Name: しわコロニーの開発を使用したバイオフィルム形成を評価するための半定量的アプローチ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: 学ぶバイオフィルム形成の半定量評価法。しわコロニー発達を顕微鏡観察し、細菌株間のバイオフィルム発達差を時系列で評価する技術です。Vibrio属など多様な細菌系に応用可能です。

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1。初期特性と考慮事項<ol><li>バイオフィルム形成は、一般的に細胞密度と成長率の影響を受けています。したがって、成長率（時間をかけて光学密度（OD）の増加）と、単純な成長曲線と細胞播種アッセイを行うことにより、興味のある菌株（S）の収率（最終細胞数）を決定する必要があります。実験をスポッティングの結果を解釈するときに成長の障害、またはODと細胞数の相関関係の欠如は、考慮する必要があります。 </li><li>しわの寄ったコロニー形成を評価する際には、マイナー板·ツー·プレートの変動がバイオフィルムの開発に影響を与える可能性があるように、同じプレート上で適切なポジティブコントロールとネガティブコントロールが含まれています。 </li><li>スポッティングのために最高の条件、すなわち、制御、興味のある変異体（s）間の最も明確な違いを明らかにするものを識別し​​ます。そのような別のメディアや温度などの様々な条件下で、液体培養で株を成長させる、さまざまな段階に前のスポッティングへの成長（指数または固定相）のS。適切なメディアに様々な細胞密度で培養液10μlを発見し、コロニーの形態が明らかになるまで、所望の温度でインキュベートする。 </li><li>エンドポイントアッセイ（すなわち、48時間）スポッティング後、所定の時点でしわの寄ったコロニー形成の評価が含まれます。この評価は、その展示株（または展示することが提案されています）バイオフィルム形成に重大な欠陥のために有用である。 </li><li>タイムコースアッセイは、一定期間のしわのコロニー形成（すなわち、すべての時間）後にスポッティングを評価しています。このアッセイは、一定期間のしわのコロニー形成とパターンの開発の開始の決定を可能にすることにより、バイオフィルム形成の半定量的評価を可能にします。与えられた時間経過の収集ポイントの実験と数値の期間は、予備実験で決定されるべきである。 </li><li>簡単に、ポスト·スポッティングで設定された時間を追跡するためにカウントアップするためにIMする人。 </li></ol> 2。 Vのしわコロニー形態の微視的評価シャリ <ol><li>接種V. LB-塩（LBS）培地13（1％[W / V]トリプトン、0.5％[w / vの]酵母エキス、2％[W / V]塩化ナトリウム、50mMトリス-HCl [5 mlのにシャリ細胞 pHを7.5]）振とうしながら、必要な抗生物質とインキュベートを含む、28℃で一晩細胞が所望のOD 600（例えば、OD 600 = 0.2または0.5）に達するまで、午前中に、同じ条件の下で新鮮なLBS培地とインキュベート5ミリリットルに1:100希釈で細胞を継代。 </li><li> 1分間最大速度でマイクロ·セット内のマイクロチューブ遠心培養液をピペット1ミリリットル。吸引により上清を除去します。無菌の70パーセント人工海水1ミリリットル（ASW）（35 mMのMgSO 4を -7H 2 O 7のCaClでペレットを再懸濁することにより、残留のメディアや外成分を除去するために細胞を洗浄2-2H 2 O、210 mM NaClを、7 mMのKCl）を、遠心分離を繰り返します。 70パーセントASWの1ミリリットルで洗浄したペレットを再懸濁します。 </li><li> 600 nmでのODによって見積もられた各サンプルは、同じ数のセルが含まれていることを確認してください。追加の70パーセントASWとより濃縮された試料を希釈することにより、任意の必要な調整を行う。予備実験では、様々な初期OD値でスポット培養は菌株や条件の特定のセットに最適な出発ODを決定します。最良の結果がV.ために得られたスポットは約0.2のODの培養液から生成されます。 シャリ 。 </li><li>必要な抗生物質を含むLBSプレート上に洗浄した細胞を10μlのを発見。