Name: 脂質中間相における膜タンパク質のハイスループット結晶化のためのロボットの使用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 20 min 21 s
Description: 学ぶ脂質中間相を用いた膜タンパク質のロボット結晶化法。3種類の自動化システムを使い、高速・高精度な結晶化試験を実現します。構造生物学研究の生産性向上に貢献します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

この仕事に貢献し、ほとんどが膜構造·機能研究グループからのもので、過去と現在の両方のメンバーが多くの人々があります。すべての我々の暖かい感謝と感謝の意を。この作品は、アイルランド科学財団（07/IN.1/B1836）、国立衛生研究所（GM75915、P50GM073210とU54GM094599）、およびFP7 COSTのアクションCM0902からの助成金によって部分的にサポートされていました。

<ol><li>Caffrey, M., Porter, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+membrane+proteins+for+structure+determination+using+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Crystallizing membrane proteins for structure determination using lipidic mesophases.</a> J. Vis. Exp. (45), e1712(2010).</li>
<li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano-volume+plates+with+excellent+optical+properties+for+fast%2C+inexpensive+crystallization+screening+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins.</a> J. Appl. Crystallogr. 36, 1372-1377 (2003).</li>
<li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+membrane+proteins+using+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases.</a> Nat. Protocols. 4, 706-731 (2009).</li>
<li>Liu, W., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+of+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases.</a> J. Vis. Exp. (49), e2501(2011).</li>
<li>Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robotic+system+for+crystallizing+membrane+and+soluble+proteins+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D+Bio.l+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases.</a> Acta Crystallogr. D Bio.l Crystallogr. 60, 1795-1807 (2004).</li>
<li>Peddi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+automated+system+for+crystallizing+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.+Autom.+Sci.+Eng%22%5BJournal%5D)">High-throughput automated system for crystallizing membrane proteins in lipidic mesophases.</a> IEEE Trans. Autom. Sci. Eng. 4, 129-140 (2007).</li>
<li>Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+mechanical+mixer+for+small+viscous+lipid-containing+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Phys.+Lipids%22%5BJournal%5D)">A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples.</a> Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).</li>
<li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+membrane+proteins+for+structure-function+studies+using+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">Crystallizing membrane proteins for structure-function studies using lipidic mesophases.</a> Biochem. Soc. Trans. 39, 725-732 (2011).</li>
<li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+membrane+proteins+for+structure+determination%3A+use+of+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Crystallizing membrane proteins for structure determination: use of lipidic mesophases.</a> Annu. Rev. Biophys. 38, 29-51 (2009).</li>
<li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Membrane protein crystallization.</a> J. Struct. Biol. 142, 108-132 (2003).</li>
<li>Gushchin, I., Reshetnyak, A., Borshchevskiy, V., Ishchenko, A., Round, E., Grudinin, S., Engelhard, M., Buldt, G., Gordeliy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+State+of+Sensory+Rhodopsin+II%3A+Structural+Determinants+for+Signal+Transfer+and+Proton+Pumping%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Active State of Sensory Rhodopsin II: Structural Determinants for Signal Transfer and Proton Pumping.</a> J. Mol. Biol. 412, 591-600 (2011).</li>
<li>Jordan, P., Fromme, P., Witt, H. T., Klukas, O., Saenger, W., Krauss, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structure+of+cyanobacterial+photosystem+I+at+2.5+angstrom+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structure of cyanobacterial photosystem I at 2.5 angstrom resolution.</a> Nature. 411, 909-917 (2001).</li>
<li>Grawert, T., Span, I., Eisenreich, W., Rohdich, F., Eppinger, J., Bacher, A., Groll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+reaction+mechanism+of+IspH+protein+by+x-ray+structure+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Probing the reaction mechanism of IspH protein by x-ray structure analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 1077-1081 (2010).</li>
<li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picolitre-scale+crystallization+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Picolitre-scale crystallization of membrane proteins.</a> J. Appl. Crystallogr. 39, 604-606 (2006).</li>
<li>Li, D., Boland, C., Aragao, D., Walsh, K., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harvesting+and+cryo-cooling+crystals+of+membrane+proteins+grown+in+lipidic+mesophases+for+structure+determination+by+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Harvesting and cryo-cooling crystals of membrane proteins grown in lipidic mesophases for structure determination by macromolecular crystallography.</a> J. Vis. Exp. (67), e4001(2012).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

