定量的なフィットネスの分析ワークフロー

この手順の目的は、定量的な微生物培養適合性をゲノムワイドスケールで正確かつハイスループットな方法で並行して捕捉することです。これは、96ウェルプレートに微生物コロニーの最初のチューリングと配列ライブラリを配置し、培養物を飽和状態まで成長させることによって達成されます。次に、飽和培養物を水で希釈し、固体寒天プレート上にスポットします。

次に、固体のガーフプレートを定期的に、微生物コロニーの成長が飽和するまで撮影します。最後に、各培養物の成長の経時変化写真を細胞密度の定量的測定に変換し、成長モデルと微生物適応度の定量的測定で観察された成長曲線を要約します。最終的には、微生物株が異なる突然変異と組み合わされたり、異なる条件下で増殖したりした場合に、異なる適応度を持つことを実証することにより、遺伝的相互作用の証拠を示す結果を得ることができます。

この手法は、SGAなどの高密度ピン留め方法やバーコード競争実験などの既存の方法と比較した場合の主な利点は、フィットネス測定がより正確になることです。この方法は、DNA損傷や細胞周期制御への応答においてどの遺伝子やプロセスが重要であるか、そのような研究を理解し、ヒト癌細胞の潜在的な薬物標的の形で基本的な微生物を理解するなど、抗がん剤開発分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この方法は、テロメアの機能とvisiについての洞察を提供することができます。

また、酵母生物学の他の領域や、適応度表現型が微生物生物学への洞察を提供できる任意の領域にも適用できます。QFAは、アレイライブラリーが存在する他の多くの微生物にも応用できると期待しています。例えば、povi e coli、オリラの余剰 飽和した一晩の培養から始まり、200マイクロリットルの豊富な液体培地で最大96の独立した酵母株を再生しました。

96ウェル培養皿では、96ピン、100%エタノールに浸し、次にそれを炎上し、それを冷却アレイに残すことにより、96インチ直径の手動レプリカプラターの8分の1を滅菌し、96ウェルプレートボルテックスの井戸内の滅菌水の200マイクロリットルは、酵母培養物を飽和させ、滅菌ピンツールをひずみに3回浸すことで希釈しています。次に、水が入ったプレートに入ったら、ピンツールを滅菌し、冷ましてから希釈した培養物に3回浸します。次に、ピントルを固体の寒天プレートに移します。

寒天プレートをインキュベートした後、sおよびp robotics SPイメージャーを使用して、自動培養のために手動でイメージングします。固体寒天培地で成長した独立した酵母株の長方形の配列から始めます。この例では、開始株は、温度に敏感なクエリ変異と酵母削除コレクションを交差させた結果です。

1, 384の独立した酵母株の4つの複製を表す536の培養物は、96ピン、1ミリメートルのピン直径の滅菌ピンツール転写384の1, 536株を4 96に転送して、SGAプレート上で成長します。200マイクロリットルの選択培地を含む培養プレートは、20°Cから飽和度まで培養物を成長させます。飽和酵母を見つけるには、まず培養物を液体処理ロボットに移し、Resusは磁気シェーカーに懸濁し、滅菌96ピンロボットピンツールを使用して培養物を約1〜70に希釈し、滅菌水200マイクロリットルにピン留めします。

ピンツールを洗浄および滅菌した後、希釈した培養物を寒天プレートにスポットします。384では、ウェルフォーマットは、プレートを自動カルーセルとアクセスハッチを備えた温度制御された加湿インキュベーターに移します。培養物を画像化するには、インキュベーターからプレートを繰り返し取り外し、蓋を取り外し、35ミリメートルカメラの下の均一に照らされた空間に移すロボット自動撮像装置を使用し、5,184×3,456で画像をキャプチャします。

ピクセル解像度は蓋を置き換え、インキュベーターカルーセルに戻して、プレート上の培養位置とそれらに適用された処理を追跡します。プレートは、インキュベーター名、温度、一意の連続バッチ番号、およびインキュベーター内の位置に従って自動的にバーコード化されます。画像名は、プレート名とタイムスタンプを連結したもので、画像キャプチャ時に自動的に生成されます。

また、プレートには、ロボットカルーセル間での移動時に同じ順序を保つために、手動でラベルが付けられることがよくあります。メタデータ ファイルはタブ区切りのテキスト ファイルで、手動で生成されます。実験記述ファイルFT 2。

