Name: 中枢神経系から細胞を変換するためのレンチウイルスベクターの生産 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: 学ぶレンチウイルスベクターの生産・精製・定量法。293T細胞へのプラスミド共トランスフェクションと超遠心分離による精製を用い、中枢神経系細胞への遺伝子導入を実現します。神経細胞やアストロサイトへの効率的なトランスダクションが可能です。

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この作品は、ワシントン大学、プログラム、プロジェクトグラントNS032636（BJS）にNIH神経青写真コアグラント（P30 NS057105、BJS）によってサポートされており、神経疾患のためのホープセンターでされました。

1。レンチウイルスベクターのパッケージングレンチウイルスベクターは、レンチウイルストランスファーベクターとリン酸カルシウムトランスフェクション法により293T細胞にパッケージングするために必要な他のプラスミドのトランスフェクションによって生成されます。我々は、このプロトコルでは10〜100 mmの組織培養皿を使用しています。これは、スケールアップまたはダウンしてアプリケーションに応じてすることができます。 293T細胞株は、10％ウシ胎児血清（FBS）、100単位/ mlペニシリン、37°C​​で100μg/ mlのストレプトマイシンを添加し、高グルコース（4500 mg / L）をしてダ​​ルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で維持され5％CO 2インキュベーター。 <ol><li>培地中の10〜100 mmの組織培養皿（3×10 6細胞/シャーレ）に30〜40％コンフルエントでシード293T細胞。インキュベーターにセルを返します。 </li><li> 20から24時間の培養後、細胞密度を確認してください。細胞はトランスフェクション時の約80％コンフルエントでなければなりません。 </li><li> 50 mlチューブを準備します。 4.4ミリリットルを追加TE79/10（1 mMのトリス、0.1mMのEDTA、pH7.9）を引いた、次のプラスミドDNAの合計量。 100μgのレンチウイルストランスファープラスミド（ 図1）、58μgのpMDLg / pRRE、31μgののpCMV-G、25μgのPRSV-REV、600μlの2M CaCl 2を追加します。穏やかに混合する。 </li><li>別の50 mlチューブを準備します。 5ミリリットル2倍HBS（0.05 MのHEPES、0.28 MのNaCl、1.5mMののNa 2 HPO 4、pHは7.12）を追加します。 </li><li> 10 mlのピペットでDNA-CaCl 2の混合物を取って、チューブをボルテックスしながら滴下し、2×HBSを含むチューブに追加します。 </li><li> 30分間室温（RT）で沈​​殿反応を保持します。 </li><li>インキュベーターから培養皿を取り外します。ボルテックスでよく沈殿反応を混在させること。細胞を含む各100 mmディッシュに懸濁液1 mlを追加します。懸濁液を静かに皿の中の培地を旋回しながらゆっくりと滴下しなければなりません。インキュベーターにこれらの料理を返し、5時間放置する。 </li><li>培養液から培地を除去します。 6mMのBUナトリウムを含む6 mlの新鮮な培地を追加します。各ディッシュにtyrate。インキュベーターに文化を返します。構文内の蛍光レポーターがある場合は、一晩培養後、蛍光顕微鏡下でレポーター遺伝子の発現を確認してください。それがユビキタスプロモーター（例えば、CMVプロモーター）により駆動されている場合は、通常細胞の80％以上は、レポーター遺伝子を発現する。 </li><li>トランスフェクションの2日後（40から44 h）は、2〜50 mlのチューブ（約30ml各チューブ）に10皿から上清を収集します。 -80℃の冷凍庫で上清を凍結したり、次のステップに進みます。 </li></ol> 2。ベクターの濃度および精製<ol><li>新たに10分間上清中に任意の細胞破片を除去するために収集または900グラム（2000回転程度）で上清を融解を遠心分離します。 </li><li> 0.2μmのSFCAシリンジフィルターを60 mlの注射器を取り付けます。シリンジに50 mlチューブから上清を移します。ポリアロマーの遠心チューブに上清をフィルタリングします。 </li><li> 5 mlのピ​​ペットで5ミリリットルの20％スクロース（PBSで調製）を取る。挿入上清を含む遠心管の底までピペット。徐々にベクトル上清の下でのショ糖溶液を追加します。別のチューブから上清について、この手順を繰り返します。 </li><li> °Cで4時間ベックマンSW28スイングローターで11000回転と4で上清を遠心分離します。 </li><li>上清を除去します。各遠心チューブに150μlの4％の乳糖を（PBS中で調製）を追加します。ペレットを再懸濁します。 </li><li>すべての遠心チューブから1.5 mlチューブに濃縮されたベクトルを転送します。 15分間チューブを氷上にしておきます。 </li><li>ピペッティングによりベクトル懸濁液を混ぜる。 1分間、フルスピード（16000約g）で遠心してスピン。 </li><li>新しい1.5 mlチューブに上清を移します。 