全範囲にわたって分離株の不足のためにこれらの個々の種の機能的役割は、食物網の大部分です。不明。本研究では、比較的アンダー環境、永久に氷に覆われた南極の湖からの代謝多様性を示す微生物の真核生物種を濃縮する方法を説明してきました。ボニー湖で異なるサンプリング深さから豊かな文化が成長媒体に依存した差動炭素固定率を示した。たとえば、BBM、またはBG 11増殖培地に対し、F / 2に濃縮培養における低炭素固定の可能性はおそらく原生生物の多様性と代謝能力の違いを反映しています。 BBMの増殖培地は緑色藻類のために選択します（またはchlorophytes）と私たちの文化は緑色の藻類（ 図のモノカルチャーであるように見える1A、B）。これらの生物は、主にphotoautotrophyに依存することが知られています。一つは、ボニー湖から分離、その唯一のエネルギー源1として光の厳格な要件を有する、純粋な光独立栄養代謝を示す。対照的に、F / 2の増殖培地は、潜在的...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> BBM </td><td>シグマ</td><td> B5282 </td><td></td></tr><tr><td> BG11 </td><td>シグマ</td><td> C3061 </td><td></td></tr><tr><td> F / 2 </td><td>シグマ</td><td> G9903 </td><td></td></tr><tr><td> GF / Fフィルター、25ミリメートル</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 09-874-64 </td><td></td></tr><tr><td> GF / Fフィルター、47ミリメートル</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 09-874-71 </td><td></td></tr><tr><td>ポリエーテルスルホンフィルター、0.45μmの細孔、47ミリメートル</td><td>ポールライフサイエンス</td><td> 61854 </td><td></td></tr><tr><td>滅菌細胞培養フラスコ、25cm 2の </td><td>コー​​ニング</td><td> 430639 </td><td></td></tr><tr><td> Diurnalの成長室</td><td> VWR </td><td> 35960-076 </td><td></td></tr><tr><td>ジルコニア/シリカビーズ、0.1mmのdiamter </td><td> BioSpec製品</td><td> 11079101z </td><td></td></tr><tr><td>ミニビーズビーター</td><td> BioSpec製品</td><td> 3110BX </td><td></td></tr><tr><td>スクリューキャップマイクロ遠心チューブ（1.5μL） </td><td>米国サイエンティフィック</td><td> 1415-8700 </td><td></td></tr><tr><td>のNaH 14 CO 3 </td><td> ViTrax </td><td> VC 194 </td><td> -20°Cで400μLのアリコートで保つ</td></tr><tr><td> RuBP </td><td>シグマ</td><td> R0878-100mgの</td><td> 10mMのトリス - プロピオン酸（pH 6.5）に溶解し</td></tr></tbody></table>

化学的に成層南極湖と炭素固定ポテンシャルの評価から微生物真核生物濃縮文化の確立

Establishment of Microbial Eukaryotic Enrichment Cultures from a Chemically Stratified Antarctic Lake and Assessment of Carbon Fixation Potential

ボニー湖では、マクマードドライバレーに位置する多数の永久氷で覆われた湖の一つ、南極です。多年生の氷は、化学的に成層水柱を維持し、水の他の内陸の機関とは異なり、主に炭素とストリームからの栄養分の外部入力を防ぐことができます。生物相は、冬の間に1年間深刻な栄養欠乏、低温、極端な日陰、hypersalinity、24時間の暗闇を含む多くの環境ストレスにさらされている。これらの極端な環境条件が微生物2にほぼ独占的にボニー湖での生物相を制限します。 単細胞微生物の真核生物は（ &quot;原生生物&quot;と呼ばれる）水生食物網内のプライマリおよび第三の両方の役割を占有し、グローバルな物質循環3の重要なプレーヤーであり、ドライバレー湖沼における炭素の循環に重要な生態学的な役割を果たしている。 iを修正する乾燥した谷の水生食物網、原生生物のnorganic炭素（独立栄養）がorganotrophic生物の有機炭素4、2の主要な生産者である。 Phagotrophicまたはバクテリアや小さな原生生物を摂取することのできる従属栄養原生生物は、食物網5の上の捕食者としての役割を果たします。最後に、原生生物の人口の未知の割合は、複合混合栄養代謝6、7のことができます。原生生物の混合栄養では、餌の微生物のphagotrophic摂取と光合成能力を結合する能力が含まれます。混合栄養のこの形式は、一般的に取り込み、溶存炭素分子を含む細菌種の混合栄養代謝とは異なります。そこに非常に少数の原生生物の分離株は永久に氷に覆われた北極の湖から現在、この極端な環境における原生生物の多様性と生態の研究は、限られた8、4、9、10、5でした。シンプルなドライバレー湖沼の食物網における原生生物の代謝多様性の理解は、Rのモデルの開発に役立ちますグローバル炭素循環における原生生物のOLE。 私たちはボニー湖から潜在的に光合成と混合栄養原生生物を単離するために集積培養のアプローチを採用しています。水柱のサンプリング深さは一次生産の最大値と原生生物系統多様性4、11と同様に、原生生物の栄養のモードに影響を与える主要な非生物的要因の変動の位置に基づいて選ば ​​れた浅いサンプリング深さは主要な栄養素のために制限され、より深いサンプリング深さながら光可用性によって制限されます。さらに、湖の水のサンプルは、光合成生物の様々な成長を促進する増殖培地の複数の種類を添加した。 ルビスコは、カルビン·ベンソンBassham（CBB）サイクル、独立栄養生物は無機炭素を修正し、水生および陸生食物網12より高い栄養レベルの有機炭素を提供することによって主要な経路における律速段階を触媒する。本研究では、Weはボニー湖の濃縮培養における炭素固定の可能性と代謝の多様性のためのプロキシとして最大カルボキシラーゼ活性を監視するためのフィルタのサンプル13の変更された放射性同位体アッセイを適用した。