このビデオの記事では、我々は自動的にタンパク質を含んだ脂質メソフェーズを用いて、96ウェルガラスサンドイッチプレートにメソ結晶化試験でセットアップするロボットを使用する方法を実証した。本研究で使用したロボットは特別にもともと7に記載されているように 、粘性及び粘着性メソフェーズのナノリットルボリュームの正確で再現性の送達のための肯定的な変位のガラスシリンジを含むように設計されていました。 正確さと精度は、ロボットの重要な機能です。しかし、これらの特徴は、ロボットの性能が評価され、キャリブレーションが実行される程度と規則性と同じくらい良いです。それは個々のプレートが設定されている間、ロボットの性能が評価されるべきことは言うまでもない。それはロボットが完璧に機能し、自動で実行するロボットを残していると仮定することは適切ではない。気配りと観察オペレータがposにあるべきitionは音か何かが正常に動作していないと、すぐにそれを修正するために外観によって注意を促す必要があります。 プレートがシールされているとすぐに、それが結晶化試験のために離れて置かれる前に加えて、 各プレートを慎重によく内容の均一性のために目の検査を受けなければならない 。これは、ほんの数秒で実行するようにする必要がありますし、次のプレートをロードしている間に行うことができます。気付かは、例えば、特定のウェルが正しく入力されていないことは確か沈殿分配チップが誤動作しているという事実を強調することができる。メソフェーズの配信は不定期であると見なければならない、関連する障害のある項目は直ちに修正される必要があるでしょう。これらの問題を指摘し、セットの間の関連の調整を行うことにより、貴重な脂質や膜タンパク質など、時間と材料の節約になります。イメージャは、結晶成長、正確さと精度を追跡するために使用されている場合は、撮像中に監視することができます。ドロップまたはボーラスを持つ例えば、体系的な問題イメージャによって場所は、何かが右ではなく、プロトコルのどこか上流の是正措置が必要であることを示す。 信頼性の高い性能故にロボットの利益のために、定期的なスケジュールで校正され、必要に応じなければなりません。校正は、沈殿剤およびウェル内ボーラスと沈殿配置と同様に配信メソフェーズのボリュームを含める必要があります。明らかに、可能な限りキャリブレーションは品質管理運動の対象期間内に実施された試験で使用されるものと同様のボリュームと材料を使用して行われる必要があります。 キャリブレーションと同様に重要なのは、あまりにも在庫がロボットの部品や消耗品の適切な供給を持っているそうです。破局や予期しない障害、閉塞とクラッシュが発生するとを行うことができます。このような場合には、使用可能な交換用沈殿配信先端を有する、例えば、非常に貴重な膜タンパク質調製物は、それが必要ととして使用されていることを意味するかもしれません無駄にされていません。 ロボットの利点のいくつかは、それが本質的に連続的に動作すること、それは苦しんでいないか、または疲労 &quot;が訴える&quot;という事実を含む。ロボットはまた、暗闇の中でのように、制御された照明や環境条件の下で、温度の極端で、人に優しいとは見なされません条件の下で使用することができます。この記事で紹介ロボットはすべての〜20℃周囲条件下で使用されましたしかし、タンパク質および非周囲温度、制御された光11,12及び酸化剤または還元環境13を必要とするプロジェクトがあります。結晶化ロボットが使用されている場合、これらのすべては、比較的容易に、用の仕出し料理することができます。 以前Joveのビデオ記事ではメソメソッド内で結晶化試験は手動で1に設定されている方法を紹介しました。手で確実に分配することができる中間相の最小体積はb限られているyの試験を設定する人の視力と着実利き手。我々の経験では、100 nlの限り低くメソフェーズのボリュームが容易に処理されます。我々は、デフォルトのボリュームが40 NL約手動ディスペンス1研究室を知っている。しかし、かなり小さいボリュームがロボットを使って行うことができます。これとは別に、我々は550ピ ​​コリットルという低メソフェーズボリュームがロボット14分配することができることが示されている。その作品からは、ロボットによる更なる小型化が実施されれば、結晶化実験を行うのに必要な貴重な膜タンパク質の量の大幅な削減につながる、これが可能であることは明らかでした。 