蛍光によるウイルスRNAの検出その場でハイブリダイゼーション（FISH）

この手順の全体的な目標は、細胞内のCの2つのウイルスRNAの位置を視覚化することです。これを達成するには、まず、ガラスカバースリップ上でトランスフェクションまたは感染する細胞を増殖させます。2番目のステップは、トランスフェクションまたは感染が成功した後に、細胞を4%パラフォームアルデヒドで固定することです。

次に、RNAを標識するハイブリダイゼーション混合物で細胞をインキュベートします。これは、スライド上のハイブリダイゼーション混合物上にカバースリップセル側を下にして置くことによって行われます。この手順の最後のステップは、抗体を使用してRNA標識のために細胞を染色することです。

最終的に、細胞内の標識RNAの局在は、C 2ハイブリダイゼーションまたは魚の蛍光によって視覚化されます。この手法が、RNAイメージングやタグを使用した生命細胞などの他の方法と比較した場合の主な利点は、修飾RNAとは対照的にネイティブRNAを検出できることです。一般的に、この手法に不慣れな個人は、患者がケアを受け、カバー スリップの取り扱い、方法の標準化、および正確なタイミングを必要とするため、苦労します。

インキュベーション中、 固定のために細胞を培養するための具体的な手順は、細胞の種類によって異なります。接着細胞の場合、最初に未処理の滅菌ガラスカバースリップに播種することが重要です。したがって、収穫時の最終的な流暢さは約70〜80%です非接着細胞は、収集の準備ができるまで標準的な方法で培養する必要があります。

次に、感染またはトランスフェクションの24時間前に、典型的な12ウェルポリスチレン組織培養プレートプレート150,000細胞/ウェルのポリLリジンで処理したカバースリップでそれらをインキュベートします。カバーリップの上の細胞を摂氏37度で1時間インキュベートし、細胞固定の手順を開始します。慎重に吸引してメディアを廃棄し、準備した1つのXPBSと二重蒸留水を静かに加えます。

または、DPBSで細胞を1分間洗浄します。Dathyl pyro CARBATEまたはDEPC処理されたXPBSも使用できます。未処理のPBSにはRナーゼ酵素が含まれている可能性があるため、使用しないでください。

細胞を完全に覆う4%パラホルムアルデヒドを15〜20分間インキュベートした後、パラアルデヒドを廃棄し、DPBSで細胞を1分間洗浄します。DPBSを廃棄し、0.1モルのグリシンを加えて10分間インキュベートします。

次に、グリシンを捨て、細胞をDPBSで1分間洗浄します。DPBSを廃棄した後、0.2%Triton X 100を加え、5〜10分間インキュベートします。核小体型または核膜タンパク質を染色すると、Triton X 100で5分以内に透過しないと、タンパク質の局在が拡散します。

トリトンX 100を廃棄し、魚の手順を開始する前に、DPBSで毎回1分間2回洗浄します。カバーをインキュベートする側面を準備します スリップ それらをきれいにし、しっかりとラベルを付けるように注意します。18mmのカバースリップの場合は、スライドに50マイクロリットルのDNA溶液を加えます。

この手順の最も難しい側面は、カバースリップの適切な取り扱いです。カバースリップの右側をインキュベートし、優しく扱うことが重要です。破損を避けるために、カバースリップをスライドに追加し、細胞側を下にして置き、室温で15分間インキュベートします 15分後、カバースリップを上にして、X-D-P-B-Sを1つ入れた培養皿に販売側

カバースリップを1分間洗います。このミックスには、次のものが含まれています。50%脱イオン形態アミド1ミリグラム/ミリリットル、TRNA2つのX-S-S-P-E 5つのX dnarのRNAは、プローブとDEPC水を50マイクロリットルの最終容量に出力します。

このプローブは、ウイルスゲノムRNAを補完するように設計されたdig genin標識RNAプローブです。場所。各カバーは、スライド上のハイブリダイゼーション混合物上でセルを下にして滑ります。インキュベーションは、50%を含むトレイで実行する必要がありますFIDE 2つのXSSPE。

42°Cで16〜18時間インキュベートします。次に、カバースリップセルを下にして、50μLの50%ファイドで摂氏42度で50分間インキュベートします。2つのX-S-S-P-Eの50マイクロリットルで自分自身を下にして、摂氏42度でそれぞれ5分間、カバースリップを2つのX-S-S-P-Eで2回洗います。

