脂質中間相における膜タンパク質のハイスループット結晶化のためのロボットの使用

皆様、こんにちは。Membrane Structural and Functional Biology Groupへようこそ。私はMartin Cafferyです。今回は、in meso法またはリピッドキュービックフェーズ法を用いた、構造決定のための膜タンパク質の結晶化に関するJoVE記事シリーズの続きをお届けします。

最初の論文（JoVE 1 7 1 2）において、タンパク質を含むキュビック相の調製方法と、粘性と粘着性の高いmisa相を結晶化試験用のガラスサンドイッチプレートに手動で分注する方法について実証しました。本ビデオ論文では、in meso結晶化ロボットの使用方法について説明します。ロボットを用いることで、速度、正確性、精密な微量分注といった利点が得られるほか、暗所や低温下などの不便な条件下でも長時間の作業が可能になります。

ロボットを適切に使用することで、膜タンパク質の構造および機能研究の生産性を大幅に向上させることができます。このビデオ記事では、市販の3種類のロボットの使用方法を実演します。最初のロボットは膜構造機能生物学グループで開発されたもので、参考文献1に詳細が記載されています。

他の2つは最近利用可能になったため、完全性を期してここに含めています。ロボットによる結晶化試験を行うための結晶化プレートの準備は、まずガラスサンドイッチ結晶化プレートのベースプレートを準備することから始まります。ベースプレートの詳細については参照資料に記載されており、まずシリル化処理を行い、ウェルを形成するための穿孔されたダブルスティックスペーサーをプレートに貼り付ける必要があります。これらに必要な材料をここに示します。

これらには、ガラス製結晶化ベースプレート、穴あきダブルスティック・スペーサー、結晶化溶液、ローラーまたはブライヤー、ペーパーティシュ、および超純水を入れたビーカーが含まれます。プレートをベンチトップ上のペーパータオル上に配置します。結晶化溶液を数滴滴下し、その後ペーパーティシュを用いてプレート表面に均一に広げます。

プレートを水が入ったビーカーに完全に浸し、過剰なシラン化溶液を洗い流します。プレートをビーカーから取り出し、乾いたペーパータオルの上に置きます。シラン化された面を上に向け、露出した表面をペーパータオルで軽く拭いて乾燥させます。

次に、穿孔されたダブルスティックスペーサーの保護カバーを取り除き、ガラスプレートのシロリゼーション処理された表面にスペーサーを貼り付けます。スペーサーの左上隅と、それに隣接する2辺がベースプレートと一致するように、適切に配置することが重要です。ローラーまたはブライヤーを使用して、スペーサーをベースプレート上に平らに密着させ、両者の間に強固なシールを形成します。

なお、参照セクションに記載されている通り、穿孔スペーサーを備えたサイロ化プレートは市販されています。結晶化ベースプレートを準備した後、次にin mesoロボットのセットアップと使用方法について説明します。以下に述べるように、ここでは3台のin mesoロボットを使用した例を示します。

提示されたすべての例において、ロボットは20 °Cに設定された温度管理室に設置して使用しています。このビデオで最初に実演されるmeso robot oneは、PIの研究室で開発され、現在は市販されています。詳細は参考文献セクションで確認できます。

ロボットを用いて結晶化スクリーニングをセットアップするために必要な材料および器具をここに示します。これらには、実験ノート、Jo of Article 1 7 1 2 の記載通りに調製されハミルトンシリンジに充填されたタンパク質含有溶液、スペーサー付きのシリコナイズドベースプレートと対応するカバーガラス、水ボトルおよびティッシュ、そしてin misoロボットが含まれます。

最初のビューは、デッキが空の状態のロボットです。次のビューは、加湿器パークステーション、結晶化ベースプレート、および沈殿剤溶液を含むディープウェルブロックを装備したロボットです。まず、ロボットのデッキにベースプレートを配置することからセットアップを開始します。

ベースプレートを合わせるためのウェル位置が明確に記された、専用のプラットフォームが用意されています。識別のため、プレートには明確にラベルを貼付してください。沈殿剤溶液を含む96ウェルブロックは、ロボットデッキ上の結晶化プレートに隣接した専用プラットフォームに固定されます。

プラスチック製のシーリングキャップを慎重に剥がして、ブロックを開封します。加湿器からの湿度流が、ロボットのデッキ上にあるベースプレートの上および横を流れるように向けます。メーカーの指示に従ってロボットを初期化します。