このビデオの記事では、3種類の市販のロボットは脂質中間相を用いた高スループット膜タンパク質の結晶化を実証するために使用されていました。 JOVE 1712 1に記載したように、これらの最初のものは、手動で試験を設定する私たちの経験に基づいて、MS＆FBのグループで開発されました。これは楽器ですリーメントは我々に最も精通していると、現在の記事の大半は、その使用に専念しています。他の二つのロボットは、記事が書かれた、関連する映像が、完全性の利益のためにここに含まれている時に、MS＆FBのグループのデモにあった。すべての3つのロボットは非常に同じメソフェーズ分配システム、容積ガラスシリンジ5,7となっている本質的な機能を使用します。彼らは、沈殿剤デリバリーに関して最も大きく異なります。ロボット1と2は、8ウェル、同時に結晶化プレート上の単一の列に同時に沈殿剤を分配することができます。これとは対照的に、ロボット3は、単一のアクションですべての96沈殿ソリューションを分配します。ロボット2は使い捨ての沈殿剤調剤のヒントを持つ唯一の楽器です。特定のアプリケーションに依存する別の楽器に関連付けられている長所と短所がありますが、これらはここで詳しく説明されません。すべての3つの作業とは、私の結晶が得られたことを言えば十分メソメソッド内でmbraneタンパク質。 高分子結晶学による構造決定の全体的なプロセスの次のステップは収穫にとクライオクール結晶にこのビデオの記事で説明されるように設定するプレートから、レコード、それらからプロセスX線回折にしています。これらのトピックについては、このシリーズ1,15で個別Joveの記事で説明されています。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コンポーネント </td></tr><tr><td> Brayer（ローラ） </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 50820937 </td><td>ツール</td></tr><tr><td>ガスタイトシリンジ</td><td>ハミルトン</td><td> 81030 </td><td>ツール</td></tr><tr><td>カバーガラス</td><td> Marienfeld </td><td> 01029990911 </td><td>使い捨て</td></tr><tr><td>ガラス板</td><td> Marienfeld </td><td> 1527127092 </td><td>使い捨て</td></tr><tr><td>グリフォンLCPのロボット</td><td>アート·ロビンス</td><td> NA </td><td>ツール</td></tr><tr><td> メソロボットで </td><td> Anachem /ギルソン</td><td> NA </td><td>ツール</td></tr><tr><td>実験ノート</td><td>さまざまな</td><td> NA </td><td>ツール</td></tr><tr><td>蚊LCPのロボット</td><td> TTP LABTECH </td><td> NA </td><td>ツール</td></tr><tr><td>あき両面スペーサテープ</td><td>サンダース株式会社（穴パンチ） </td><td>カスタマイズ</td><td>使い捨て</td></tr><tr><td>沈殿ソリューション</td><td>さまざまな</td><td>さまざまな</td><td>試薬</td></tr><tr><td>精製水</td><td>ミリポア</td><td> NA </td><td>試薬</td></tr><tr><td>雨 - X </td><td>シェルカーケア</td><td> 80199200 </td><td>試薬</td></tr><tr><td>シリンジのヒント</td><td>ハミルトン</td><td> 7770-020（ゲージ22） </td><td>ツール</td></tr><tr><td>組織</td><td>さまざまな</td><td>さまざまな</td><td>使い捨て</td></tr><tr><td>水筒</td><td>さまざまな</td><td> NA </td><td>試薬</td></tr></tbody></table>