20μlのアリコートに最終的なサンプルを分割し、-80℃の冷凍庫でそれらを格納します。 </li></ol> 3。ベクターの滴定<ol><li>シード5×10 4 /ウェルの10％FBSを添加し1ミリリットルDMEM培地で12ウェルプレートでHT1080細胞の。 </li><li> overnig後HT文化は、1つのウェルから細胞をカウントし、細胞数を獲得。 </li><li>培養液で濃縮されたベクトルの：5倍希釈（および1:625; 1:125 25 1:5、1）を行います。別々のウェルに各希釈ベクトルの私は、液を追加します。サンプルは、精度を向上させるために複製される場合があります。 </li><li>各ウェルを含むベクトルやベクトルせずにウェルに1μlの4 mg / mlのポリブレン（Hexadimethrine臭）を追加します。静かにプレートを振とうして混合します。 48時間インキュベーターに戻す。 </li><li>細胞培養ウェルから培地を除去します。 PBSで各ウェルを洗浄します。細胞に250μlの1X trypsine-EDTA溶液を追加します。細胞は（3-5分）デタッチされたときに、1 mlの培地を追加します。ピペッティングにより細胞を再懸濁します。 1.5 mlの遠心チューブに細胞懸濁液を移します。 </li><li> 6分間900gで遠心します。蛍光レポーター遺伝子（例えばGFP）とのベクトルの場合、FACS分析のために3.7に進みます。レポーターせずにベクトルの場合、リアルタイム定量PCRは3.8に進みます。 </li><li>蛍光を含むベクトルのrescentレポーター遺伝子、上清を除去し、PBS中3.7％ホルムアルデヒド300μlでペレットを再懸濁します。 FACS分析によりレポーター陽性細胞の割合を決定します。力価はミリリットルの濃ベクトル当たり形質導入ユニット（TU / ml）として表されます。 </li></ol><img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/4031/4031eq1.jpg" /> 1月25日μL（0.04μl）をベクトルと30％の細胞はレポーター陽性であると、例えば1×10 5細胞が形質導入された場合、力価は次のようになります。 <img alt="式（2）" src="/files/ftp_upload/4031/4031eq2.jpg" />唯一の希釈液を使用して力価を計算するために追加された陽性細胞の割合とベクトル量との間に直線関係に落ちる。最後の力価は、ベクトルの少なくとも2つの異なる量の伝達経路から得られた抗体価の平均値である必要があります。 <ol start="8"><li>せずにベクトルの蛍光レポーター遺伝子は、製造業者のプロトコルに従って別途準備DNA Mini Kit（キアゲン社）を用いてHT1080細胞からゲノムDNAを抽出します。プライマー（HIV-1のPBS / PSI領域17）の5&#39;-CCGTTGTCAGGCAACGTG-3 &#39;および5&#39;-AGCTGACAGGTGGTGGCAAT-3&#39;とABI PRISM 7000配列検出システム（Applied Biosystems）を用いてゲノムDNAのベクター配列を増幅、およびTaqManプローブ5 &#39;-FAM-AGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGC-TAMRA-3&#39;。ゲノムにおけるシングルコピー遺伝子であるアルブミン遺伝子（2コピー/細胞）もプライマー5&#39;-TGAAACATACGTTCCCAAAGAGTTT-3 &#39;および5&#39;-CTCTCCTTCTCAGAAAGTGTGCATAT-3&#39;、およびプローブ5&#39;-FAM-TGCTGAAACATTCACCTTCCATGCAGA-TAMRA-3で増幅された&quot;内部統制として。次のプログラムで製造元の指示に従って、96ウェルプレートにコピーベクターの数とPCR法によるアルブミンを決定します15秒50℃2分間、95℃で10分間、および95の35サイクルのC°Cと60°Cで2分間。既知濃度のプラスミドの10倍希釈系列（コピーのように表さ数）の鋳型配列を含有するにも未知サンプルの定量化のための標準曲線を作成するために増幅されるべきである。力価はミリリットルの濃ベクトル当たり統合ユニット（IU / ml）として表されます。 </li></ol><img alt="式（3）" src="/files/ftp_upload/4031/4031eq3.jpg" /> 4。大脳新皮質文化の伝達ニューロンとグリアの両方を含む新皮質の培養物は、前述の18として二段階めっきプロシージャを使用して、マウスの大脳皮質から調製される。 14から16日間の妊娠で胎児マウスから得られたneocortexの複数形は、10％FBS、24ウェル組織培養プレートに20mMグルコースおよび2mMグルタミンを添加したMEMで以前に確立されたグリア細胞単層上に播種されています。 <ol><li> in vitroで 5日後、neocで10μMシトシンアラビノシド（ARA-C）を追加する非神経細胞分裂を阻害するortical文化。文化の2日間細胞を続行します。 </li><li> 5〜10分間37の暖かい培養培地は、°Cの水浴。 ARA-Cは新鮮な培養液（500μL/ウェル）とを含む培地に置き換えます。 </li><li>文化への理想のMOI（標的細胞の数にベクター粒子数の比率感染多重度）を持つベクトルを追加します。 