Name: 定量的なフィットネスの分析ワークフロー (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: 学ぼう 定量的フィットネス解析（QFA）を用いた微生物培養の適応度評価法。96ウェルプレートと自動イメージングにより、遺伝的相互作用や薬剤標的の探索に有用な高精度データを取得する計算的手法です。

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我々は感謝して我々の研究室とサポートと有益な議論のための高齢化と栄養（CISBAN）の統合システム生物学センターのすべてのメンバーを承認します。本研究では、バイオテクノロジー·生物科学研究会議（BBSRC）（BB/C008200/1）やウェルカム·トラスト（075294、093088）によりサポートされていました。

<ol><li>Addinall, S. G., Holstein, E., Lawless, C., Yu, M., Chapman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Fitness+Analysis+shows+that+NMD+proteins+and+many+other+protein+complexes+suppress+or+enhance+distinct+telomere+cap+defects%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Quantitative Fitness Analysis shows that NMD proteins and many other protein complexes suppress or enhance distinct telomere cap defects.</a> PLoS Genetics. 7 (4), e1001362(2011).</li>
<li>Addinall, S. G., Downey, M., Yu, M., Zubko, M. K., Dewar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genomewide+suppressor+and+enhancer+analysis+of+cdc13-1+reveals+varied+cellular+processes+influencing+telomere+capping+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A genomewide suppressor and enhancer analysis of cdc13-1 reveals varied cellular processes influencing telomere capping in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 180, 2251-2266 (2008).</li>
<li>Lawless, C., Wilkinson, D., Young, A., Addinall, S., Lydall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonyzer%3A+automated+quantification+of+micro-organism+growth+characteristics+on+solid+agar%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Colonyzer: automated quantification of micro-organism growth characteristics on solid agar.</a> BMC Bioinformatics. 11, 287-28 (2010).</li>
<li>Colonyzer - Image analysis software [Internet]. , Newcastle University. Newcastle, UK. Available from:
 <a target="_blank" href="http://research.ncl.ac.uk/colonyzer/">http://research.ncl.ac.uk/colonyzer/</a> (2012).</li>
<li>Tong, A. H., Evangelista, M., Parsons, A. B., Xu, H., Bader, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li>
<li>Costanzo, M., Baryshnikova, A., Bellay, J., Kim, Y., Spear, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+landscape+of+a+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The genetic landscape of a cell.</a> Science. 327, 425-431 (2010).</li>
<li>qfa - An R Package for Quantiative Fitness Analysis [Internet]. , University of Vienna. Vienna, Austria. Available from:
 <a target="_blank" href="http://qfa.r-forge.r-project.org/">http://qfa.r-forge.r-project.org/</a> (2012).</li>
<li>Blomberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+growth+rate+in+high-throughput+growth+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Measuring growth rate in high-throughput growth phenotyping.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 22 (1), 94-102 (2011).</li>
<li>Maringele, L., Lydall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EXO1-dependent+single-stranded+DNA+at+telomeres+activates+subsets+of+DNA+damage+and+spindle+checkpoint+pathways+in+budding+yeast+yku70%CE%94mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Dev%22%5BJournal%5D)">EXO1-dependent single-stranded DNA at telomeres activates subsets of DNA damage and spindle checkpoint pathways in budding yeast yku70Δmutants.</a> Genes and Dev. 16 (15), 1919-1933 (2002).</li>
<li>Warringer, J., Blomberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+screening+in+environmental+arrays+allows+analysis+of+quantitative+phenotypic+profiles+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Automated screening in environmental arrays allows analysis of quantitative phenotypic profiles in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 20, 53-67 (2003).</li>
<li>Hillenmeyer, M., Fung, E., Wildenhain, J., Pierce, S., Hoon, S., Lee, W., Proctor, M., St. Onge, R., Tyers, M., Koller, D., Altman, R., Davis, R., Nislow, C., Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+genomic+portrait+of+yeast%3A+uncovering+a+phenotype+for+all+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes.</a> Science. 320 (5874), 362-365 (2008).</li>
<li>Smith, A. M., Durbic, T., Oh, J., Urbanus, M., Proctor, M., Heisler, L. E., Giaever, G., Nislow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competitive+Genomic+Screens+of+Barcoded+Yeast+Libraries%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries.</a> J. Vis. Exp. (54), e2864(2011).</li>
<li>Lederberg, J., Lederberg, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replica+plating+and+indirect+selection+of+bacterial+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Replica plating and indirect selection of bacterial mutants.</a> J. Bacteriol. 63, 399-406 (1952).</li>
<li>Queller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioural+ecology%3A+The+social+side+of+wild+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Behavioural ecology: The social side of wild yeast.</a> Nature. 456, 589-590 (2008).</li>
</ol>