表1は各実験に固有のものですが、FT3、表1のライブラリ記述は広範囲に再利用できます。構築されると、実験は、バーコードまたは自動生成されたプレート名の実験開始タイムスタンププレート処理内容の固体寒天培地のスクリーン名、複数のプレートを持つライブラリのライブラリプレート番号、および1,536から384にスケールダウンするためのリピート象限番号を含む2つのテーブルを含む実験記述ファイルFTの2つのテーブル1に記述されます。e株ライブラリーのフォーマットは、各培養場所で増殖した遺伝子型を記載したライブラリ記述ファイルFT3、表1で記載されている。

ライブラリの各プレートには、4 列目、ライブラリ名、ORF、プレート番号プレート、行プレート列、およびオプションのノート列が含まれています。任意の標準遺伝子名ファイルにFT 4、各系統的ORFY番号に関連付けられた標準遺伝子名を記述した表1を提供することができ、スクリーニングされる株を特定する。このファイルには、データを解析するためのORFと遺伝子名の2つの列が含まれています。

QFA の計算ワークフローには、 がインストールされている、適度に強力なマルチコア コンピューター ワークステーションへのアクセスが必要です。コロナイザー画像解析ソフトウェアツールとQFARパッケージは、どちらもオンラインで文書化されており、無料で入手でき、さまざまなオペレーティングシステムで実行できます。キャプチャされたプレート画像のそれぞれを入力としてコロナイザーを実行し、1つのコロナイザー出力ファイルFTを生成し、キャプチャされたコロナイザー出力ファイルごとにテーブル1を生成し、培養密度の推定値、培養、面積、形状、および色を指定します。

イメージプレート上の 384 か所ごとに、ソース画像ファイル名から出力ファイル名が自動的にコピーされます。QFAR パッケージには、一般化ロジスティック母集団モデルを観測値とプロットに適合させるために、各カルチャーの時間コースを選択するための関数が含まれています。どちらも例として、図 2 と図 3 を参照してください。

適合パラメーター値は、QFA ロジスティック・パラメーター・ファイルに書き込まれます。QFARパッケージには、品質管理のための機能も含まれています。エッジコロニーは、プレートエッジでの栄養素の利用可能性が高く、画像解析が困難であるため、廃棄されます。

SGAに失敗したプレート壁や培養物の近くでは、スクリーニング特異的マーカー遺伝子との連鎖を示す遺伝子型は分析から取り除かれます。いくつかの定量的適応度測定は、各文化のロジスティック母集団モデルパラメータから導き出されます。これには、最大集団倍加率と、複製培養の各セットおよび各適応度定義の接種から飽和までの分割数が含まれます。

適応度推定のいくつかの要約統計量は、平均と中程度の適応度、適応度標準偏差、および観測された反復数で計算されます。サマリー統計は、さらなる分析のためにQFAフィットネスサマリーファイルFT eight、テーブル1に出力されます。たとえば、遺伝的相互作用の計算はFT9テーブル1です。

この図は、対数スケールOUTTA 384 QFAの典型的な成長曲線を示しています。コロニー形成者によって定量化された固体寒天上で摂氏20度で増殖する培養物は、約2日後に最初に検出可能な細胞密度の増加を伴う。この遅延は、固体培地への接種後の培養遅延段階と、細胞密度の検出下限の複合的な影響である可能性があります。

ここでは、1枚のプレートから308の同様の成長曲線が取得されました。フラットラインを生成した株は非常に病気であるか、死んでいることに注意してください。この図は、遺伝的相互作用の強さを推測するための2つのゲノムワイドQFAスクリーニングの比較を示しています。

QFAR パッケージには、以前の成長曲線の数値を生成する機能、調査した遺伝子型のランク付けリストを出力する機能、および遺伝的相互作用強度の推定値も含まれています。観察されたGISの有意性のQ値とともに、完全なゲノムワイド4反復QFを習得すると。実験は3週間以内に完了することができます。この手順を試行する際は、すべてのプレートと画像の追跡と命名を整理することを覚えておくことが重要です。

すべてのプレートは接種され、正しい向きでスポットが付けられ、さらに順序付けられている必要があります。データ分析は、実験科学者によって構築された補助テキストファイルの正確さに依存しています。このビデオを見れば、何千もの独立した微生物培養の適応度を推定する方法を十分に理解できるはずです。

適応度は、斑点のある培養物を繰り返し撮影し、固体寒天プレート上で成長し、キャプチャされた画像を細胞密度の推定値に変換し、成長曲線を生成することによって推定されます。成長曲線の数学的モデリングにより、定量的な適応度推定が得られ、それを使用してゲノムワイドスケールの遺伝子産物間の機能的関係を推定できます。