24時間培養を継続します。我々は、プライマリ皮質培養で（通常は5）1-10 MOIを使用しています。 </li><li>新鮮な培地で培養液を交換してください。培養を継続します。ベクターコンストラクトにレポーター遺伝子がある場合は、2日間導入後、蛍光顕微鏡で細胞を確認してください。レポーター遺伝子の発現は、ベクターの設計と使用量に応じて、導入後のニューロン2-7に表示されます。 </li></ol> 5。代表的な結果このプロトコルの範囲で生産レンチウイルスベクターの力価は10 8 -10 10 IU / mlで、whichは、in vitroおよび in vivo の両方で CNSから種々の細胞型の伝達に適しています。 表1および図2は、このプロトコルによって生成されたベクターを用いた代表的な結果を示しています。我々は、形質導入 シナプシン（SYN）プロモーターまたはグリア線維性酸性タンパク質（GFAP）のプロモーターによって制御される緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現するレンチウイルスベクターによるマウスの新皮質の文化。七日間の導入後、私たちはそれぞれ、抗NeuNおよび抗GFAP抗体を用いて神経細胞やアストロサイトを標​​識するために免疫染色を行っ。 表1及び図に示すように。図2Aは 、ニューロンの90％（NeuN +細胞）を介して、シナプシンプロモーターを有するベクターで形質導入した後にGFPを発現していないアストロサイト（GFAP +細胞）は、このレポーター遺伝子を発現する。 GFAPプロモーターは、ベクターコンストラクト（ 図2B）、アストロサイトの約80％（GFAP +細胞）発現に使用される場合のGFP、GFAPとNeuNで標識した細胞でのGFPの発現の有無と局在によって確認としてすべてのGFP +細胞はアストロサイトがあります。これらの結果は、レンチウイルスベクターは、中枢神経系および細胞特異的遺伝子発現から細胞に導入遺伝子を提供する非常に効率的であることを示す適切なプロモーターが使用されているときに達成することができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4031/4031fig1.jpg" /> 図1。 HIVベースのレンチウイルスベクターとパッケージングプラスミドの概略図。HIV-1プロウイルスは上部に表示されます。ベクトル生産のための要素は4つの異なるプラスミドに分けられています。プラスミドレンチ転送は、U3領域はパッケージングシグナル（ψ）、RRE配列を、中央polypurine路（cPPT）、目的の遺伝子（例えば、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーターに置換されているハイブリッドの5 &#39;LTRを含む蛍光選択肢のプロモーターと一緒にレポーター）、および3 &#39;LTRのシス調節配列は完全にU3領域から削除されます。 pMDLg / pRREは、CMVプロモーターの制御下でHIV-1からgagおよびpol遺伝子とRRE配列を含んでいる。 PRSV-RevはRSVプロモーターにより駆動されるリビジョンのコーディング配列を含んでいます。のpCMV-Gは、CMVプロモーターの制御下でVSV-G蛋白質遺伝子を含んでいます。 PAは、ヒトβ-グロビン遺伝子からのポリアデニル化シグナルを示しています。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4031/4031fig2.jpg" /> 図2。マウス新皮質の混合培養におけるレポーター遺伝子の発現は、細胞型特異的プロモーターを担持するレンチウイルスベクターで導入した。培養はLV-SYN-GFP（A）または（B）MOI 5でLV-GFAP-GFPベクターを形質導入した。七日間の導入後、細胞は、抗NeuN又は抗GFAP抗体で免疫染色した。上部のパネルには、GFPの蛍光を示し、中央のパネルには、免疫染色を示し、下側のパネルは、（GFP：緑色、NeuN又はGFAP：赤）の画像をマージされます。 </P&gt; <table border="1"><tbody><tr><td> ベクトル </td><td> 神経細胞におけるGFP +細胞 </td><td> GFP +アストロサイトにおける </td></tr><tr><td> LV-SYN-GFP </td><td> 92.2±7.3 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> LV-GFAP-GFP </td><td> 0 </td><td> 78.3±11.5 </td></tr></tbody></table> 表1。マウスの新皮質の培養物中のGFP発現の比較は、異なるプロモーター運ぶレンチウイルスベクターで導入した。 マウス新皮質の培養物は、（5×10 5 /ウェルで24ウェルプレート）MOI 5でLV-SYN-GFPまたはLV-GFAP-GFPで形質導入した。導入7日後には、文化は固定されており、NeuN又はGFAPのために免疫染色した。 GFPとNeuN / GFAPを発現する細胞の数は、実験条件ごとに10分野からの画像で計数した。値は、ニューロンの割合（NeuN +細胞）を表すか、また、GFPレポーター遺伝子を発現するアストロサイト（GFAP +細胞）。示された値は、平均±SD、3つの独立した実験からである。