脂質中間相における膜タンパク質のハイスループット結晶化のためのロボットの使用

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

膜タンパク質の構造と機能の研究は大いに高分子X線結晶構造解析（MX）を介して提供タイプの使用可能な高解像度の3次元構造を持っていることから恩恵を受ける。 MXの必須成分は、理想的には回折品質結晶の安定供給である。膜タンパク質の結晶化のメソまたは脂質立方相（LCP）メソッドの中で膜タンパク質を結晶化させるためのいくつかの方法の一つです。これは、結晶を成長するための共連続メソフェーズを利用しています。方法としては、後半のいくつかの壮観な成功を収めており、現在、それを使うことに興味を持って多くの研究グループと注目を集めている。メソッドに関連付けられている課題の一つは、ホスティングメソフェーズが厚い歯磨き粉を彷彿とさせる、非常に粘性と粘着性であるということです。このように、結晶化ウェルに少量で再現可能な方法でそれを手動で調剤することはスキル、忍耐と着実に手を必要とします。柱を行うためのプロトコル膜の構造·機能生物学（MS＆FB）グループ1-3に開発されたstの。方法を説明するJoveのビデオの記事が入手できる1,4です。 メソ試験で設定するための手動のアプローチは、このような結晶の最適化および誘導体化などの特殊なアプリケーションとの明確な利点を持っています。しかしそれは低スループット法であることに苦しむん。ここでは、ロボットメソ結晶化試験で行うためのプロトコルを示しています。ロボットは、スピード、正確性、精度、小型化、還元雰囲気中または低温下、または高温下で、そのような暗闇の中でのように敵対的な条件とみなすことができるもので、長期間にわたって継続的に働くことができるという利点があります。 メソロボットで 、適切に使用すれば、大幅で遅いステップの一つである結晶化を促進することにより、膜タンパク質構造の生 ​​産性と機能の研究を向上させることができます全体的な構造決定のパイプライン。 このビデオの記事では、我々は、 メソ crystallogenesis 内に不可欠粘性及び粘着性メソフェーズを免ずることができる3つの市販のロボットの使用例を示します。最初のロボットは、MS＆FBのグループ5,6で開発されました。他の二つは、最近利用可能になっていると、完全を期すためにここに含まれています。 この記事で取り上げたプロトコルの概要を図1に示されている。すべての操作は室温（約20℃）周囲条件下で行った。

本明細書では、高分子のX線結晶構造解析を用いた構造決定に使用するための脂質中間相における膜タンパク質のハイスループット結晶化ロボットのアプローチを説明しています。メソッドに不可欠な粘性及び粘着性のタンパク質を含んだ中間相を扱うことができる3つのロボットが導入される。