プレートの上に文化をスポッティングする場合は、ちょうど寒天表面上に安定したピペット（指を含む）にいることを確認してください。ない角度で、垂直にスポット、スポットの均一な分布のために徐々に液体を取り出します。通常、各菌株が（プレート当たり最大6点）板ごとに一度発見され、ウィット実験ごとにhを複数のプレート（2-3）。 </li><li>斑点のある文化が均等に分散残っていることを確認するには、スポットがインキュベーターにプレートを移動する前に乾燥させます。プレートを逆さにして、28℃、それらをインキュベート℃に</li><li>接種後12〜15時間で成長してスポット毎時初めの形態を監視することができます。我々は観察し、文書のコロニー形態やしわの寄ったコロニー形成の開始と進行を評価するためには、カメラアタッチメント（プログレC10 PLUS）とプログレCaptureProとImageJのソフトウェアプログラムと解剖スコープ（ツァイスSTEMI 2000-C）を使用します。 </li><li>画像は上からキャプチャしている間に、ステップ2.5に記載されている特定のセットアップでは、スポットは、CL 1500 EC冷光源で透明ガラスステージを下から点灯している。このセットアップでは、ためにイメージングしわコロニー開発のための最適なV です 。 シャリ植民地（スポット）は半透明です。 </li><li>セントに記載されている特定の機器の有無にEP 2.5、フルコロニーに表示することができ、調節可能な光源と、理想的には、接続されたカメラを持つ任意の解剖顕微鏡を使ってモニターしわコロニー形態。必要であれば、デジタルカメラにも接続されたカメラが存在しない場合に利用しますが、これは最適ではありませんすることができます。 </li><li>最高のしわの寄ったコロニーの開発を視覚化するためには、開発バイオフィルムの三次元形態が識別できるような細菌のコロニーの下に反射の照明の強さと角度の両方を調整する必要があります。斑点コロニーとコロニーのアーキテクチャは（しわ）を明確に区別されるような周囲の寒天を背景に、間に強いコントラストを提供する最適な照明条件を決定します。 </li><li>コロニーの色の変化がバイオフィルム形成時に発生する可能性があるとして、いくつかのケースでは、斑点を付けられたコロニーの色も、考慮する必要があります。明らかにするために光源の強度と角度を調整着色これらの微妙な変化。適切な設定が達成されれば、実験期間中のためにそれらを維持します。 </li><li>どのくらいの時間が経過接種の時からしわコロニー形成は、各株または条件を開始した時刻に注意してください。パターニングと3次元構造の形成（すなわち、縞が外側のエッジで形成または &quot;波紋&quot;を中心に発生する）が最初に明らかであるした時点として、しわの寄ったコロニー形成の開始を定義します。変異体の細胞は、しわのコロニー形成（例えば、 図2）の開始に減少または増加した時間を示すことができる。 </li><li>適切なデジタル画像をキャプチャすることにより、しわの寄ったコロニー形成の開始と発展を文書化します。実験を通して画像を収集するときに同じ倍率を使用することが重要です。顕微鏡の接眼レンズからカメラの背面にあるレバーを使用してコンピュータ画面に表示を切り替えます。接眼レンズを切り替えるときと、パソコンの画面の表示は、ビューを調整し、それに応じて焦点。 </li><li>イメージング斑点培養する前に、ペトリ皿の蓋は、通常、鮮明画像を提供するために削除されます。見つけた文化は、ステップ2.5と2.6で説明されているセットアップを使用して、蓋を介して撮像することができますしかし、これはオプションの手順です。 </li><li>しわの寄ったコロニー形成開始後の各時点で、しわの寄ったコロニー開発のパターンに注意してください。アーキテクチャは、内部から生じることがある、またはこの評価インチ外は、異なる菌株によって、または別の条件の下で形成されたバイオフィルムを区別するためのメカニズムを提供します。 </li><li>各時点での開発コロニーの直径を測定します。これは手動で行うか、デジタル関連ソフトウェアプログラムを使用することができます。デジタル処理した場合、プログレCaptureProソフトウェアプログラムを使用して、最初の実験で使用される特定の倍率にスケールバーをキャリブレーション。キャプチャされた各画像中のスケールバーが含まれています。 </li><li> ImageJのソフトウェアプログラムを使用して、コロニーの直径を計算するには、各画像ファイルを開きます。次のようにスケールバーを標準化し、ツールバーから &quot;ストレートラインオプション&quot;を選択します。同じ長さと幅の直線が埋め込まれたスケールバーをオーバーレイ。ラベルの付いたタブから &quot;設定スケール&quot;を選択し &quot;分析&quot;を&quot;既知の距離&quot;ボックスで、対応する長さ（オリジナルのスケールバーから決定され、すなわち、2 mm）を挿入し、 &quot;OK&quot;を選択してください。 </li><li>スポットを越えて水平線を挿入するには、 &quot;ストレートライン&quot;オプションを使用します。分析タブの下に、 &quot;測定&quot;を選択してください。新しい結果]ウィンドウで、計算された長さが提供されます。スポット間の垂直線を挿入することにより第2測定値を得る。直径を再計算します。 2つの測定値の平均値を記録します。グラフExcelなどのソフトウェアプログラムを使用して、各時点で各スポットの平均直径。 </li><li>実験の終了は、指定された時点のいずれかで発生した場合、またはそれ以上が存在しない場合バイオフィルムの開発。終わりに達すると、PowerPointなどのソフトウェアプログラムを使用して、時間をかけてパターンの開発を可視化するために図（秒）に画像を統合することができます。 </li></ol> 3。代表的な結果これらの実験では、使用V.固体寒天表面にしわの寄ったコロニーの開発を評価することにより、バイオフィルム形成を研究するためのモデル生物としてシャリ 。 Vのバイオフィルム産生株40時間以内に大規模な3Dアーキテクチャとシャリのフォームコロニー（ 図1）8,9,14。ときに時間かけて調べ、それがコントロール株によるしわの寄ったコロニーの形成は約12時間後の接種（特定の条件によって異なります）（ 図2）9、早ければ開始することが明らかになります。対照的に、代表的な変異体によるバイオフィルム形成は約16時間後の接種9日まで開始しない場合、約4時間遅れで表示されています。 Repeaこれらの実験のtsは9この評価が半定量的な意思、タイミングは比較的一貫していたことが示唆された。バイオフィルム形成の第二の半定量的指標は、時間をかけて開発コロニーの直径の変化を利用しています。 図に示すように。図3Aは 、代表的なバイオフィルム有能な株はコロニーを形成する複雑性とバイオフィルムを形成しない代表的なひずみの相対直径の増加。これら二つの系統によって形成されたコロニーの直径の時間をかけて慎重に測定がバイオフィルム有能なコロニーのサイズはフィルム陰性のコロニーよりも大きい割合で増加したことを明らかにし、終了時点で2つはほぼ2で異なっていた - 倍（ 図3B）。代表的な遅い時間または &quot;エンドポイント&quot;コロニー形態の画像が頻繁に文献で示されているものの、したがって、追加の、半定量的データは、バイオフィルム欠陥のより良い理解を許可しますその収集することができます。<img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4035/4035fig1.jpg" /> 図1：エンドポイントアッセイ。この図は、Vの代表（右）は、非バイオフィルム形成（左）とバイオフィルム形成菌株を使用して、エンドポイントアッセイの例です。 シャリ 。これらの画像は、40時間後にスポッティングで収集した。これらの画像は、野生型で生成されたV.シャリには、ベクトル制御（非バイオフィルム形成）またはプラスミドRSCS過剰発現を含む（バイオフィルム形成）とモリスら 、2011年に収集したデータセットの一部であった。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4035/4035fig2.jpg" /> 図2時間コース検定。上部のパネルには、Vのバイオフィルム有能なコントロール株によるバイオフィルム形成の代表的なイメージが含まれています選択された時間にわたってシャリ 。バイオフィルム形成の開始は、12時間では明らかである。下のパネルは、代表的なIが含まれていますVの変異株の魔術師16時間後の接種で開始するバイオフィルム形成と、時間をかけてしわの寄ったコロニー形成の開始が遅延（4時間）を示すシャリ 。