脂質中間相における膜タンパク質のハイスループット結晶化のためのロボットの使用

Membrane Structural and Functional Biology Groupへようこそ。私の名前はマーティン・カフェリーです。これは、インメソまたはリピックキュービックフェーズ法を使用した構造化測定のための膜タンパク質の結晶化に関する一連のJO記事のもう1つです。

最初の記事JoVE 1 7 1 2では、タンパク質を多く含む立方晶相がどのように調製されるか、および粘性で粘着性のあるミサ相が結晶化試験のためにガラスサンドイッチプレートに手動で分注される方法を示しました。このビデオ記事では、メソ結晶化ロボットの使用方法について説明します。ロボットには、速度、精度、精密な小型化、暗闇や低温などの不快な条件下での長時間の作業ができるという利点があります。

ロボットを適切に使用すれば、膜タンパク質の構造と機能の研究の生産性を大幅に向上させることができます。このビデオ記事では、市販の3台のロボットの使用方法を示します。最初のロボットは、膜構造および機能生物学グループで開発され、参考文献1で詳細に説明されています。

他の 2 つは最近利用可能になったばかりで、完全を期すためにここに含まれています。結晶化プレートの準備は、ロボットで結晶化試験を行うためのセットアップは、ベースプレートを参照して詳細に説明するガラスサンドイッチ結晶化プレートのベースプレートを準備することから始まります。まず、サイロ化する必要があり、ウェルを作成する穴あきダブルスティックスペーサーをプレートに適用する必要があります。これに必要な材料をここに示します。

それらには、ガラス結晶化ベースプレート、穴あきダブルスティックスペーサーライジングソリューション、ローラーまたはブレイヤーペーパーティッシュ、およびUE水のビーカーが含まれます。プレートはベンチトップのペーパータオルの上に置かれます。数滴のサイレント溶液を塗布し、次にペーパーティッシュでプレート表面に均一に分配します。

プレートは、ビーカーの水に完全に浸すことにより、過剰な化液を洗浄します。プレートを乾いたペーパータオルの上に置いたビーカーから取り出します。サイロ化した面を上にして露出した面をペーパータオルで軽く拭いて乾燥させます。

次に、穴あきダブルスティックスペーサーの保護カバーを取り外し、スペーサーをガラスプレートのサイロ化された表面に塗布します。スペーサーは、左上隅とスペーサーとプレートの隣接する2つの側面が一致するように、ベースプレート上に適切に配置されていることが重要です。ローラーまたはブレイヤーを使用して、ベースプレート上のスペーサーを平らにし、それらの間にしっかりとしたシールを作成します。

括弧内には、参照セクションで説明されているように、穴あきスペーサーを備えたサイロ化されたプレートが市販されていることに注意してください。結晶化ベースプレートを準備したら、次にセットアップとインメソロボットの使用に移ります。以下で述べるように、meso ロボットでの 3 つの使用を示します。

示されているすべてのケースで、ロボットは摂氏20度に設定された温度制御された部屋に設置され、使用されています メソロボット 1、このビデオでデモンストレーションされているメソロボットの最初のものです。論文はPIの研究室で作成され、現在市販されています。詳細については、参照セクションをご覧ください。

ここでは、ロボットによる結晶化試験の設定に必要な材料と機器を示します。それらには、実験ノート、タンパク質を多く含むミーズが含まれ、記事1 7 1 2のJoに記載されているように新たに調製され、ハミルトン注射器に収納されています。スペーサーとそれに対応するカバーガラス、ウォーターボトルとティッシュ、および味噌ロボットを備えたサイロ化されたベースプレート。

最初のビューは、デッキがクリアになったロボットです。次の図は、加湿器パークステーション、結晶化ベースプレート、沈殿物溶液を含む深い井戸ブロックを備えたロボットです。セットアップは、ベースプレートをロボットのデッキに配置することから始めます。

それには独自のプラットフォームがあり、ベースプレートの位置合わせの目的でウェル位置が明確にマークされています。プレートには、識別のために明確にラベルを付ける必要があります。沈殿剤溶液を含む96ウェルブロックは、結晶化プレートの隣にあるロボットのデッキ上の独自のプラットフォームに固定されています。

ブロックは、プラスチック製の天井キャップを慎重に剥がすことで開きます。加湿器からの湿度の流れは、ロボットのセットアップロボットのデッキ上のベースプレートを横切って流れるように指示されます。ロボットは、製造元の指示に従って初期化されます。