利害の衝突が宣言されません。

文化の希釈系列のスポットテスト9、通気液体培養9およびレプリカ平板13の成長曲線の決定：QFAは、多くの感覚に3つの確立されたベンチスケールの微生物学的技術の直接の子孫である。これらの3つの方法は、要約し、QFA及び表2の他のハイスループット技術と比較されます。希釈系列のスポットテストでは、接種希釈の範囲から成長した文化のシリーズのコロニーを形成する能力とひずみの適合性を定義するのに対し、単一文化の繰り返し観測によるQFA対策ひずみフィットネスは、成長曲線を構築する。単一文化の適合性を定量化すると、より多くの株が同一の条件下では、同時に検査することができます。異なる環境や遺伝的背景の培養フィットネスの違いをテストするときに文化の複製配列は、最も有用菌株コレクションの繰り返しテストすることができます。 QFAプロトコルは、提示ここで、独立した文化（ロボットQFA、 表2）数千人の成長を観察するための適切なインキュベーションとイメージ寒天プレートを複製接種するために高価なロボット装置を使用しています。 QFAが確立し、伝統的なラボの技術に基づいているので、しかし、それはまた、手動の手順（マニュアルQFA、 表2）ロボットの援助を置き換えることによって、はるかに安価に行うことができます。マニュアルQFAは、手動でピンツールとおよび写真撮影のためのインキュベーターからプレートの手動転送を使用して、寒天プレート上に培養物の複製および接種が含まれます。同じ計算解析ワークフローのいずれか実験的なデザインから成長曲線を生成するために適用することができます。 QFAフィットネスの見積もりが比較的正確であるように見える。 図4では、機能的に関連する遺伝子欠失の4例では、クラスタの平均適応度が強調表示されます。 2の自主的にそれぞれの機能的関連遺伝子クラスのメンバーの近接ENT遺伝的背景は、（ura3ΔとCDCl 3-1）QFAフィットネス推定値の再現性を示しています。たとえば、わずか3遺伝子欠失（アウト可能な4300の）保存されたMRX複合体の3つのメンバーを分離します。 微生物株の増殖特性をテストするためのQFAに高スループットの選択肢がバーコードライブラリ11,12および他のより完全に8を 表2にまとめて記載されている分光光度プレートリーダー10の光学濃度の動態をキャプチャ画面でSGA 5,6、競争画面を含む。培養は固体培地の表面上に成長QFAとSGAプレート（寒天ベースの方法、 表2）ロボットが迅速かつ容易に処理することができます。固体寒天表面の文化はよく成長全体に通気されており、細胞は社交的な微生物がコミュニティ14に成長することができ、固定の文化で成長することができます。左そのまま、微生物群集独自のマイクロ環境では、エタノールなどを分泌する毒素をffect、おそらく細胞間シグナル伝達。しかし、十分な通気を達成するために必要な、液体培養の連続混合、人工的に成長のそのモードに影響を与える可能性微生物群集とその微小環境を破壊する。文化間の細胞を運ぶ液体の飛沫の少ないチャンスがあるので、クロスコンタミネーションは、固形寒天方法の懸念が少ないです。汚染が固体寒天アッセイにおける外国空気を媒介とする微生物によって発生した場合、それはしばしば固体寒天プレートの目視検査によって検出され、占めまたは削除することができます。 QFAのスループットは、2つの方法で並列液体の方法に比べて有意に高くなっています。まず第一に、QFA（およびSGA）プレート上に接種した培養物は、プレート当たり複数の独立した文化を与え、より密に一緒にパックされています。 QFAで308の文化は、非実験的なエッジの培養（ 図1）COMはカウントしません、一般的に存在するプレート96または100文化と液体培養を並列に比較されます。第二に、QFA実験は、プレートのはるかに大きな数に拡張することができます。シングルQFA実験で分析したプレートの数は、インキュベーターまたは暖かい部屋、最小許容画像キャプチャの周波数と達成可能な最大キャプチャ周波数で使用可能なスペースによって制限される一方、液体増殖実験ではプレートの数を強く制限されているプレートリーダー（通常は1つまたは2つのプレート）、またはプレートリーダー（通常は25から50プレート）に接続されているスタッカの容量による。我々は最近、37884同時の文化を与え、123プレート、308実験的な文化とそれぞれの完全に自動化されたQFA実験を行った。我々は、液体中で成長して独立した文化の達成可能な最大数は96（文化/プレート）×50（プレート/スタッカ）私たちのQFAのスループットに比べ約10倍未満である= 4800であると推定している。液体培養の画面の代わりに、多くの自動化されたGROを利用することである並行してWTHデバイス（Blombergの8による評価から表1）、1つまたは2つのプレートの容量を持っている各。