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<li>Shevtsova, Z., Malik, J. M., Michel, U., Bahr, M., Kugler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoters+and+serotypes%3A+targeting+of+adeno-associated+virus+vectors+for+gene+transfer+in+the+rat+central+nervous+system+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Promoters and serotypes: targeting of adeno-associated virus vectors for gene transfer in the rat central nervous system in vitro and in vivo.</a> Exp. Physiol. 90, 53-59 (2005).</li>
</ol>

利害の衝突が宣言されません。

このプロトコルでは、新皮質の培養物中のこれらのベクトルのレンチウイルスベクターと、アプリケーションの生産を示している。我々は、これらの方法で製造されたベクターを用いた効率的な細胞型固有の伝達を示した。シナプシンプロモーターが使用されている場合、GFPの発現は厳密には特定のニューロンである。 GFAPプロモーターが使用されている場合、GFPの発現はアストロサイトで排他的です。ない細胞タイプ特異的発現が必要とされていない場合は、ユビキタスプロモーターを使用することができます。我々はubiqutinとホスホグリセリン酸キナーゼ（PGK）プロモーターの両方が新皮質の文化6で高レベルの遺伝子発現を駆動することができました。レンチウイルスベクターによって駆動される遺伝子発現は、プロモーターの選択（例えば、タイプ固有のユビキタスまたはセル）または特定の組織またはアプリケーションをターゲットとする別のエンベロープ蛋白質またはベクトル疑似を用いて発現や細胞の種類の特定のレベルに合わせてカスタマイズすることができます。例えば、狂犬病G蛋白質またはVSV-Gの融合でシュードD狂犬病蛋白質は、逆行性軸索輸送19,20を</sup...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> D5796 </td></tr><tr><td> MEM </td><td>インビトロジェン</td><td> 11090-081 </td></tr><tr><td>ウシ胎仔血清</td><td>ハイクローン</td><td> SV3001403 </td></tr><tr><td> PBS </td><td>メディアテック</td><td> 21から040-CM </td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> T3924 </td></tr><tr><td>酪酸ナトリウム</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> B5887 </td></tr><tr><td> Hexadimethrineブロマイド（ポリブレン） </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> H9268 </td></tr><tr><td> 293T細胞</td><td> ATCC </td><td> CRL-11268 </td></tr><tr><td> HT1080細胞</td><td> ATCC </td><td> CCL-121 </td></tr><tr><td>ファルコン100×20ミリメートル組織cultureの皿</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 353003 </td></tr><tr><td> 1×3½polyallomoerの遠心チューブに</td><td> Beckman-Coulter社</td><td> 326823 </td></tr><tr><td> 0.2ミクロンのシリンジフィルタ</td><td>コー​​ニング</td><td> 431219 </td></tr><tr><td>別途準備DNA Miniキット</td><td>キアゲン</td><td> 51304 </td></tr></tbody></table>