膜タンパク質の構造・機能研究は、...によって提供されるような高分解能の3次元構造が得られることで大きな恩恵を受けます。

皆様、こんにちは。Membrane Structural and Functional Biology Groupへようこそ。私はMartin Cafferyです。今回は、in meso法またはリピッドキュービックフェーズ法を用いた、構造決定のための膜タンパク質の結晶化に関するJoVE記事シリーズの続きをお届けします。最初の論文（JoVE 1 7 1 2）において、タンパク質を含むキュビック相の調製方法と、粘性と粘着性の高いmisa相を結晶化試験用のガラスサンドイッチプレートに手動で分注する方法について実証しました。本ビデオ論文では、in meso結晶化ロボットの使用方法について説明します。ロボットを用いることで、速度、正確性、精密な微量分注といった利点が得られるほか、暗所や低温下などの不便な条件下でも長時間の作業が可能になります。ロボットを適切に使用することで、膜タンパク質の構造および機能研究の生産性を大幅に向上させることができます。このビデオ記事では、市販の3種類のロボットの使用方法を実演します。最初のロボットは膜構造機能生物学グループで開発されたもので、参考文献1に詳細が記載されています。他の2つは最近利用可能になったため、完全性を期してここに含めています。ロボットによる結晶化試験を行うための結晶化プレートの準備は、まずガラスサンドイッチ結晶化プレートのベースプレートを準備することから始まります。ベースプレートの詳細については参照資料に記載されており、まずシリル化処理を行い、ウェルを形成するための穿孔されたダブルスティックスペーサーをプレートに貼り付ける必要があります。これらに必要な材料をここに示します。これらには、ガラス製結晶化ベースプレート、穴あきダブルスティック・スペーサー、結晶化溶液、ローラーまたはブライヤー、ペーパーティシュ、および超純水を入れたビーカーが含まれます。プレートをベンチトップ上のペーパータオル上に配置します。結晶化溶液を数滴滴下し、その後ペーパーティシュを用いてプレート表面に均一に広げます。プレートを水が入ったビーカーに完全に浸し、過剰なシラン化溶液を洗い流します。プレートをビーカーから取り出し、乾いたペーパータオルの上に置きます。シラン化された面を上に向け、露出した表面をペーパータオルで軽く拭いて乾燥させます。次に、穿孔されたダブルスティックスペーサーの保護カバーを取り除き、ガラスプレートのシロリゼーション処理された表面にスペーサーを貼り付けます。スペーサーの左上隅と、それに隣接する2辺がベースプレートと一致するように、適切に配置することが重要です。ローラーまたはブライヤーを使用して、スペーサーをベースプレート上に平らに密着させ、両者の間に強固なシールを形成します。なお、参照セクションに記載されている通り、穿孔スペーサーを備えたサイロ化プレートは市販されています。結晶化ベースプレートを準備した後、次にin mesoロボットのセットアップと使用方法について説明します。以下に述べるように、ここでは3台のin mesoロボットを使用した例を示します。提示されたすべての例において、ロボットは20 °Cに設定された温度管理室に設置して使用しています。このビデオで最初に実演されるmeso robot oneは、PIの研究室で開発され、現在は市販されています。詳細は参考文献セクションで確認できます。ロボットを用いて結晶化スクリーニングをセットアップするために必要な材料および器具をここに示します。これらには、実験ノート、Jo of Article 1 7 1 2 の記載通りに調製されハミルトンシリンジに充填されたタンパク質含有溶液、スペーサー付きのシリコナイズドベースプレートと対応するカバーガラス、水ボトルおよびティッシュ、そしてin misoロボットが含まれます。最初のビューは、デッキが空の状態のロボットです。次のビューは、加湿器パークステーション、結晶化ベースプレート、および沈殿剤溶液を含むディープウェルブロックを装備したロボットです。まず、ロボットのデッキにベースプレートを配置することからセットアップを開始します。ベースプレートを合わせるためのウェル位置が明確に記された、専用のプラットフォームが用意されています。識別のため、プレートには明確にラベルを貼付してください。沈殿剤溶液を含む96ウェルブロックは、ロボットデッキ上の結晶化プレートに隣接した専用プラットフォームに固定されます。プラスチック製のシーリングキャップを慎重に剥がして、ブロックを開封します。加湿器からの湿度流が、ロボットのデッキ上にあるベースプレートの上および横を流れるように向けます。メーカーの指示に従ってロボットを初期化します。正確なプロトコルは時間の経過とともに変更されるため、ここでは詳細なデモンストレーションは行いません。