各デバイスの温度制御は独立している、などの条件が同一ではありませんが、あると仮定し、このワークフローでは、少なくとも190のようなデバイスは、QFAのスループットを（デバイスあたり200液体培養と仮定して）一致するように必要になります。 要約すると、QFAは有用小規模焦点を当てた実験や、高スループットのスクリーンの両方で、量的成長の表現型を収集するために適用することができ、高品質なワークフローです。それは、ロボット装置の要件を変えることで効果的に適用されるのに十分な柔軟性があります。 QFAワークフローの計算コンポーネントは、自由に利用できる、オープンソースコードに基づいています。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬/装置の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>レプリカプラター</td><td>シグマ</td><td> R-2508 </td><td> 1/8 &quot;径のピンと96ピンマニュアルpintool </td></tr><tr><td>ミックスメイト</td><td>エッペンドルフ</td><td> 5353 000.014 </td><td></td></tr><tr><td> Biomek FX </td><td>ベックマン</td><td> A31842 </td><td></td></tr><tr><td> Teleshake </td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> 50095890 </td><td> Biomek FXにインストールされている</td></tr><tr><td> BM3-SC </td><td> S＆Pロボット株式会社</td><td> BM3-SC </td><td> 192棚回転カルーセル</td></tr><tr><td> spImager </td><td> S＆Pロボット株式会社</td><td> spImager </td><td>高解像度マニュアルイメージング</td></tr><tr><td> CytomとspImagerに</td><td> S＆Pロボット株式会社</td><td>カスタム</td><td>温度が自動化された高分解能イメージングを制御</td></tr><tr><td>熱交換器とCytomat 6001 </td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> 51022222 </td><td> spImagerに接続されている</td></tr><tr><td> ECOLINE RE207 </td><td>ラウダ</td><td> RE207 </td><td> Cytomatに接続されている</td></tr><tr><td>カルーセルとspImager </td><td> S＆Pロボット株式会社</td><td>カスタム</td><td>自動化された高分解能イメージング</td></tr><tr><td> FP12pinsのロボットピンツールフィクスチャ</td><td> V＆Pサイエンティフィック</td><td> AFIX96FP12 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 96×FP12ピン</td><td> V＆Pサイエンティフィック</td><td> FP12 </td><td>長い50.4ミリメートル、17ミリメートル露出したピンの長さ</td></tr><tr><td>ピンツールのドッキングステーション</td><td> V＆Pサイエンティフィック</td><td> VP425 </td><td>ドッキングステーションベースはピンのファンの乾燥を可能にするために除去</td></tr><tr><td>ピンのクリーニングブラシ</td><td> V＆Pサイエンティフィック</td><td> VP425 </td><td> N / A </td></tr><tr><td>レプリカプラター</td><td>シグマ</td><td> R-2508 </td><td>マニュアルのピンツール</td></tr><tr><td>蓋ヌンクOmniTray </td><td>ヌンク</td><td> 734-0490 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 96ウェル滅菌ポリスチレンプレート</td><td>グライナーBioOne </td><td> 655161 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 96ウェル滅菌ポリスチレン蓋</td><td>グライナーBioOne </td><td> 656171 </td><td> N / A </td></tr></tbody></table> 表3。特異的試薬および装置。