中枢神経系から細胞を変換するためのレンチウイルスベクターの生産

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

中枢神経系（CNS）における効率的な遺伝子導入は、遺伝子機能の解析、神経疾患のモデル化、および治療法の開発において重要です。レンチウイルスベクターは、分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染し、導入遺伝子の持続的な発現をサポートし、パッケージング容量が比較的大きく毒性が低いため、CNSにおけるニューロンやその他の細胞種の形質導入に有用なツールとなります1-3。レンチウイルスベクターは、in vitro 4-6および動物個体7-10において、多くの神経細胞種への形質導入に成功しています。
遺伝子導入のためのバイオセーフティと効率が改善されたレンチウイルスベクターの開発に多大な努力が払われてきました。現在の第3世代の複製欠損および自己不活化（SIN）レンチウイルスベクターをFigure 1に示します。ベクターパッケージングに必要な要素は4つのプラスミドに分割されています。レンチウイルス転移プラスミドでは、5' LTR（長い末端反復配列）のU3領域が、別のウイルス由来の強力なプロモーターに置換されています。この改変により、通常HIV遺伝子発現に必要なHIV-1 Tatタンパク質に依存せずにベクター配列の転写が可能になります11。パッケージングシグナル（Ψ）はカプシドへの封入に不可欠であり、Rev応答配列（RRE）は高タイターのベクターを産生するために必要です。central polypurine tract（cPPT）はベクターDNAの核内移行に重要であり、これは非分裂細胞を形質導入するために必要な機能です12。3' LTRでは、U3領域からシス調節配列が完全に除去されています。この欠損は逆転写後に5' LTRにコピーされ、その結果、両方のLTRが転写的に不活化されます。プラスミドpMDLg/pRREは、構造タンパク質と逆転写酵素を供給するHIV-1 gag/pol遺伝子を含んでいます。pRSV-Revは、核からの効率的なRNA輸送のためにRREに結合するRevをコードしています。pCMV-Gは、HIV-1 Envに代わる水疱性口炎ウイルス糖タンパク質（VSV-G）をコードしています。VSV-Gはベクターの向性を拡大させ、超遠心分離による濃縮を可能にします13。Vif、Vpr、Vpu、Nefを含むアクセサリータンパク質をコードするすべての遺伝子は、このパッケージングシステムから除外されています。レンチウイルスベクターの作製および操作は、組換えDNAを用いる研究に関するNIHガイドライン（<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>）に従って行う必要があります。レンチウイルスベクターを使用する前に、各機関の生物化学安全委員会の承認が必要な場合があります。レンチウイルスベクターは通常、293T細胞にレンチウイルス転移プラスミドと、ベクターパッケージングに必要なタンパク質をコードするヘルパープラスミドを共導入することで作製されます。多くのレンチウイルス転移プラスミドおよびヘルパープラスミドは、非営利のプラスミドリポジトリであるAddgene（<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>）から入手可能です。いくつかの安定的なパッケージング細胞株が開発されていますが、これらのシステムは柔軟性に欠け、パッケージング効率が時間の経過とともに低下する傾向があります14, 15。市販のトランスフェクションキットは高い導入効率を実現できる可能性がありますが16、大規模なベクター調製においては非常に高コストになる場合があります。リン酸カルシウム沈殿法は、293T細胞に対して非常に効率的なトランスフェクションを可能にし、したがってレンチウイルスベクター作製のための信頼性が高く費用対効果の高い手法となります。
本プロトコルでは、リン酸カルシウム沈殿法に基づき、293T細胞に4種類のプラスミドを共導入することでレンチウイルスベクターを作製し、次いで20%スクロースクッションを用いた超遠心分離により精製および濃縮を行います。ベクタータイターは、蛍光活性化細胞分取（FACS）解析またはリアルタイムqPCRによって決定します。本プロトコルによるレンチウイルスベクターの作製とタイター測定は9日間で完了します。また、ニューロンとアストロサイトの両方を含むマウス新皮質培養細胞へのこれらのベクターの導入例を示します。レンチウイルスベクターが、中枢神経系（CNS）由来の初代培養細胞において、高い導入効率と細胞型特異的な遺伝子発現を可能にすることを実証します。