正確なプロトコルは時間の経過とともに変更されるため、ここでは詳細なデモンストレーションは行いません。基本的に、初期化中に行われるのは、ロボットのメザ（meza）分注アームに対して、x、Y、Zの3つの直交方向の参照位置を提供することです。次に、分注針を備えたハミルトンシリンジに入ったタンパク質含有メザ相をロボットのアーム1に取り付けます。メザ相とシリンジの準備に関する詳細は、JoVEの記事1712および参考文献1に記載されています。続いて、分注シリンジの針先を、結晶化プレートの左上隅にある最上段のウェルの底面および中心に合わせます。これは、最初の作業として、ウェル識別子A1の底面に合わせることに相当します。

これは、分注アームの高さ（Z座標）を調整し、ニードルチップがウェルの底にどれだけ近づいているかを確認することで行います。チップがウェルの底にちょうど触れているかどうかは、分注アームの高さをごくわずかに調整しながら、プラットフォーム上のプレートを手で左右に動かすことで判断できます。チップがプレートに接触した時の分注アームのZ座標をコンピューターに入力します。分注は、この基準Z位置（ベースプレートの表面に対応）から数µm上の位置でニードルチップが動作するようにプログラムされます。次にロボットを起動し、ユーザーによる一連の指示に従って、ニードルチップをウェルA1の中心に配置します。

チップが中心に位置する分注アームの参照XY座標は、ロボットを制御するコンピューターに保存されています。この座標は、プレート上の残りのウェルの中心を定義するために使用されます。コンピューターでこれらの参照座標を設定した後、分注アームに開始位置に戻るよう指示し、シリンジのプライミングを行います。

分注用シリンジのプライミングを行う必要があります。これは、新鮮なmeaseを分注針に満たし、プレートの最初のウェルに規定量のmeaseが確実に供給されるようにするために行われます。ロボットを動作させるプログラム内には、プライミング用のコマンドが用意されています。

これにより、ユーザーの制御下でシリンジ内のプランジャーを段階的に前進させることができます。この操作の間、針先を確認し、気泡が押し出されるまで観察します。気泡が出たら、ティッシュで拭き取ります。これで、ロボットを動作させるためのプライミング工程が完了します。

ロボットは自動モードでの実行準備が整いました。ロボットXAPプログラムがフラッシングステップを開始し、ロボットの第2アームにある沈殿剤分注チップの洗浄および、ディープウェルブロックからの沈殿剤溶液の吸引準備が行われます。ロボットの分注機能を起動すると、まずタンパク質を含む溶液を8ウェルずつ順次ロードし、その後、各分注の間に沈殿剤溶液をロードします。溶液分注アームはパーキングポジションに戻り、チップ先端の溶液の乾燥を防ぐため、針先が湿ったスポンジに配置されます。

メンブレン構造・機能生物学グループで実施される結晶化試験において、最も一般的に使用される値は、溶液50 nanolitersと沈殿剤溶液800 nanolitersです。このデモンストレーションでロボットを動作させているプログラムは、2本のアームが同時に動作するように設定されています。

このようにして、5分以内に96ウェルプレートへの標本と沈殿剤の分注を完了させることができます。プレートへの充填が完了し、ロボットアームがパークポジションに戻った直後に、プレートをロボットのデッキから取り出し、平らで安定した面に置きます。

カバーガラスを、スペーサーの上部粘着面に接触するようにベースプレートの上に静かに置きます。96ウェルすべてが完全に覆われていること、カバーガラスがベースプレートに対して直角に配置されていること、およびカバーガラスがベースプレートの範囲からはみ出していないことを確認することが重要です。ローラーまたはブレイヤーを使用して、カバーガラスとスペーサーの間を密に均一に密閉します。

この段階でプレートを点検し、セットアップが適切に行われたかを確認してください。フライパンの目玉焼きのような外観になっているかを確認します。各ウェルにおいて、卵の黄身に相当する部分がmeza相になります。

卵白が沈殿溶液であり、パンの縁が結晶化の境界となります。理想的には、これら3つが同心円状になります。これでプレートの準備が整ったので、結晶成長のために温度管理された保管エリアに配置します。

これ以上プレートをセットアップする必要がない場合は、沈殿剤ブロックをロボットのデッキから取り外し、適切に密閉して保管場所に戻してください。溶液が入ったシリンジをロボットの分注アームから取り外し、分注針やフェルールを含む各部品を分解します。次回のMeso robot two mosquito LCPでの使用に備え、メタノールで注意深く洗浄し、乾燥させてください。

次のビデオクリップでは、in meso結晶化試験のセットアップに使用できるmosquito LCPロボットを紹介します。この装置には、本記事で前述したのと同様のメゾ相分注システムが組み込まれています。ただし、ロボット1では、沈殿剤の分注に使い捨てチップが使用されます。