これらの系統間の微妙な違いだけ以前の時点で観察されながら、40時間で株は、バイオフィルム形成の強度やパターニングに似ていることに注意してください。これらの画像は、RSCSを過剰発現する野生型および変異体sypEで生成されたV.シャリ·セルとデータの一部であったモリスら 、2011年に収集された設定します。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/4035/4035fig3.jpg" /> バイオフィルム形成の半定量分析は、 図3。コロニーの直径。 Vの代表的なバイオフィルム形成（上パネル）と非バイオフィルム形成（下パネル）株によるバイオフィルム形成の（A）の経時シャリ 。バイオフィルム形成株は大きな増加を示すことに注意してください。非バイオフィルム形成菌株からの相対時間をかけて直径インチこれらの画像は、野生型で生成されたV.シャリには、プラスミドRSCS過剰発現（バイオフィルム形成）またはベクトル制御（非バイオフィルム形成）を含む、モリスら 、2011年に収集したデータセットの一部であった。 （B）プロトコルで説明されているこれらのデータはImageJとExcelソフトウェアを使用して生成されたパネルAの2株による時間をかけてコロニーの直径の増加のグラフィカルな表現。

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</ol>

利害の衝突が宣言されません。

本研究では、使用して、バイオフィルム形成を評価するための半定量的方法を説明V.モデル生物としてシャリ 。具体的には、固形寒天表面上に時間をかけてしわの寄ったコロニー形成としてのバイオフィルム形成と発展を監視するカメラの添付ファイル付きの解剖顕微鏡を利用しています。このプロトコルでは、我々は一般的にしわの寄ったコロニー形成を評価するために使用するメソッドの特定の2種類を概説しています。最初は私たちが選択された &quot;最終&quot;の時点で最終的に、全体的な3Dアーキテクチャ、パターニング、斑点のある文化の直径を観察することができ、エンドポイントアッセイである。このアプローチでは、バイオフィルム形成の劇的な欠陥につながる変異株や条件を評価するために最も有用です。しかし、このアプローチは、選択したエンドポイントの前の時点で発生する多くの微妙な違いを区別しません。より密接にしわの寄ったコロニー形成を監視するために、私たちは私たちがwの開始を識別することができますタイムコースアッセイを使用しコロニー形成をrinkledと時間をかけてその開発を監視します。このアプローチの結果として、しわの寄ったコロニー形成、3Dアーキテクチャ、およびパターニングのタイミングの微妙な違いを識別することができます。我々は、バイオフィルム形成の2つの半定量的なアッセイを生成するには、このタイムコースアッセイを使用していました。まず、株は3Dアーキテクチャを開発するために開始する時刻は、コントロール株のそれと比較することができます。私たちは、同じ条件で特定の変異体のバイオフィルム形成の遅延が9かなり一貫性があることを発見した。たとえば、データ、 図に示す。図2に示すように 、変異体は一貫してバイオフィルム形成を開始することで4時間の遅延について示した。バイオフィルム形成の第二の半定量的尺度は、しわの寄ったコロニー（スポット）の直径の大きさの変化である。我々は（ 図3しわコロニーの直径が徐々に終了時点で2倍の違いについてに達し、非バイオコロニーのそれとは異なることを発見した</強い&gt;）（モリスとビジック、未発表データ）。それはいくつかの変異体は、異なる動作をします可能性が残る日に、我々は、（未発表データ）（すなわち、コロニーの直径を増加させずにバイオフィルム形成）は、他のことなく1の表現型を観察していません。確かに、それはV.について報告されている他の人が15ないしながらコロニーの直径が大幅に増加いくつかのしわの寄ったコロニーの結果というコレラ 。それでも、時間の経過とともに径の変化を評価し、潜在的なバイオフィルムの変異体の特性評価に役立ち、そして/または、開発の遅れと変異株の追加の定量的尺度を提供することができます。バイオフィルム形成の二つの尺度（時間と直径）は、しわのコロニー形成の開始を決定するスポット径を決定することよりも、より敏感なだけでなく、より主観的である。