基本的に、初期化中に行われるのは、ロボットのメザ（meza）分注アームに対して、x、Y、Zの3つの直交方向の参照位置を提供することです。次に、分注針を備えたハミルトンシリンジに入ったタンパク質含有メザ相をロボットのアーム1に取り付けます。メザ相とシリンジの準備に関する詳細は、JoVEの記事1712および参考文献1に記載されています。続いて、分注シリンジの針先を、結晶化プレートの左上隅にある最上段のウェルの底面および中心に合わせます。これは、最初の作業として、ウェル識別子A1の底面に合わせることに相当します。これは、分注アームの高さ（Z座標）を調整し、ニードルチップがウェルの底にどれだけ近づいているかを確認することで行います。チップがウェルの底にちょうど触れているかどうかは、分注アームの高さをごくわずかに調整しながら、プラットフォーム上のプレートを手で左右に動かすことで判断できます。チップがプレートに接触した時の分注アームのZ座標をコンピューターに入力します。分注は、この基準Z位置（ベースプレートの表面に対応）から数µm上の位置でニードルチップが動作するようにプログラムされます。次にロボットを起動し、ユーザーによる一連の指示に従って、ニードルチップをウェルA1の中心に配置します。チップが中心に位置する分注アームの参照XY座標は、ロボットを制御するコンピューターに保存されています。この座標は、プレート上の残りのウェルの中心を定義するために使用されます。コンピューターでこれらの参照座標を設定した後、分注アームに開始位置に戻るよう指示し、シリンジのプライミングを行います。分注用シリンジのプライミングを行う必要があります。これは、新鮮なmeaseを分注針に満たし、プレートの最初のウェルに規定量のmeaseが確実に供給されるようにするために行われます。ロボットを動作させるプログラム内には、プライミング用のコマンドが用意されています。これにより、ユーザーの制御下でシリンジ内のプランジャーを段階的に前進させることができます。この操作の間、針先を確認し、気泡が押し出されるまで観察します。気泡が出たら、ティッシュで拭き取ります。これで、ロボットを動作させるためのプライミング工程が完了します。ロボットは自動モードでの実行準備が整いました。ロボットXAPプログラムがフラッシングステップを開始し、ロボットの第2アームにある沈殿剤分注チップの洗浄および、ディープウェルブロックからの沈殿剤溶液の吸引準備が行われます。ロボットの分注機能を起動すると、まずタンパク質を含む溶液を8ウェルずつ順次ロードし、その後、各分注の間に沈殿剤溶液をロードします。溶液分注アームはパーキングポジションに戻り、チップ先端の溶液の乾燥を防ぐため、針先が湿ったスポンジに配置されます。メンブレン構造・機能生物学グループで実施される結晶化試験において、最も一般的に使用される値は、溶液50 nanolitersと沈殿剤溶液800 nanolitersです。このデモンストレーションでロボットを動作させているプログラムは、2本のアームが同時に動作するように設定されています。このようにして、5分以内に96ウェルプレートへの標本と沈殿剤の分注を完了させることができます。プレートへの充填が完了し、ロボットアームがパークポジションに戻った直後に、プレートをロボットのデッキから取り出し、平らで安定した面に置きます。カバーガラスを、スペーサーの上部粘着面に接触するようにベースプレートの上に静かに置きます。96ウェルすべてが完全に覆われていること、カバーガラスがベースプレートに対して直角に配置されていること、およびカバーガラスがベースプレートの範囲からはみ出していないことを確認することが重要です。ローラーまたはブレイヤーを使用して、カバーガラスとスペーサーの間を密に均一に密閉します。この段階でプレートを点検し、セットアップが適切に行われたかを確認してください。フライパンの目玉焼きのような外観になっているかを確認します。各ウェルにおいて、卵の黄身に相当する部分がmeza相になります。卵白が沈殿溶液であり、パンの縁が結晶化の境界となります。理想的には、これら3つが同心円状になります。これでプレートの準備が整ったので、結晶成長のために温度管理された保管エリアに配置します。これ以上プレートをセットアップする必要がない場合は、沈殿剤ブロックをロボットのデッキから取り外し、適切に密閉して保管場所に戻してください。溶液が入ったシリンジをロボットの分注アームから取り外し、分注針やフェルールを含む各部品を分解します。次回のMeso robot two mosquito LCPでの使用に備え、メタノールで注意深く洗浄し、乾燥させてください。次のビデオクリップでは、in meso結晶化試験のセットアップに使用できるmosquito LCPロボットを紹介します。