装置本体がここに示されています。これには、結晶化プレートと沈殿剤ブロックを設置するためのデッキと、湿度を制御するための窓付きチャンバーが含まれています。この図では、湿度チャンバーの窓が開いており、分注チップを装着したスプール、分注アーム、および母液分注針の位置を特定するためのレーザーベースのセンサーが表示されています。

結晶化プレートを載せるための高くなったプラットフォームと、沈殿剤スクリーンブロックを保持するための低くなったプラットフォームがあります。このシーケンスでは、装置の電源を入れた際にロボットが初期化シーケンスを実行します。プログラミングソフトウェアを使用して、特定の結晶化プレートおよび沈殿剤ブロックでの動作に合わせて装置をセットアップし、規定のシーケンスで設定された量の中身と沈殿剤を分注します。

そのような詳細はメーカーによって提供されており、ここでは記載しません。ロボットを用いた結晶化プレートのセットアップは、次のように開始します。上述の「in meso robot one」およびJoVE 1 7 1 2の説明に従い、タンパク質を含むメニスカスで満たされた針付きのHamiltonシリンジを準備します。シリンジをロボットの分注アームの下の所定の位置に固定します。

デッキに取り付けられたレーザーセンサーを使用して、分注シリンジの針のX座標およびy座標を設定します。これは、結晶化プレートの各ウェルの中央にmeaseを正確に分注するために不可欠な工程です。コントロールパネルのボタンを押すと、シリンジが準備され、針先からmeaseが排出されます。

その後、ロボットを用いてウェルに分注し、結晶化プレートをロボットのデッキに設置する準備として、はみ出した溶液をティッシュで拭き取ります。プレートを固定するため、プラットフォームの表面を数滴の水で湿らせます。キャピラリーを用いてプレートから保護カバーを取り外し、密着性を高めるためにプレートをプラットフォーム上にしっかりと設置します。

プラットフォーム上には3つの基準マークがあり、3つのコーナーウェルがその上に中心合わせされることで、分注ニードルチップに対するプレートの正確な位置決めが保証されます。これで、装置はセットアップサイクルを開始できる状態になります。まず2回目のプライミングステップが行われ、新鮮なmeaseをプレートにロードする直前に、少量のガラスプレート上にMeaseが分注されます。このシーケンスでは、ロボットがまずプレート上の8つのウェルからなる垂直列にmeaseをロードし、次に使い捨てチップを使用してmeaseボラスの上に沈殿剤溶液を分注する様子が示されています。

この工程をプレートの長さに沿って、すべてのウェルが満たされるまで11回繰り返します。全工程の完了まで約5分かかります。このビデオでは、各ウェルに50 nanolitersのMeaseと800 nanolitersの沈殿剤溶液を分注しました。

充填されたプレートを、ベンチ上に配置されたロボットのプラットフォームから取り出します。カバーガラスを装着し、前述のMeso Robot 1の手順に従ってプレートを封止します。適切にラベルを貼付したプレートを、Meso Robot 3（Griffin LCP）の温度制御環境内に設置し、結晶成長させます。

この最後のビデオクリップでは、in meso結晶化試験のセットアップに使用されているGriffin LCPロボットを示しています。Griffinには、前述のロボット1と同様のメッシュフェーズ分注システムが組み込まれています。ただし、このケースでは、96種類すべての沈殿剤溶液が同時に分注されます。

装置本体がここに示されています。これには、結晶化プレートと沈殿剤ブロックが配置されるデッキ、分注アーム、およびPhoenix 96チップヘッドが含まれています。沈殿剤溶液を分注する際のロボットの動作が、この最後のビデオシーケンスに示されています。

まず、96チャンネルチップヘッドに沈殿剤溶液を吸引します。粘性の高い沈殿剤の吸引を容易にするため、ユーザー定義のディレイ時間を設定できます。その後、MEA相が96個のウェルに順次分注され、この工程には約1分かかります。

最後に、96チャンネルチップヘッドを用いて、結晶化ウェル内のMEA相ボルス上に96種類すべての沈殿剤溶液を同時に分注します。プレートへの充填プロセス全体は2分で完了します。充填後のプレートをロボットのデッキから取り出し、カバーガラスで密封して、結晶成長させるため温度制御条件下で保存します。

高分子結晶構造解析による構造決定の全工程における次のステップは、結晶の回収とクライオ冷却、およびそれらからのX線回折データの記録と処理です。これらのトピックについては、本シリーズの別の記事で詳しく解説しています。