正確なプロトコルは時間の経過とともに変化するため、ここでは詳しく説明しません。基本的に初期化中に起こることは、ロボット上のミーズディスペンシングアームが3つの直交方向、x、Y、およびZ.Nextに設けられていることであり、分注針を備えたハミルトンシリンジ内のタンパク質を含んだメザフェーズは、ロボットの1つをアームに取り付けますメザフェーズとシリンジを準備する方法の完全な詳細は、記事1 7 1 2および参照1のJoに記載されています。 分注シリンジの針先は、結晶化プレートの左隅にある最上部ウェルの底部と中央に揃える必要があります。これは、ビジネスの最初の順序として、井戸Aの底に整列する井戸識別子Aに対応します。

これは、針先がウェルの底にどれだけ近づくかを見ながら、アームを分注した後、高さまたはZ座標を調整することによって行われます。先端がちょうどウェルの底部に接触していることは、分注アームの高さをこれまでわずかに調整しながら、プラットフォーム上でプレートを手作業で左右に動かすことによって判断することができ、先端がプレートに接触する分注アームのZ座標は、この基準Z位置から数マイクロメートル離れた針先でコンピュータ分注が行われるようにプログラムされ、 これはベースプレートの表面に対応します。次に、ロボットが作動して、ユーザーが針の先端をウェルAの中心に配置するように促される一連のステップを経ます。

チップが中央に配置されているディスペンシングアームの参照XY座標は、ロボットを制御するコンピューターに保存されます。これは、プレート上の残りのウェルの中心を定義するために使用されます。これらの参照座標をコンピューターで設定すると、ミーズディスペンシングアームは開始位置に戻り、シリンジをプライミングするように指示されます。

ここで、分注シリンジをプライミングする必要があります。これは、新鮮なミーズが分注針を満たし、プレート上の最初のウェルがミーズを完全に補完するようにするために行われます。プログラムには、ロボットのアクティブ化を実行するプライミングコマンドがあります。

これにより、シリンジ内のプランジャーは、ユーザーの制御下で段階的に前進します。これが起こっている間、針の先端は、押し出されたメザ相が組織で除去されるように見えるのを検査されます。これで、ロボットの実行はプライミングプロセスが完了します。

これで、ロボットは自動モードで実行を開始する準備が整いました。ロボットXAPプログラムは、ロボットのアーム2の沈殿物分注チップが洗浄され、ロボットの分注機能を活性化する深い井戸ブロックから沈殿物溶液を吸引する準備が整うフラッシングステップのラウンドを開始します。 続いて、配送間の急激な解決策。ミーズディスペンシングアームは、針の端を湿らせたスポンジに置く駐車位置に戻り、先端のミーズが乾燥するのを防ぎます。

最も一般的には、メンブレンで実施される結晶化試験で使用される値です。構造および機能生物学グループは、50ナノリットルのミーズと800ナノリットルの沈殿液です。このデモンストレーションでロボットを実行するプログラムは、2 本のアームが同時に動くように設定されています。

このようにして、96ウェルプレートのミーズと沈殿剤のローディングを5分で完了することができます。すぐにプレートが充填され、ロボットアームがパーク位置に戻ります。プレートをロボットのデッキから取り外し、平らな固体面に置きます。

カバーガラスは、スペーサーの上部粘着面に接触してベースプレートの上に優しく敷かれます。96個のウェルがすべて完全に覆われていること、カバーガラスがベースプレートと直角に揃っていること、カバーガラスがベースプレートのフットプリントを超えないようにすることが重要です。ローラーまたはブレイヤーを使用して、カバーガラスとスペーサーの間にしっかりと均一なシールを作成します。

この段階でプレートを検査して、セットアップが正常に機能したことを確認する必要があります。探しているのは、フライパンの外観に目玉焼きです。各ウェルでは、卵のヨークはメザ相に対応しています。

卵の白身は沈殿剤溶液であり、鍋の端は結晶化の周囲です。まあ、理想的には、3つは同心円状です。これで、プレートを温度制御された保管エリアに置き、結晶成長を行う準備が整いました。

これ以上プレートをセットしない場合は、沈殿物ブロックをロボットのデッキから取り外し、適切に密封して保管に戻す必要があります。ミーズを含む注射器は、ロボットの分注アームから取り外され、分注針やフェリアルを含むそのさまざまな部品を解体されます。メタノールで慎重に洗浄し、次のMesoロボット2つの蚊のLCPでの使用に備えて乾燥させました。

次のビデオクリップでは、メソ結晶化試験のセットアップに使用できる蚊のLCPロボットを紹介しています。これには、この記事で前述したものと同様の meph フェーズ ディスペンス システムが組み込まれています。ただし、ロボット1の場合、沈殿剤は使い捨てのチップを使用して分配されます。