微生物の真核生物では、永久に氷に覆われた南極湖沼における光合成由来の炭素とトップ捕食種のソースの両方があります。このレポートでは、南極の湖、ボニー湖から代謝的に汎用性の高い微生物の真核細胞を分離するために集積培養のアプローチを説明し、リブロース-1,5 - bisphophateカルボキシラーゼオキシゲナーゼ（ルビスコ）活性のために放射性同位体アッセイを用いて無機炭素固定の可能性を評価しています。

ボニー湖は、南極のマクマードドライバレーに位置する、氷で恒久的に覆われた数多くの湖の一つである。この多年生の氷層により、...

本手順の目的は、南極のボニー湖から原生生物の濃縮培養物を調製し、代謝多様性の初期プロキシの一環として炭素固定量を測定することです。まず、原生生物および植物プランクトンの既知のピークに対応するボニー湖の湖水深度からサンプリングを行います。その後、湖水サンプルをさまざまな増殖培地に接種し、温度調節機能と照明を備えた培養装置内で4〜6週間培養します。培養物は必要に応じて4 °Cで輸送できます。次のステップは、濃縮培養物から粗細胞溶解液を抽出することです。この手順の最終ステップは、リブロース1,5-ビスリン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ（Rubisco）活性の放射性同位体アッセイを用いて、細胞溶解液中の炭素固定能を評価することです。最終的に、プロテリスト濃縮培養により、天然のプロテリストコミュニティにおける炭素固定能に多様性があることが示されました。この手法は、湖の微生物生態学に関する重要な疑問への回答に役立ちます。例えば、成層化した南極の湖における炭素循環の様々な段階における、微生物真核生物の役割などが挙げられます。後続世代の濃縮培養のための水柱サンプリングは頻繁に用いられる手法ですが、本手法には、予期せぬ問題が発生し得る極寒環境で運用するための変更が加えられています。私がこの手法を最初に考案したのは、天然の湖水サンプルを用いてRediscoアッセイを検証する方法を検討していた時でした。サンプリング地点が多くの研究者にとって馴染みのない環境にあるため、サンプリングの手順を具体的にイメージすることが困難であり、本手法の視覚的な実演は極めて重要です。サンプルは、南極のマクマードドライバレーにある、通年氷に覆われた数多くの湖の一つであるボニー湖から採取します。水柱のサンプリングを行う1日前に、サンプリング地点を選択し、準備してください。これにより、掘削や氷穴の融解による乱れの後、水柱の成層構造が再形成される時間を確保できます。GPSを用いてドリル地点の位置を特定し、水柱へのアクセス経路を確保してください。まず、4インチのJiffyフライトエクステンションとカッティングビットを取り付けたJiffy Iceオーガーを使用して、氷に穴を開けます。これは、穴の中でドリルが凍結するのを防ぐためです。水柱の頂点から約4〜6インチ上の位置で掘削を停止し、液状の水まで掘り進めないようにしてください。サンプリングのために、ドリルの穴を直径6インチから2フィートまで広げる必要があります。これは、加熱したポリエチレングリコールを銅管に通して循環させる熱海モデルホールメルターを用いて行われます。溶解には通常、水柱のサンプリング前日に最大18時間かかります。必要なすべての機器と試料保存容器がサンプリング現場に揃っていることを確認してください。サンプリング材料には、容量5〜10リットルのNICUボトル、深さ校正済みケーブルを備えたウィンチ、各サンプリング深度に対応する十分な数のサンプルボトル、メッセンジャー、およびサンプル輸送用のクーラーが含まれます。湖水のろ過をサンプリング当日に完了させる必要があるため、午前5時頃の早朝からサンプリングを開始してください。校正済みハンドウィンチに取り付けたキンサンプラーを使用してサンプリングを行います。本研究で指定された深さから、1〜5 Lの水サンプルを採取します。サンプリング深さは、アイスホールのPI対称水位から測定して6 m、15 m、および18 mとします。採取した湖水サンプルはクーラーで保管し、採取地点からフィールドラボまで運搬します。ATVに取り付けたソリを使用して、サンプルをフィールドラボで処理または安定化させます。サンプリング後、サンプルをフィールドラボに輸送した直後に、濃縮培養を開始してください。0.5〜1 Lの湖水を、孔径0.45 µmの47 mmフィルターで濃縮します。