この装置には、本記事で前述したのと同様のメゾ相分注システムが組み込まれています。ただし、ロボット1では、沈殿剤の分注に使い捨てチップが使用されます。装置本体がここに示されています。これには、結晶化プレートと沈殿剤ブロックを設置するためのデッキと、湿度を制御するための窓付きチャンバーが含まれています。この図では、湿度チャンバーの窓が開いており、分注チップを装着したスプール、分注アーム、および母液分注針の位置を特定するためのレーザーベースのセンサーが表示されています。結晶化プレートを載せるための高くなったプラットフォームと、沈殿剤スクリーンブロックを保持するための低くなったプラットフォームがあります。このシーケンスでは、装置の電源を入れた際にロボットが初期化シーケンスを実行します。プログラミングソフトウェアを使用して、特定の結晶化プレートおよび沈殿剤ブロックでの動作に合わせて装置をセットアップし、規定のシーケンスで設定された量の中身と沈殿剤を分注します。そのような詳細はメーカーによって提供されており、ここでは記載しません。ロボットを用いた結晶化プレートのセットアップは、次のように開始します。上述の「in meso robot one」およびJoVE 1 7 1 2の説明に従い、タンパク質を含むメニスカスで満たされた針付きのHamiltonシリンジを準備します。シリンジをロボットの分注アームの下の所定の位置に固定します。デッキに取り付けられたレーザーセンサーを使用して、分注シリンジの針のX座標およびy座標を設定します。これは、結晶化プレートの各ウェルの中央にmeaseを正確に分注するために不可欠な工程です。コントロールパネルのボタンを押すと、シリンジが準備され、針先からmeaseが排出されます。その後、ロボットを用いてウェルに分注し、結晶化プレートをロボットのデッキに設置する準備として、はみ出した溶液をティッシュで拭き取ります。プレートを固定するため、プラットフォームの表面を数滴の水で湿らせます。キャピラリーを用いてプレートから保護カバーを取り外し、密着性を高めるためにプレートをプラットフォーム上にしっかりと設置します。プラットフォーム上には3つの基準マークがあり、3つのコーナーウェルがその上に中心合わせされることで、分注ニードルチップに対するプレートの正確な位置決めが保証されます。これで、装置はセットアップサイクルを開始できる状態になります。まず2回目のプライミングステップが行われ、新鮮なmeaseをプレートにロードする直前に、少量のガラスプレート上にMeaseが分注されます。このシーケンスでは、ロボットがまずプレート上の8つのウェルからなる垂直列にmeaseをロードし、次に使い捨てチップを使用してmeaseボラスの上に沈殿剤溶液を分注する様子が示されています。この工程をプレートの長さに沿って、すべてのウェルが満たされるまで11回繰り返します。全工程の完了まで約5分かかります。このビデオでは、各ウェルに50 nanolitersのMeaseと800 nanolitersの沈殿剤溶液を分注しました。充填されたプレートを、ベンチ上に配置されたロボットのプラットフォームから取り出します。カバーガラスを装着し、前述のMeso Robot 1の手順に従ってプレートを封止します。適切にラベルを貼付したプレートを、Meso Robot 3（Griffin LCP）の温度制御環境内に設置し、結晶成長させます。この最後のビデオクリップでは、in meso結晶化試験のセットアップに使用されているGriffin LCPロボットを示しています。Griffinには、前述のロボット1と同様のメッシュフェーズ分注システムが組み込まれています。ただし、このケースでは、96種類すべての沈殿剤溶液が同時に分注されます。装置本体がここに示されています。これには、結晶化プレートと沈殿剤ブロックが配置されるデッキ、分注アーム、およびPhoenix 96チップヘッドが含まれています。沈殿剤溶液を分注する際のロボットの動作が、この最後のビデオシーケンスに示されています。まず、96チャンネルチップヘッドに沈殿剤溶液を吸引します。粘性の高い沈殿剤の吸引を容易にするため、ユーザー定義のディレイ時間を設定できます。その後、MEA相が96個のウェルに順次分注され、この工程には約1分かかります。最後に、96チャンネルチップヘッドを用いて、結晶化ウェル内のMEA相ボルス上に96種類すべての沈殿剤溶液を同時に分注します。プレートへの充填プロセス全体は2分で完了します。充填後のプレートをロボットのデッキから取り出し、カバーガラスで密封して、結晶成長させるため温度制御条件下で保存します。高分子結晶構造解析による構造決定の全工程における次のステップは、結晶の回収とクライオ冷却、およびそれらからのX線回折データの記録と処理です。これらのトピックについては、本シリーズの別の記事で詳しく解説しています。