ここでは、インストゥルメント自体を示しています。これには、結晶化プレートと沈殿物ブロックが湿度を制御するための窓付きチャンバーを設定するデッキが含まれています。この図では、湿度チャンバ上の窓は、分注チップ付きのスプール、ミーズ分注アーム、meph相分注針の位置を確立するためのレーザーベースのセンサーが開かれている。

結晶化プレートが座っている隆起したプラットフォームには、沈殿物スクリーンブロックを保持するための沈んだプラットフォームがあります。このシーケンスでは、ロボットは、機器がオンになったときに一連のアクションを初期化するのを見てきました。プログラミングソフトウェアは、特定の結晶化プレートと沈殿剤ブロックを操作するための装置をセットアップし、指定された順序で設定された量のミーズと沈殿剤を分注するために使用されます。

このような詳細はメーカーによって提供されており、ここには示されません。ロボットを使用して結晶化プレートをセットアップすることは、次のように始まり、針を完備し、タンパク質を含んだミーズを充填したハミルトンシリンジを上記のように調製します。シリンジは、ロボットの分注アームの下の位置にクランプされます。

分注シリンジ上の針のX座標とy座標は、デッキに取り付けられたレーザーセンサーを使用して確立されます。これは、ミーズが結晶化プレート上の各ウェルの中心に正確に分注されるようにするために必要な重要なステップです。コントロールパネルのボタンを押すだけで、注射器は針の先端からミーズを排出するように準備されます。

次に、ロボットを使用してウェルをロードする準備として、押し出されたミーズをティッシュで除去してから、結晶化プレートをロボットのデッキに取り付けます。プラットフォームの表面は、プレートを所定の位置に保持するために数滴の水で湿らせます。キャピラリーにより、保護カバーをプレートから取り外し、プレートをプラットフォームにしっかりと配置して、良好な接着を確保します。

プラットホーム上には3つのフィデューシャルがあり、その上には3つのコーナーウェルがすぐに中央に配置され、ディスペンシングニードルチップに対するプレートの適切な位置決めを確保し、機器はセットアップサイクルに入る準備が整いました。これは、2番目のプライミングステップで始まり、Measeが小さなガラスプレートに分注され、プレートに新しいMeaseをロードします。このシーケンスでは、ロボットが最初にプレート上に8つのウェルの垂直列であるミーズをロードし、次に使い捨てチップを使用してミーズボーラスの上に沈殿液を分注します。

このプロセスは、すべてのウェルが充填されるまで、プレートの長さに沿って11回繰り返されます。全体のプロセスが完了するまでに約 5 分かかります。この特定のビデオでは、クリップ50ナノリットルのミーズと800ナノリットルの沈殿溶液が各ウェルに分注されました。

充填されたプレートは、ベンチに置かれたロボットのプラットフォームから取り出されます。カバーガラスを貼り、プレートを上述したようにブラジャーで密封します 味噌ロボット1。適切にラベル付けされたプレートは、Mesoロボット3であるGriffin LCPでの結晶成長のために温度制御された環境に置くことができます。

この最終的なビデオクリップは、メソ結晶化試験でセットアップされているGriffin LCPロボットを示しています。Griffinは、ロボット1について上記で説明したのと同様のmephフェーズディスペンシングシステムを組み込んでいます。ただし、この場合、96種類の沈殿液すべてが同時に分注されます。

ここでは、インストゥルメント自体を示しています。これには、結晶化プレートと沈殿物ブロックが座るデッキ、ミーズディスペンシングアーム、フェニックス96チップヘッドが含まれています。沈殿物溶液の分注については、この最終的なビデオシーケンスでロボットの動作が示されています。

96チップヘッドには、最初に沈殿剤溶液が充填されます。粘性沈殿物の吸引を容易にするために、ユーザー定義の遅延が提供されます。MEAフェーズは、完了までに約1分かかるプロセスで96のウェルに順次分注されます。

最後に、96チップヘッドは、結晶化ウェルのMEA相ボーラスの上に96個の沈殿物溶液すべてを同時に分注します。プレートのローディングプロセス全体は2分で完了します。充填されたプレートはロボットのデッキから取り出され、プレートはカバーガラスで密封され、結晶成長のために制御された温度条件下で保管されます。

高分子結晶構造解析による構造化決定の全体的なプロセスの次のステップは、結晶を回収して凍結冷却し、結晶からのX線回折を記録および処理することです。これらのトピックは、このシリーズの別のジョブ記事でカバーされています。