そうであっても、両方の対策がバイオの研究に非常に便利ですがquantificatio容易に従順ではない表現型の半定量的評価を提供するN。 斑点を付けられた培養アッセイを行う場合には、斑点のある株は、培養されている環境条件を考慮することが重要です。しわの寄ったコロニー形成は、多くの栄養状況、温度、湿度など、さまざまな環境条件によって影響を受けています。実験間のばらつきを低減するために、それははるかに可能な限り（すなわち、セットのボリュームに寒天プレートを標準化し、制御された温度で培養発見株）を、これらの条件を標準化しておくと便利です。スポッティング実験間のばらつきのためにさらに制御する、実験の各セット内の適切なコントロール株を含めることが重要です。最後に、これらのアッセイからのデータを解釈するとき、それがしわのコロニー形成（例えば、バイオフィルム形成やパターニングの違いで遅延）の微妙な違いを評価し、特に複数回（3 +）、いずれの実験を行う必要があります。このプロトコルのいくつかの制限事項は次のとおりである：1）determin細胞が成長の欠陥を持っているかどうかをINGは難しいかもしれません：液体培養中の細胞の成長を正確に成長固体培地上でのレート、および可能ではありませんが、一緒にくっついてバイオフィルムを形成する細胞の成長の正確な決定を反映していない場合があります。 2）成長の欠陥を持つ株が分析し問題になる可能性があります3）それは微妙なバイオフィルムの表現型を有する系統間の直径の違いを区別することはできないかもしれません。4）同心のリング状に成長しない株のためにそれを正確に測定することができない場合があります直径の変化、パターニングがバイオフィルム形成の間に観察することができますが5）、結果としてバイオフィルムのパターニングを定量化する方法はありません、6）この実験的なセットアップとバイオフィルムのZ次元を測定する方法はありません。これらの制限にもかかわらず、このプロトコルは、それにもかかわらず、しわの寄ったコロニー形成の評価を支援するために数値データを取得する手段を提供します。 このプロトコルでは、特定のイメージングを活用するしわの寄ったコロニー形成を観察し、評価するためのシステム（すなわち、ツァイス実体顕微鏡とプログレCaptureProイメージングソフトウェア）。ここで説明した撮像システムは、強力です。しわのコロニー形成の開始を検出するため、経時的なアプローチで開発を評価する能力を大幅に解剖顕微鏡を使用して強化されています。この技術が利用できない場合は、プロトコルは、ズームフォーカスのあるシンプルなデジタルカメラを含む他の機器との使用のために適合させることができます。このプロトコルはしわコロニー開発の評価に焦点を当てているが、それはまた、ペリクル形成、細胞が培養液に静的に成長しているときに開発したバイオフィルムの形態を評価するために変更することができます。また、このプロトコルは、バイオフィルムの開発中に斑点のコロニーに特定の色素の取り込みを含むバイオフィルム形成の他の指標を評価する上で役立つ可能性があります。これらが含まれますが、そのようなコンゴーレッドとcalcofluとして染料が、これらに限定されないまたはこれは、セルロース、細菌のバイオフィルム16の共通コンポーネントにバインドすることができます。さらに、このプロトコルは、Vで使用するために開発されたがシャリは 、この生物に限定されるものではなく、そのような枯草菌（Bacillus subtilis）4、コレラ菌 5、 腸炎ビブリオ 6、 緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）7、すべての展示しわコロニー形成のような多数の異なる生物におけるバイオフィルム形成を研究するに一般化することができる。最後に、それはまた、 緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）18 Myxococcus xanthus 17の成長と空中構造の開発中に発生したパターニング、潜在的に、などの発達パターンを持つ他のコロニーの形態を研究するために適応させることができます。このプロトコルは、微生物学、バイオ研究者への一般的な使用のため、です。

