定量的なフィットネスの分析ワークフロー

この手順の目的は、ゲノムワイドなスケールで、定量的かつ高スループットに微生物培養の適応度を並行して捉えることです。これは、まず微生物コロニーのアレイライブラリを96ウェルプレートに作成して培養を飽和まで成長させることで達成されます。次に、飽和した培養液を水で希釈し、固体アガープレート上にスポットします。

その後、固形アガープレートを、微生物コロニーの増殖が飽和するまで定期的に撮影します。最終的に、各培養物の増殖に関する時系列写真は細胞密度の定量的測定値に変換され、増殖モデルを用いた観察済みの増殖曲線と微生物の適応度の定量的測定値としてまとめられます。最終的に、異なる変異を組み合わせた場合、または異なる条件下で培養した場合に、微生物株が異なる適応度を示すことを実証することで、遺伝的相互作用の証拠を示す結果を得ることができます。

SGAやバーコード競合実験などの高密度ピニング法といった既存の手法に対する本手法の主な利点は、フィットネス測定の精度が高いことです。この手法は、DNA損傷への応答や細胞周期制御においてどの遺伝子やプロセスが重要であるかといった、がん治療薬開発分野における重要な問いに答えるのに役立ちます。また、そのような研究や基礎的な微生物に関する知見を理解し、ヒトがん細胞における潜在的な薬物標的へと変換することを可能にします。さらに、本手法はテロメア機能やvisiに関する知見を提供することもできます。

本手法は、酵母生物学の他の領域や、適応度（フィットネス）の表現型から微生物生物学に関する知見が得られるあらゆる領域にも適用可能です。QFAが、アレイライブラリが存在する他の多くの微生物にも適用されることを期待しています。例えば、povi e coliやorilla surplusなどが挙げられます。飽和したオーバーナイト培養液から開始し、リッチ液体培地 200 µL ずつで 96 個の独立した酵母株を播種しました。

96ウェル培養皿を用いて、直径1/8インチの96ピン手動レプリカプレーターを滅菌します。まず100%エタノールに浸し、次に火炎滅菌して冷却させます。96ウェルプレートの各ウェルに200 µLの滅菌水を分注します。ボルテックスで撹拌した飽和酵母培養液に、滅菌したピンツールを3回浸して希釈します。その後、水が入ったプレートに1回浸します。ピンツールを再度滅菌し、冷却させてから、希釈した培養液に3回浸します。最後に、ピンツールを用いて固形アガープレートに転写します。

アガープレートをインキュベートした後、s and p robotics SP imagerを使用して手動で画像を撮影し、自動培養を行います。まず、固形アガー上で増殖させた独立した酵母株の長方形アレイから開始します。この例では、開始株は温度感受性クエリ変異と酵母欠損コレクションを交配させた結果得られたものです。

384の独立した酵母株の4反復に相当する1,536の培養物を、直径1 mmの滅菌ピンを備えた96ピンロボットピンツールを用いてSGAプレート上で育成します。1,536株のうち384株を、200 µLの選択培地を含む4枚の96ウェル培養プレートに転移させ、20 °Cで飽和状態まで培養します。飽和した酵母培養物をスポットするため、まず液量操作ロボットに転移させ、マグネティックシェーカー上で再懸濁します。その後、滅菌済みの96ピンロボットピンツールを用いて200 µLの滅菌水にピン転移し、培養物を約1:70に希釈します。

ピンツールを洗浄および滅菌した後、希釈した培養液をアガープレートにスポットします。384ウェルフォーマットで、プレートを自動カルーセルとアクセスハッチを備えた温度制御加湿インキュベーターに移します。培養物のイメージングにはロボット自動イメージャーを使用し、インキュベーターからプレートを繰り返し取り出し、蓋を外して、35 mmのカメラの下にある均一に照明されたスペースに移動させ、5,184 × 3,456の解像度で画像をキャプチャします。

Pixel resolutionが蓋を戻し、その後、プレート上の培養位置と適用された処理を追跡するために、それらをインキュベーターのカルーセルに戻します。プレートには、インキュベーター名、温度、一意の連続バッチ番号、およびインキュベーター内の位置に基づいて、自動的にバーコードが付与されます。画像名はプレート名とタイムスタンプの連結であり、画像キャプチャ時に自動的に生成されます。

ロボットカルーセル間で移動させる際に順序が変わらないよう、プレートに手書きでラベルを貼ることがよくあります。メタデータファイルは、手動で作成されるタブ区切りのテキストファイルです。実験記述ファイルはFT 2です。