このプロトコルでは、生産、精製、およびレンチウイルスベクターの滴定について説明します。我々は初代培養神経細胞やアストロサイトにおけるレンチウイルスベクターによる遺伝子送達の例を示します。私たちの方法は、他の細胞型にも適用される場合があります<em&gt; in vitroで</em&gt;と<emin vivoでの&gt;</em&gt;。

中枢神経系（CNS）への効率的な遺伝子導入は、遺伝子機能の研究、神経疾患のモデリング、および……の開発において重要です。

本手順の全体的な目的は、中枢神経系の細胞に外来遺伝子を導入するためのレンチウイルスベクターを作製することです。まず、リン酸カルシウム沈殿法を用いて、レンチウイルス転移プラスミドとヘルパープラスミドを293T細胞に共導入します。次に、20% sucroseクッションを用いた超遠心分離により、ベクター含有上清を精製および濃縮します。第3ステップでは、ファックス解析またはリアルタイム定量PCRによってベクターのタイターを決定します。本手順の最終ステップは、ターゲット細胞にベクターを導入することです。最終的に、導入効率や細胞種の特異性は、導入遺伝子を発現しているターゲット細胞の免疫染色によって示すことができます。市販のキットを使用するなどの他の既存手法に対する本手法の主な利点は、レンチウイルスベクター作製において、低コストで効率的かつ信頼性の高いアプローチを提供できる点にあります。したがって、本手法は中枢神経系（CNS）細胞への外来遺伝子導入に関する知見を提供することが可能です。また、in vivoおよびin vitroにおいて他の細胞型にも適用できます。レンチウイルスベクターは、293T細胞へのプラスミドの共導入（共トランスフェクション）によって作製されます。本実験では、2 9 3 T細胞株を修飾DMEMで維持してください。100 mm培養皿10枚に、2 9 3 T細胞をコンフルエンス30～40%で播種します。20～24時間培養後、細胞が約80%コンフルエンスに達し、トランスフェクションに適した状態になります。トランスフェクションを行うため、必要なすべてのプラスミドを50 mLチューブに加え、TE 7 9 10で4.4 mLまで満たします。次に、2 M塩化カルシウムを0.6 mL加え、チューブを穏やかに混ぜ合わせます。別の50 mLチューブに2 XHBSを5 mL用意します。ボルテックスミキサーで撹拌しながら、プラスミドと塩化カルシウムの混合液をHBSに滴下して加えます。その後30分間、室温で沈殿が形成されるまで待ちます。インキュベーターから培養皿を取り出し、沈殿が形成されて懸濁したことを確認します。ボルテックスミキサーを使用し、懸濁液を1 mLずつ各皿に滴下して加えます。ディッシュ内の培地をそっと円を描くように混ぜます。懸濁液を次のディッシュに移す前に、チューブを短時間振ってください。播種したプレートをインキュベーターに戻します。プラスミドを5時間細胞にトランスフェクションさせます。5時間後、培地を6 mMの酪酸ナトリウムを含む6 mLの培地に交換します。翌日、培養物をインキュベーターに戻します。普遍的に発現する蛍光レポーターを使用した場合は、蛍光顕微鏡でその発現を確認してください。通常、80%以上の細胞がレポーター遺伝子を発現します。トランスフェクションの2日後、ディッシュからSANEを2本の50 milliliterチューブに回収します。1本あたり約30 millilitersになるはずです。この時点で、上清をminus 80 degrees Celsiusで保存し、後で処理を続行することも可能です。まず、トランスフェクションプレートから回収した上清を遠心分離し、細胞残渣を除去します。その間に、60 mLシリンジを0.2 µm SFCAシリンジフィルターに取り付けます。次に、上清をシリンジに分注します。その後、プランジャーを押し、上清をスイングローター適合の38 mLポリマー遠心チューブにろ過します。次に、5 mLピペットで20% sucrose in PBSを5 mL分採取します。上清の入った遠心チューブの底までピペットを挿入し、ベクターを含む上清の下にゆっくりとsucrose溶液を加えます。その後、Beckman SW 28を用いてSNATを4時間遠心分離します。遠心終了直後に上清をデカンテーションで除去し、ベクターを含むペレットを4% lactose in PBS 150 µLで再懸濁します。すべての懸濁液を1本の1.5 mLチューブに回収し、氷上で15分間冷却します。次に、ピペッティングで懸濁液を混合し、マイクロ遠心機を用いて最高速度で1分間遠心分離します。上清を新しい1.5 mLチューブに移し、濃縮したベクターを20 µLずつ分注して-80 °Cで保存します。