<html><table border="1"><tbody><tr><td> 機器の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>ツァイスSTEMI 2000-C解剖顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td> 45505300000000000 </td><td> （ルーカス顕微鏡を介して取得） </td></tr><tr><td>プログレC10 PLUS </td><td>イエナオプティック光システム社</td><td> 017953-602-26 </td><td>カメラアタッチメント（ルーカス顕微鏡を介して取得） </td></tr><tr><td> CL 1500 ECコールドライトソース</td><td>ツァイス</td><td> 4355400000000000 </td><td> （ルーカス顕微鏡を介して取得） </td></tr><tr><td>プログレCapturePro </td><td>イエナオプティック光システム社</td><td>登録されたカメラとフリーソフトウェア</td><td>画像キャプチャするためのコンピュータプログラム</td></tr><tr><td>画像J </td><td> NIH </td><td>からフリーソフト：IJ / download.htmlに &quot;ターゲット=&quot; _blank &quot;&gt; http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html </td><td>直径測定用のコンピュータプログラム</td></tr></tbody></table>

しわコロニーの開発を使用したバイオフィルム形成を評価するための半定量的アプローチ

A Semi-quantitative Approach to Assess Biofilm Formation Using Wrinkled Colony Development

バイオフィルム、または細胞外マトリックスにカプセル化された細胞の表面に接続されたコミュニティは、多くの細菌のための一般的なライフスタイルを表しています。バイオフィルム内では、細菌細胞は、しばしば抗生物質や他の環境ストレスを1に強化された抵抗を含む、改変された生理機能を示す。さらに、バイオフィルムは、ホスト微生物の相互作用に重要な役割を果たすことができます。ときに、個々の細菌転移バイオフィルムは、複雑な多細胞社会2を形成し、浮遊細胞を開発しています。研究室では、バイオフィルムは、特定のバイオフィルムの表現型の開発を評価することによって研究されています。一般的なバイオフィルムの表現型は固体寒天媒体3のしわやしわの細菌コロニーの形成を含む。しわの寄ったコロニー形成を識別し、特徴付ける変更されたバイオフィルムの表現型を示す菌株を、衝撃のバイオフィルム形成、環境条件を調査するために特にシンプルかつ有用な手段を提供します。 WRInkledコロニー形成は、 コレラ菌 5、 腸炎ビブリオ 6、 緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）7などの枯草菌（Bacillus subtilis）4、およびグラム陰性菌としてグラム陽性菌、両方を含む種々の細菌のバイオフィルム形成の指標として機能し、 ビブリオフィシャリ 8。 海洋細菌V. V.によって生成されたバイオフィルム： シャリは、ホストの植民地化の間にバイオフィルムの重要な役割のためにバイオフィルム形成のモデルとなっていますシャリは、ハワイのボブテイルイカEuprymna scolopes 8-10その植民地化を推進しています。重要なのは、in vitroで観察されたバイオフィルムの表現型は、Vの能力と相関シャリ細胞が効果的に宿主動物にコロニーを形成する：株が増加した展示ながら、in vitroでのバイオフィルム形成のために損なわ株は、植民地化の欠陥9,11を有しているバイオフィルムの表現型は、植民地8,12のために拡張されています。V.シャリしたがって 、細菌がバイオフィルム形成を調節する方法と、バイオフィルムの影響ホスト植民地化するためのメカニズムを評価するための単純なモデルシステムを提供します。 本稿では、使用して、バイオフィルム形成を評価するための半定量的方法を説明V.モデルシステムとしてシャリ 。このメソッドは、固形寒天培地上に定義されている濃度とボリュームで、細菌培養のスポッティング慎重を含む、斑点の文化は、単一の細菌のコロニーと同義語です。この &quot;斑点のある文化&quot;技術は、単一の、指定した時間ポイント（エンドポイントアッセイ）で総フィルムの表現型を比較したり、コロニーの直径のバイオフィルムの開発と測定値の経時的アッセイによって微妙なバイオフィルムの表現型を識別し、特徴付けるために利用することができます。 、バイオフィルム形成に影響されている。したがって、この手法は、バイオフィルム形成の半定量分析、あたりを提供していますしわの寄ったコロニーの開発と発展構造、シンプルな全体的な形態を超えた特性の相対的な大きさのタイミングとパターニングの評価をmitting。