定量的なフィットネスの分析ワークフロー

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

定量的なフィットネスの分析（QFA）は、並列1,2,3,4で育った微生物培養の適応度を比較するための実験と計算のワークフローです。 QFAは、単一の文化の焦点を絞っ観測に適用されるが、独立した文化の数千までの調査のゲノムワイドな遺伝的相互作用や薬物スクリーンのための最も有用であることができます。中央の実験方法では、インキュベートし、定期的に撮影されている固体寒天プレート上に独立した、希釈液を微生物培養の接種です。各時間ポイントからの写真は、定量的なフィットネスの措置が導出できるようになり、成長曲線を構築するために使用されている定量的な細胞密度の見積もりを、製造、分析されます。文化適応度は遺伝的相互作用の強さや薬剤感受性を定量化し、ランク付けするのに比較することができます。すべての治療の培養適応に与える影響は、基板の寒天（例えば、小分子、抗生物質や栄養素）に追加したり、外部のプレートに適用LY（例えばUV照射、温度）がQFAによって定量化することができます。 QFAワークフローでは、成長率は96ウェルまたは200ウェルプレートリーダーで並列液体培養の分光光度測定により得られるものに類似して推定し生成します。重要なのは、QFAは、このような方法と比較して有意に高いスループットを持っています。 QFA培養は固体培地の表面に成長するので、よく撹拌又は振盪を必要とせず、成長中に通気されています。 QFAのスループットは、いくつかの合成遺伝子アレイ（SGA）のスクリーニング方法5,6のそれと同じくらい高くはありません。 QFAの文化が頻繁に寒天に接種される前に希釈されているのでしかし、QFAは3指数と彩度の段階を含む、より完全な成長曲線を、キャプチャすることができます。たとえば、成長曲線の観測は、以前は1説明したように文化の倍加時間は、高精度を直接推定することができます。 ここでは提示S.数千人に適用される特定のQFAプロトコル自動的に接種、培養し、撮像中にロボットによって処理される酵母の培養。これらの自動化のいずれかの手順は、スループットに関連して減少し、同等の、マニュアルの手順に置き換えられ、我々はまた、低いスループット·マニュアル·プロトコルを提示することができます。同じQFAソフトウェアツールのいずれかのワークフローで撮影した画像に適用することができます。 私たちは出芽酵母の培養にQFAを適用する豊富な経験を持っているS.酵母しかし、我々はQFAは分裂酵母S.の文化を調べるために均等に役立つことを期待酵母と細菌培養。

定量的なフィットネスの分析（QFA）は、微生物の培養適応度を推定するための実験と計算手法の相補的なシリーズです。 QFAは、遺伝的変異、薬剤や微生物の成長の他の適用された治療の効果を推定します。単一の文化の焦点を絞っ分析から並列文化の何千もの実験のスケーリングを設計することができる。

定量的適応度解析（Quantitative Fitness Analysis: QFA）は、並行して培養された微生物培養物の適応度を比較するための実験的および計算的なワークフローである1,2,3,4。