穏やかなろ過法を用いて、ポリエーテルスルホンフィルターでろ過します。自然コミュニティの多様性を調べたい場合は、2つ目のサンプルを直径 47 mm、孔径 0.45 µm のフィルターでろ過してください。ポリエーテルスルホンフィルターを液体窒素で急速凍結させます。各フィルターを、フィルターと同じ採取深さから採取したろ過済み湖水約 20 milliliters を含む 50 milliliter の滅菌ファルコンチューブに移します。異なる培養培地で濃縮するため、細胞懸濁液を25 cm四方の滅菌済み細胞培養フラスコに移します。各サンプリング深度について、複数の反復試料を準備します。各培養フラスコに、Bold Basal Medium、BG 11、およびF/2の各滅菌済み培養培地溶液を50 x分添加します。混合栄養不全生物の培養が必要な場合は、F2補充済み容器を2つ用意し、そのうちの1つの培養フラスコに滅菌済み米粒を2～3粒加えます。米国研究室への配送前に、温度制御機能付きの育成インキュベーター内で、低温かつ低照度条件下で少なくとも4週間培養してください。濃縮培養液を滅菌済みの50 mL Falconチューブに移します。配送依頼時には、「冷凍禁止」および「要冷蔵」の配送要件を指示してください。米国に到着後、各濃縮培養液5 mLを、125 mLフラスコに入れた45 mLの適切な増殖培地に移します。滅菌済みスポンジで蓋をした滅菌済みエルレンマイヤーフラスコを使用します。4 °Cに制御された環境成長チャンバー内で濃縮培養液を静置培養し、30日ごとに新鮮な培地へ継代します。細胞溶解物の抽出操作を開始するため、緩やかな真空吸引を用いて、5 Lの濃縮培養液を25 mmのWhatman GFFフィルターでろ過します。次に、滅菌済みの鋼製鋏を用いて、フィルターを4〜5つのセクションに切り分けます。その後、滅菌済みのピンセットを使用して、切り分けた断片を、0.1 mm径の溶液が5分の1量まで満たされた2 mLスクリューキャップチューブに移します。ジルコニア・シリカビーズ。チューブに 1.25 milliliters のフィルター抽出バッファーを加え、ミニビーズビーターを用いて速度設定 48 で 30 seconds 間細胞を破砕し、その後 1 minute 間氷上で静置します。サンプルの加熱を防ぐため、ビーズビーターによる処理と 1 minute 間の氷上インキュベーションを、さらに 2 回繰り返します。4°Cで3000×gで2分間、フィルターで遠心分離します。これにより、GFFフィルター繊維と細胞壁の残渣からなる緩いペレットが形成されます。このペレットから200 µLを分取し、氷冷した90%アセトン800 µLに浸漬させます。残りの上清を1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。分光光度計を用いて、波長664 nmおよび647 nmで抽出可能なクロロフィルAを測定します。残りの上清を4 °Cで15,000 ×gにて2分間遠心分離します。不溶性の細胞膜のペレットおよび残存するGFFフィルター繊維を避けて、Sを清潔な1.5 milliliterマイクロ遠心チューブに移します。この可溶性細胞溶解液を、次に説明するルビスカルボキシラーゼ活性測定に使用できます。この測定を開始するために、各可溶性溶解液125 microlitersを、氷上で冷却した1.5 screw capマイクロ遠心チューブに移します。陰性対照サンプルには、1.5 mLスクリューキャップ付きマイクロ遠心チューブに125 µLの可溶性ライセートを添加し、基質は添加しないでください。その後、すべてのサンプルおよび陰性対照について、2連の反応を行います。アッセイバッファー10 mLを調製し、新鮮な状態で氷上で冷却しておきます。すべてのサンプルおよび陰性対照に十分な量の分析バッファーを5 mLチューブに分注します。ここからのすべての手順は、ドラフトチャンバー内で行ってください。割り当てられたバッファーに$^{14}\text{C}$標識重曹（炭酸水素ナトリウム）を加え、バッファーを氷上で保持します。C 14を含むアッセイバッファーを10 µL取り出し、1 mLのアッセイバッファーで希釈し、反転させて混合する。希釈した混合液100 µLを、3 mLのBios Safe 2シンチレーションカクテルが入ったシンチレーションバイアルに加え、反転させて混合する。