我々は、バイオフィルム形成を調べるために、シンプルな半定量方法を提供<em&gt; in vitroで</em&gt;。このメソッドは、しわの寄ったコロニーの発達によって評価されるように、バイオフィルム形成のタイミングとパターンの両方を監視するためにツァイスSTEMI 2000-C解剖顕微鏡（カメラ添付ファイル付き）を利用しています。

バイオフィルム（細胞外マトリックスに包まれ、表面に付着して形成された細胞コミュニティ）は、多くの細菌にとって一般的な生存様式である。...の中で

この手順の目的は、しわ状コロニー形成の経時的な発達を評価することにより、バイオフィルム形成の変化を特定し測定することです。まず、目的の細菌株を液体培地で培養します。次に、その培養液を栄養寒天培地にスポットします。次に、スポットを経時的に観察し、しわ状コロニー形成の開始を示す三次元構造が発達し始める時間を特定します。コロニー形態の発達は、それ以上の変化が見られなくなるまで観察します。最終的に、スポットの顕微鏡観察を用いて、特定の菌株による、あるいは特定の条件下でのバイオフィルム形成の経時的な違いを半定量的に示します。既存の手法に対する本手法の主な利点は、しわ状のコロニー形態の発達を利用して、細菌バイオフィルム形成の半定量的な解析が可能である点にあります。この方法はVireo fisheryにおけるバイオフィルム形成の知見を提供できるだけでなく、basc、slus、pseudomonas osa、vial choleraなどの他の細菌系におけるバイオフィルム表現型の特性解析にも応用可能です。私たちは、しわ状コロニー形成の発達に遅延を示す細菌変異体を同定した際に、初めてこの手法を着想しました。バイオフィルムの形成は、一般的に細胞密度と増殖速度の影響を受けます。したがって、しわ状のコロニー形態を評価する前に、目的の株の増殖速度と収量を測定し、増殖速度を確定させる必要があります。各株の吸光度（OD）の経時的な増加を測定し、増殖曲線をプロットして、収量または最終細胞数を決定してください。細胞平板塗布法を用いることができます。目的の細菌株を液体培養し、その後、培養液を希釈してアガープレートに塗布します。培養後、生存細胞数を算出し、ここに示すようにグラフで表します。コントロール群と目的の変異株との間で最も明確な差が現れる、最適なスポット条件を特定することも重要です。これを達成するため、異なる培地や温度などの様々な条件や、対数増殖期または定常期などの異なる増殖段階で液体培養した菌株をスポットする前に、様々な細胞密度の培養液を10 µLずつ適切な培地にスポットし、コロニーの形態が明確になるまで目的の温度で培養します。このようにして、特定の菌株セットや条件において、本手順を開始するための最適な開始ODを決定することができます。アガープレートからv Fisher眼細胞を、必要な抗生物質を含む5 mLのLB塩またはLBS培地に接種し、28 °Cで一晩振盪培養します。翌朝、細胞を新鮮なLBS培地5 mLに1:100の割合で希釈して継代し、細胞が目的のOD 600 nmに達するまで同条件で培養します。Vibrio fiiの場合、ODが約0.2の培養液からスポットを作成すると最良の結果が得られます。次に、各培養液を1 mLずつマイクロ遠心チューブに分注し、最大速度で遠心分離します。1分間遠心分離した後、上清を吸引して除き、ペレットを1 mLの滅菌済み70%人工海水またはSW遠心分離用溶液で再懸濁します。この洗浄ステップにより、残留した培地および細胞外成分が除去されます。遠心分離後、上清を除去し、洗浄したペレットを1 mLの70% SWで再懸濁して、各サンプルにOD₆₀₀で推定された細胞数が含まれていることを確認します。より高濃度のサンプルについては、70%A SWで希釈して必要な調整を行ってください。