この手順の目的は、ゲノムワイドなスケールで、定量的かつ高スループットに微生物培養の適応度を並行して捉えることです。これは、まず微生物コロニーのアレイライブラリを96ウェルプレートに作成して培養を飽和まで成長させることで達成されます。次に、飽和した培養液を水で希釈し、固体アガープレート上にスポットします。その後、固形アガープレートを、微生物コロニーの増殖が飽和するまで定期的に撮影します。最終的に、各培養物の増殖に関する時系列写真は細胞密度の定量的測定値に変換され、増殖モデルを用いた観察済みの増殖曲線と微生物の適応度の定量的測定値としてまとめられます。最終的に、異なる変異を組み合わせた場合、または異なる条件下で培養した場合に、微生物株が異なる適応度を示すことを実証することで、遺伝的相互作用の証拠を示す結果を得ることができます。SGAやバーコード競合実験などの高密度ピニング法といった既存の手法に対する本手法の主な利点は、フィットネス測定の精度が高いことです。この手法は、DNA損傷への応答や細胞周期制御においてどの遺伝子やプロセスが重要であるかといった、がん治療薬開発分野における重要な問いに答えるのに役立ちます。また、そのような研究や基礎的な微生物に関する知見を理解し、ヒトがん細胞における潜在的な薬物標的へと変換することを可能にします。さらに、本手法はテロメア機能やvisiに関する知見を提供することもできます。本手法は、酵母生物学の他の領域や、適応度（フィットネス）の表現型から微生物生物学に関する知見が得られるあらゆる領域にも適用可能です。QFAが、アレイライブラリが存在する他の多くの微生物にも適用されることを期待しています。例えば、povi e coliやorilla surplusなどが挙げられます。飽和したオーバーナイト培養液から開始し、リッチ液体培地 200 µL ずつで 96 個の独立した酵母株を播種しました。96ウェル培養皿を用いて、直径1/8インチの96ピン手動レプリカプレーターを滅菌します。まず100%エタノールに浸し、次に火炎滅菌して冷却させます。96ウェルプレートの各ウェルに200 µLの滅菌水を分注します。ボルテックスで撹拌した飽和酵母培養液に、滅菌したピンツールを3回浸して希釈します。その後、水が入ったプレートに1回浸します。ピンツールを再度滅菌し、冷却させてから、希釈した培養液に3回浸します。最後に、ピンツールを用いて固形アガープレートに転写します。アガープレートをインキュベートした後、s and p robotics SP imagerを使用して手動で画像を撮影し、自動培養を行います。まず、固形アガー上で増殖させた独立した酵母株の長方形アレイから開始します。この例では、開始株は温度感受性クエリ変異と酵母欠損コレクションを交配させた結果得られたものです。384の独立した酵母株の4反復に相当する1,536の培養物を、直径1 mmの滅菌ピンを備えた96ピンロボットピンツールを用いてSGAプレート上で育成します。1,536株のうち384株を、200 µLの選択培地を含む4枚の96ウェル培養プレートに転移させ、20 °Cで飽和状態まで培養します。飽和した酵母培養物をスポットするため、まず液量操作ロボットに転移させ、マグネティックシェーカー上で再懸濁します。その後、滅菌済みの96ピンロボットピンツールを用いて200 µLの滅菌水にピン転移し、培養物を約1:70に希釈します。ピンツールを洗浄および滅菌した後、希釈した培養液をアガープレートにスポットします。384ウェルフォーマットで、プレートを自動カルーセルとアクセスハッチを備えた温度制御加湿インキュベーターに移します。培養物のイメージングにはロボット自動イメージャーを使用し、インキュベーターからプレートを繰り返し取り出し、蓋を外して、35 mmのカメラの下にある均一に照明されたスペースに移動させ、5,184 × 3,456の解像度で画像をキャプチャします。Pixel resolutionが蓋を戻し、その後、プレート上の培養位置と適用された処理を追跡するために、それらをインキュベーターのカルーセルに戻します。プレートには、インキュベーター名、温度、一意の連続バッチ番号、およびインキュベーター内の位置に基づいて、自動的にバーコードが付与されます。画像名はプレート名とタイムスタンプの連結であり、画像キャプチャ時に自動的に生成されます。ロボットカルーセル間で移動させる際に順序が変わらないよう、プレートに手書きでラベルを貼ることがよくあります。メタデータファイルは、手動で作成されるタブ区切りのテキストファイルです。実験記述ファイルはFT 2です。表1は各実験ごとに固有のものですが、ライブラリ記述ファイル FT3 表1は広範に再利用可能です。構築後、実験内容は実験記述ファイル FT2 表1に記述されます。このファイルには、バーコードまたは自動生成されたプレート名、実験開始タイムスタンプ、プレート処理、固形アガー培地の内容、スクリーン名、複数プレートがあるライブラリの場合はライブラリプレート番号、および1,536ウェル形式から384ウェル形式にスケールダウンするためのリピートクアドラント番号の列が含まれます。E strainライブラリは、各培養位置で増殖させた遺伝子型を明記したライブラリ記述ファイル FT3 表1によって記述されます。ライブラリの各プレートには、「library name」、「ORF」、「plate number plate」、「row plate column」、および任意の「notes」列の計4列（またはそれ以上）が含まれています。