Beckman LS 6, 500カウンターを用いてC 14のカウント数を測定する。アッセイを続行する前に、シンチレーションカウントが18, 000 cpm以上であることを確認する。アッセイバッファーに十分な量のC 14標識炭酸水素ナトリウムを加えたら、反応チューブを25 °Cに設定したドライバスに移し、3〜5分間インキュベートします。次に、ライセートに100 µLのアッセイバッファーを加え、25 °Cで5分間インキュベートします。5分後、各サンプルにリブルロース-1,5-ビスリン酸を加え、25 °Cで5〜10分間反応させます。反応を停止させるため、100 µLの100%プロビオティック酸を添加し、2000 ×gで1時間遠心分離して、未結合のC 14を除去します。最後に、サンプルの全量を、3 mLのBios Safe-2シンチレーション計数カクテルを含むシンチレーションバイアルに移し、酸安定した1分間あたりの計数値を測定します。シンチレーション計数法による最終産物の測定。南極のボニー湖の3つの水深から、新規の低温適応性光合成および混合栄養プロティストを単離するために、富栄養化培養を用いた。より多様な生物を選別するため、Bold's Basal Medium (BBM) または BBMF-2、マリン培地、および BG 11 培地という様々な種類の増殖培地を使用した。この表に示す栄養塩濃度および光合成有効放射（PAR）は、試料採取時の条件を表しています。光顕微鏡による濃縮培養物の目視確認により、ほとんどの細胞にクロロフィル色素が存在することから、培養物は光合成原生生物が優占していることが明らかになりました。また、培養物には、接種源となった採取深度や培養に使用した培地に応じて、多様な細胞形態が含まれていました。炭素固定の指標として、rubis酵素によって触媒されるカルボキシラーゼ活性の最大速度を濃縮培養液中で測定しました。また、ここに示すように、光合成原生生物のバイオマスの推定値として、潜在的なクロロフィルa量もモニタリングしました。すべての培養物を同じ温度と光条件下で培養したにもかかわらず、炭素固定能および光合成生物バイオマスは、濃縮培養物間で劇的に異なっていた。最大の rubis O 活性は、BBM培地で増殖した濃縮培養物4および6と、BG 11培地で増殖した濃縮培養物13および14で観察された。対照的に、F2増殖培地で濃縮した培養物1921および23が示した最大カルボキシラーゼ活性は、4〜34倍低かった。カルボキシラーゼ活性をクロロフィルa量あたりで算出したため、これらの差はF two培養物のバイオマスレベルが低かったことに起因するものではありませんでした。さらに、ピアソン相関分析により、rubis co活性はクロロフィルa濃度と相関しないことが明らかになりました。BBM培養物には、水深6mおよび15mからの湖水が接種されました。濃縮のフォーラム5で最も高いクロロフィルAレベルが示されましたが、他のすべての培養液では、rubis酵素活性に関わらずクロロフィルaは相対的に低い値を示しました。習得すれば、湖のサンプリング技術の実施には約2時間を要します。採取するサンプル数によりますが、正しく実施すれば、カルボキシラーゼアッセイにも同様に2時間かかります。この手順に続いて、異栄養性酵素活性アッセイなどの他の手法を用いることで、異栄養生物がどの深さに存在するかといった追加の疑問に答えることができます。さて、このビデオを視聴したことで、湖のサンプルの採取、生産のための濃縮、およびrubisカルボキシラーゼ活性のアッセイ方法について十分に理解できたはずです。

establishment-microbial-eukaryotic-enrichment-cultures-from

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

出典: Villela, H. D. M. ほか生物修復のための微生物株の探査およびメタオーガニズム研究・保存のためのプロバイオティクス開発。 J. Vis. Exp.

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化学的に成層南極湖と炭素固定ポテンシャルの評価から微生物真核生物濃縮文化の確立

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