最後に、カバースリップを1つのX-D-P-P-Sで1分間洗います。この手順を開始するには、ブロッキングが完了したら、細胞側を下にして1つのX Rocheブロッキング溶液50マイクロリットルに室温で30分間入れてカバースリップをブロックし、各カバースリップ細胞を下にして、実験用のすべての一次抗体を適切な濃度で含む一次抗体溶液の50マイクロリットルに入れます。1時間後に摂氏37度で1時間インキュベートします。

DPPSが入った培養皿にカバースリップを細胞側を上にして入れ、カバースリップを10分間洗浄します。次に、50マイクロリットルの二次抗体溶液を各カバースリップのスライドにピペットで移します。Alexaフロア標識抗体は、さまざまな色を生成するために使用でき、1つのxブロッキング溶液と1つのX-D-P-B-Sで1〜500希釈で使用します各カバースリップセル側を下にして二次抗体溶液に入れ、37度で1時間インキュベートします。

カバースリップを2回、それぞれ10分間洗います。DPBSドライでは、カバーをあぶらとり紙の上にセル側を上にして滑ります。光や漂白を避けるために、必ずカバースリップを覆ってください。

すべての液体が蒸発したら、カバースリップを新しいスライドに取り付けます。8マイクロリットルのイムノマウントを使用して、カバースリップを軽くたたいて気泡を取り除き、カバースリップの端にマニキュアを塗って所定の位置に固定します。顕微鏡技術によるRNAとタンパク質の可視化も、この手順の成功に不可欠です。

使用する顕微鏡の設定は、視覚化に役立つ場合もあれば、妨げになる場合もあります。したがって、顕微鏡の設定が正しく設定され、特定の実験でサンプル間で一貫していることが重要です。魚類によるウイルスRNAの可視化と免疫蛍光法によるタンパク質の局在化の代表的な結果を、この図に示します。

この最初のパネルでは、hela細胞にHIV Oneをトランスフェクションすると、緑色でトラクトされたHIV OneのウイルスRNAが細胞質全体に見られ、大部分がびまん性に見えますが、小さな細胞質のパンテは珍しくありませんが、ウイルスRNA染色のみを表す白黒の挿入画像で示されるように、陽性細胞を蛍光を示さない周囲の細胞と比較することで特異性を見ることができます。赤色の染色は、Ross GA PSH three domain binding protein または G three bp の免疫蛍光法を反映しており、これは主に、制御revタンパク質を欠くHIV細胞をヘロ細胞にトランスフェクションしたときに細胞質をマークします。産生されたウイルスRNAは核内に保持されます。

これは、核内の明るい緑色のシグナルと細胞質内のRNA蛍光シグナルの欠如として視覚化できます。HIV 1ウイルスRNAの分布は、特定の細胞タンパク質の過剰発現によっても変化する可能性があります。例えば、RAB 7つの相互作用するリソソームタンパク質または実際の、エンドソーム小胞輸送に関与するAタンパク質の過剰発現は、緑色で追跡されたウイルスゲノムRNAの再局在化をマイクロチューブ組織センターに導く。

ここでは、エンドソームはランプ1でタグ付けされ、赤く染色されています。対照的に、アミノ末端に欠失したデルタNの過剰発現は、Dineモーター複合体の接着されたP one 50に結合することができず、P50 dyinの発現が過剰に細胞質内に遅延エンドソームを分散させると、Dineモーターの大きなサブユニットがブロックされ、遅延エンドソームが放出されるだけでなく、ウイルスゲノムRNAおよびHIV V 1構造タンパク質も細胞末梢に放出されます。HIV Oneをヘロ細胞で発現させ、その後、細胞を異なる時点で収集して分析すると、ウイルスRNAはトランスフェクションと感染後3時間という早い時期に細胞内に現れ、この魚の手法では12時間後に容易に観察できるようになります。

ここでは、ウイルスのRNA発現を緑色で追跡し、細胞タンパク質H-N-R-N-P-A oneを赤色で染色します 一度習得すると、この技術は適切に実行されれば、1日目は20分、2日目は4時間半で行うことができます。この手順を試みる際には、カバースリップを壊さないように慎重に取り扱い、二次抗体を塗布した後は光を避けるようにすることが重要です。HIV V Oneやその他の高レベルの病原体を扱う場合は、固定前に非常に危険であり、この手順を実行する際には適切なトレーニングや封じ込めなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。