また、スクリーニング対象の株を特定するために、各系統的なORF番号に関連付けられた標準遺伝子名を記述したオプションの標準遺伝子名ファイル（FT 4、表1）を提供できます。このファイルには、データ解析用の「ORF」と「gene name」の2つの列が含まれています。QFAの計算ワークフローを実行するには、十分な性能を持つマルチコアコンピュータワークステーションが必要です。オンラインでドキュメントが公開されているコロニー解析ソフトウェアツール「colonizer」と「QFAR」パッケージは、いずれも無料で提供されており、さまざまなオペレーティングシステムで動作します。取得した各プレート画像をインプットとしてcolonizerを実行し、撮影した画像ごとに1つのcolonizer出力ファイル（FT5、表1）を生成します。colonizerの出力ファイルには、推定培養密度、培養面積、形状、および色が指定されます。イメージプレート上の384箇所の各地点について、出力ファイル名がソース画像ファイル名から自動的にコピーされます。QFARパッケージには、各培養のタイムコースに対して一般化ロジスティック個体群モデルを適合させ、観測値をプロットするためのseldens関数が含まれています。例については、図2および図3を参照してください。適合パラメータ値はQFAロジスティックパラメータファイルに書き出されます。また、QFARパッケージには品質管理用の関数も含まれています。プレート端では栄養素がより得やすく、画像解析も困難であるため、エッジコロニーは除外されます。プレート壁付近のコロニーや、SGAに不合格となった培養物、およびスクリーニング特異的マーカー遺伝子との連鎖を示す遺伝子型は、解析から除外されます。各培養物について、ロジスティック個体群モデルのパラメータから、いくつかの定量的適応度指標が導出されます。これらには、各反復培養セットおよび各適応度定義における、最大個体群倍加速度と接種から飽和までの分裂回数が含まれます。適応度の推定値について、平均適応度、中央値適応度、適応度の標準偏差、および観察された反復回数などの要約統計量を算出します。要約統計量は、さらなる解析のためにQFA適応度要約ファイルFT 8 表1に出力されます。例えば、遺伝的相互作用スコアの計算などが挙げられます（FT 9 表1）。この図は、384 QFAにおける対数スケールでの代表的な増殖曲線を示しています。固体アガー上で20 °Cで増殖させた培養物をcolonizerで定量化したもので、細胞密度の増加は約2日後に初めて検出されました。この遅延は、固体培地への接種後の培養ラグフェーズと、細胞密度の検出下限による複合的な影響であると考えられます。ここでは、単一のプレートから308本の類似した増殖曲線が取得されました。平坦な線を示した株は、極めて状態が悪いか、あるいは死滅していたことに注意してください。この図は、遺伝的相互作用の強度を推定するための2つのゲノムワイドQFAスクリーニングの比較を示すものです。QFARパッケージには、前述の増殖曲線図の作成や、解析したジェノタイプのランキングリストおよび遺伝的相互作用強度（GIS）の推定値を出力する機能も含まれています。観察されたGISの有意性を示すQ値と併せて、これらの機能を利用します。一連の手順を習得すれば、完全なゲノムワイドな4反復QF.A実験を3週間以内に完了させることができます。この手順を行う際は、すべてのプレートと画像の追跡および命名を体系的に管理することが重要です。すべてのプレートは、正しい方向と順序で接種およびスポットする必要があります。データ解析は、実験者が作成した補助テキストファイルの正確性に依存します。このビデオを視聴することで、数千の独立した微生物培養物の適応度を推定する方法について、十分に理解できるはずです。適合度は、固体アガープレート上で増殖させたスポット培養物を繰り返し撮影し、得られた画像を細胞密度の推定値に変換して増殖曲線を作成することで算出されます。増殖曲線を数学的にモデリングすることで定量的な適合度の推定が可能となり、これによりゲノムワイドなスケールで遺伝子産物間の機能的関係を導き出すことができます。

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生物学

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神経毒性の高いコンテンツ分析のための神経とアストロサイト共培養アッセイ

アフリカツメガエル胚上皮は、上皮形態形成時の極性の開発と形状の変化などの細胞の挙動を研究する理想的なモデルシステムです。固定試料の伝統的な組織は、ますます生細胞の共焦点イメージングによって補完されています。ここでは、カエルの組織を分離し、生きた細胞の共焦点顕微鏡を使用して、ライブ上皮細胞とその細胞骨格を可視化する方法を示しています。...

生細胞イメージングとの胚上皮細胞の定量分析アフリカツメガエル</em

学ぼう 定量的フィットネス解析（QFA）を用いた微生物培養の適応度評価法。96ウェルプレートと自動イメージングにより、遺伝的相互作用や薬剤標的の探索に有用な高精度データを取得する計算的手法です。

定量的なフィットネスの分析ワークフロー

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