表1は各実験ごとに固有のものですが、ライブラリ記述ファイル FT3 表1は広範に再利用可能です。構築後、実験内容は実験記述ファイル FT2 表1に記述されます。このファイルには、バーコードまたは自動生成されたプレート名、実験開始タイムスタンプ、プレート処理、固形アガー培地の内容、スクリーン名、複数プレートがあるライブラリの場合はライブラリプレート番号、および1,536ウェル形式から384ウェル形式にスケールダウンするためのリピートクアドラント番号の列が含まれます。E strainライブラリは、各培養位置で増殖させた遺伝子型を明記したライブラリ記述ファイル FT3 表1によって記述されます。

ライブラリの各プレートには、「library name」、「ORF」、「plate number plate」、「row plate column」、および任意の「notes」列の計4列（またはそれ以上）が含まれています。また、スクリーニング対象の株を特定するために、各系統的なORF番号に関連付けられた標準遺伝子名を記述したオプションの標準遺伝子名ファイル（FT 4、表1）を提供できます。このファイルには、データ解析用の「ORF」と「gene name」の2つの列が含まれています。

QFAの計算ワークフローを実行するには、十分な性能を持つマルチコアコンピュータワークステーションが必要です。オンラインでドキュメントが公開されているコロニー解析ソフトウェアツール「colonizer」と「QFAR」パッケージは、いずれも無料で提供されており、さまざまなオペレーティングシステムで動作します。取得した各プレート画像をインプットとしてcolonizerを実行し、撮影した画像ごとに1つのcolonizer出力ファイル（FT5、表1）を生成します。colonizerの出力ファイルには、推定培養密度、培養面積、形状、および色が指定されます。

イメージプレート上の384箇所の各地点について、出力ファイル名がソース画像ファイル名から自動的にコピーされます。QFARパッケージには、各培養のタイムコースに対して一般化ロジスティック個体群モデルを適合させ、観測値をプロットするためのseldens関数が含まれています。例については、図2および図3を参照してください。

適合パラメータ値はQFAロジスティックパラメータファイルに書き出されます。また、QFARパッケージには品質管理用の関数も含まれています。プレート端では栄養素がより得やすく、画像解析も困難であるため、エッジコロニーは除外されます。

プレート壁付近のコロニーや、SGAに不合格となった培養物、およびスクリーニング特異的マーカー遺伝子との連鎖を示す遺伝子型は、解析から除外されます。各培養物について、ロジスティック個体群モデルのパラメータから、いくつかの定量的適応度指標が導出されます。これらには、各反復培養セットおよび各適応度定義における、最大個体群倍加速度と接種から飽和までの分裂回数が含まれます。

適応度の推定値について、平均適応度、中央値適応度、適応度の標準偏差、および観察された反復回数などの要約統計量を算出します。要約統計量は、さらなる解析のためにQFA適応度要約ファイルFT 8 表1に出力されます。例えば、遺伝的相互作用スコアの計算などが挙げられます（FT 9 表1）。

この図は、384 QFAにおける対数スケールでの代表的な増殖曲線を示しています。固体アガー上で20 °Cで増殖させた培養物をcolonizerで定量化したもので、細胞密度の増加は約2日後に初めて検出されました。この遅延は、固体培地への接種後の培養ラグフェーズと、細胞密度の検出下限による複合的な影響であると考えられます。

ここでは、単一のプレートから308本の類似した増殖曲線が取得されました。平坦な線を示した株は、極めて状態が悪いか、あるいは死滅していたことに注意してください。この図は、遺伝的相互作用の強度を推定するための2つのゲノムワイドQFAスクリーニングの比較を示すものです。

QFARパッケージには、前述の増殖曲線図の作成や、解析したジェノタイプのランキングリストおよび遺伝的相互作用強度（GIS）の推定値を出力する機能も含まれています。観察されたGISの有意性を示すQ値と併せて、これらの機能を利用します。一連の手順を習得すれば、完全なゲノムワイドな4反復QF.A実験を3週間以内に完了させることができます。この手順を行う際は、すべてのプレートと画像の追跡および命名を体系的に管理することが重要です。

すべてのプレートは、正しい方向と順序で接種およびスポットする必要があります。データ解析は、実験者が作成した補助テキストファイルの正確性に依存します。このビデオを視聴することで、数千の独立した微生物培養物の適応度を推定する方法について、十分に理解できるはずです。

適合度は、固体アガープレート上で増殖させたスポット培養物を繰り返し撮影し、得られた画像を細胞密度の推定値に変換して増殖曲線を作成することで算出されます。増殖曲線を数学的にモデリングすることで定量的な適合度の推定が可能となり、これによりゲノムワイドなスケールで遺伝子産物間の機能的関係を導き出すことができます。