ベクターのタイターを測定するために、まずHT 1080細胞を12ウェルプレートに播種し、各ウェルに添加剤入りDMEMを1 mLずつ加えます。一晩培養した後、1ウェルの細胞数をカウントし、細胞数を記録します。次に、濃縮したベクターを培地で5倍段階希釈し、希釈系列を作成します。その後、各希釈ベクターを1 µLずつ別々のウェルに分注します。サンプルは二連（デュプリケート）で作成しても構いませんが、陰性対照として少なくとも1つのウェルにはベクターを加えないでください。続いて、すべてのウェルにpoly brainを1 µLずつ加え、プレートを緩やかに振って混合します。プレートをインキュベーターに戻し、48時間培養します。2日後、各ウェルから培地を除去し、PPSで細胞を洗浄します。次に、細胞をトリプシン処理し、ピペッティングによって1 mLの培養液に再懸濁します。細胞懸濁液を1.5 mLチューブに移し、遠心分離して細胞ペレットを回収します。ベクターに蛍光リポーター遺伝子が含まれている場合は、ペレットを300 µLの3.7% ホルムアルデヒド含有PBSに再懸濁し、 FACS解析により陽性細胞の割合を決定してタイターを算出します。蛍光リポーター遺伝子が使用されていない場合は、市販のキットを用いて細胞からゲノムDNAを抽出します。その後、リアルタイムPCRを用いてベクター配列を増幅させます。コピー数が既知のプラスミドからテンプレート配列を10倍希釈系列で増幅し、標準曲線を作成します。次に、1 mLあたりのインテグレーションユニットとしてタイターを算出します。既報の2段階の手順を用い、サプリメント添加MEMを含む24ウェル組織培養プレート内で、マウス皮質由来のニューロンとグリアを含む新皮質培養物を調製し、5日間培養します。in vitro で、非神経細胞の分裂を抑制するために 10 micromolar の RSC を添加します。その後、培地交換時に細胞を乾燥させないよう注意しながら、2 日間培養を継続します。2 日後、RC 含有培地を 0.5 mL の温めた新鮮な培地に交換します。次に、目的のMOIでベクターを培養液に加え、さらに24時間細胞を培養します。24時間後、培地を交換します。48時間後、レポーターが存在する場合は蛍光顕微鏡で細胞を確認してください。レポーターの発現は、トランスフェクションの2日から7日後にニューロンで確認できるはずです。ベクターの設計によりますが、本プロトコルで作製したレンチウイルスベクターの力価は10⁸から10¹⁰の範囲になります。多くのCNS細胞のin vitroまたはin vivo形質導入に適した、1ミリリットルあたりの統合ユニット数です。したがって、マウス新皮質培養細胞に、シナプシンプロモーターまたはA-G-F-A-Pプロモーターによって制御されるGFPを発現するレンチウイルスベクターを形質導入しました。形質導入の7日後に、シナプシンプロモーターを含むベクターを用いて免疫組織化学染色を行いました。NeuN陽性細胞として同定されたニューロンの90%以上がGFPを発現していた一方で、GFAP陽性細胞として同定されたアストロサイトには発現が見られなかった。GFAPプロモーターを含むベクターを導入した細胞では、アストロサイトの約80%がGFPを発現したが、新たに標識されたニューロンにはGFPの発現は認められなかった。これらの結果は、レンチウイルスベクターがCNS細胞に外来遺伝子を導入する際に非常に効率的であることを示しています。さらに、適切なプロモーターを使用することで、細胞特異的な遺伝子発現を実現できます。レンチウイルスベクターは、中枢神経系における目的遺伝子の過剰発現およびノックダウンに広く利用されています。本プロトコルは、これらの手法を自身の研究室で導入したいと考えている他の研究者にとって有用であると考えられます。

production-lentiviral-vectors-for-transducing-cells-from-central

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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学ぶレンチウイルスベクターの生産・精製・定量法。293T細胞へのプラスミド共トランスフェクションと超遠心分離による精製を用い、中枢神経系細胞への遺伝子導入を実現します。神経細胞やアストロサイトへの効率的なトランスダクションが可能です。

中枢神経系から細胞を変換するためのレンチウイルスベクターの生産

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