use-robot-for-high-throughput-crystallization-membrane-proteins

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ここで脂質中間相で手動での膜タンパク質の結晶化の試験を設定するにはカフリーの膜構造機能生物学研究グループに実装されたプロシージャが記述されています。...

脂質中間相を用いた構造決定のための膜タンパク質の結晶化

プロトコルは、LCP結晶化試験と収穫結晶の設定、LCP - FRAPプリ結晶アッセイで初期条件を見つけることが、脂質キュービック相（LCP）におけるタンパク質の再構成から開始して膜タンパク質の回折品質結晶を得るために不可欠な手順を説明します。...

脂質中間相における膜タンパク質の結晶化

Bicellesは、脂質二重層内での膜タンパク質（MPS）を維持するが結晶化ロボットによるハイスループットスクリーニングを容易にするユニークな相挙動を持っている脂質/両親媒性物質混合物である。この手法は、正常に原核生物と真核生物の両方のソースから高解像度の構造体の数を生産している。このビデオでは、結晶化の試験を設定する（手動でだけでなく、ロボット制御）と媒体から結晶を収穫、bicelle混合物中にMPを搭載した、脂質bicelleの混合物を生成するためのプロトコルについて説明します。...

脂質Bicelle法を用いた膜タンパク質のハイスループット結晶化

本明細書では、高分子のX線結晶構造解析を用いた構造決定に使用するための脂質立方相とスポンジで栽培収穫とクライオクールな膜タンパク質の結晶に構造·機能研究グループCaffrey膜で実装されたプロシージャが記述されている。...

高分子結晶学による構造決定のための脂質メソフェーズで栽培膜タンパク質の収穫とクライオ冷却結晶

βバレル外膜タンパク質(OMP)は、グラム陰性菌、ミトコンドリア、葉緑体の外膜内で多くの機能を果たします。ここでは、X線結晶構造解析またはNMR分光法による構造決定に十分な量のβバレルOMPを生成するためのプロトコルを提示することにより、構造研究における既知のボトルネックを軽減したいと考えています。...

βバレル外膜タンパク質の構造決意を目指して - 構築物から結晶へ

自動化されたシステムと画面の大きい数のルーチンの準備のためのプロトコル、蒸気拡散実験のためのナノリットル結晶滴は説明し、説明しました。...

MRC 分子生物学研究所高分子結晶化のプロトコルを自動

提示されたプロトコルは、96ウェルハイスループット透析プレートを使用してタンパク質結晶化条件と結晶成長をスクリーニングするための簡単なアプローチを説明しています。微結晶の大規模な成長のためのダイアライザーチューブの使用は、シリアル結晶学およびMicroEDアプリケーションでも実証されています。...

マイクロダイアリシス による ハイスループットタンパク質結晶化

このプロトコルは、1,536マイクロアッセイプレート調製から6週間の実験時間枠の終わりまで、ハイスループット結晶化スクリーニングの詳細を示しています。サンプルのセットアップ、得られたイメージング、および人工知能対応のグラフィカルユーザーインターフェイスを使用して分析を実行し、高分子の結晶化条件を迅速かつ効率的に特定する方法に関する詳細が含まれています。...

タンパク質結晶構造解析のためのクリスタルヒットを得るためのハイスループットスクリーニング(英語)

注文した膜タンパク質アレイの形成のために2次元（2D）の結晶化試験を評価すると、電子線結晶学における非常に重要かつ困難な作業です。 90kDa -...

電子線結晶学による構造生物学研究用小型膜タンパク質の二次元結晶化トライアルの評価

我々は、液体処理ロボットを用いた組換えタンパク質のアフィニティータグ精製する方法を説明します。この方法は、一般にハイスループットフォーマットで可溶性Hisタグ融合タンパク質の小スケールの精製にも適用可能である。...

アフィニティータグ組換えタンパク質のハイスループット精製

学ぶ脂質中間相を用いた膜タンパク質のロボット結晶化法。3種類の自動化システムを使い、高速・高精度な結晶化試験を実現します。構造生物学研究の生産性向上に貢献します。

脂質中間相における膜タンパク質のハイスループット結晶化のためのロボットの使用

さらに動画を探す