各培養液10 µLを、必要な抗生物質を含むLBSプレートにスポットします。ピペットをアガロース表面のわずか上の位置で指で保持し、斜めではなく垂直にスポットするように注意してください。スポットを均一に分散させるため、液体をゆっくりと排出してください。また、同じプレートに適切なポジティブコントロールとネガティブコントロールを含めてください。マイナープレートとしてしわ状コロニー形成を評価する場合、AFLの変異がバイオフィルムの発達に影響を及ぼす可能性があります。この手順で最も困難な点は、しわ状コロニー形成の開始時期を特定することです。場合によっては、発達が進んだ後でなければ判明しないことがあります。しわ状コロニー形成の開始時期を捉えるため、特定の時間枠内で1時間ごとにサンプリングを行います。これにより、形成開始後の比較検討も可能になります。スポット培養が均一に分散した状態を維持するため、プレートをインキュベーターに移動させる前にスポットを乾燥させ、プレートを倒置して28 °Cでインキュベートします。スポット培養の形態を評価する方法の一つにエンドポイントアッセイがあり、これはスポット後、あらかじめ設定した時点でしわ状コロニーの形成を評価するものです。これは、しわ状コロニーの形成を評価したエンドポイントアッセイの代表的な結果です。スポットから40時間後、左側にVibrio FIIの非バイオフィルム形成株、右側にバイオフィルム形成株が示されています。エンドポイントアッセイは、バイオフィルム形成に深刻な欠陥がある、またはあると想定される株に有用です。コロニー形態を評価するためのもう一つのアッセイはタイムコースアッセイであり、スポット後の時間を容易に追跡できるよう、スポット後一定期間にわたってしわ状コロニーの形成を評価します。タイマーをカウントアップに設定してください。本デモンストレーションでは、スポット接種から12～15時間後より、カメラ付き解剖顕微鏡を用いた画像取得および画像解析により、成長するスポットの形態を1時間ごとにモニタリングします。ソフトウェアプログラムを用いてコロニー形態を観察および記録し、しわ状コロニー形成の開始と進行を評価します。スポット培養の撮像前には、通常、最も鮮明な画像を得るためにペトリ皿の蓋を取り除きます。ここでは、透明なガラスステージを通して、冷光源を用いてスポットを下から照明し、上から画像をキャプチャします。Vibrio fischeriのコロニーは半透明であるため、このセットアップはしわ状コロニーの形成をイメージングするのに最適です。しわ状コロニーの形成を最適に可視化するには、形成中のバイオフィルムの三次元的な形態が判別できるよう、細菌コロニー下の照明強度と反射角の両方を調整してください。斑点状のコロニーと周囲の寒天背景とのコントラストが最も強くなる最適な照明条件を決定します。カメラ背面のレバーを使用して、実験全体を通して同じ倍率で画像を収集することが重要です。顕微鏡の接眼レンズからの視界をコンピュータ画面に切り替え、視野を調整し、適切に焦点を合わせてから画像をキャプチャします。しわ状コロニー形成の開始と進展を記録するために、適切な画像をキャプチャしてください。バイオフィルムのさらなる進展が見られなくなった時点で実験終了となります。得られた実験の最後に、各株または条件における時間経過に伴うパターンの発達を可視化するため、画像をまとめて図を作成します。接種からしわ状コロニーの形成が開始されるまでに、どのくらいの時間が経過したかを確認してください。しわ状コロニー形成の開始は、パターニングと3D構造の形成が最初に認められた時点と定義されます。この例では、上パネルに示されているバイオフィルム形成能を持つVibrio FIIのコントロール株において、バイオフィルム形成の開始が12時間で確認できます。下段のパネルには、しわ状コロニー形成の開始が4時間遅延し、接種後16時間からバイオフィルム形成が開始されるVibrio FII変異株の代表的な画像を示しています。40時間までの早い時点では、これらの株の間にわずかな差が見られますが、しわ状コロニー形成が開始された後の各時点においては、バイオフィルム形成の強度とパターンが同様であることに注目してください。しわ状コロニーの発達パターンを確認してください。構築プロセスは、パネルAに示されているように外側から内側に向かって進行する場合と、パネルBに示されているように内側から外側に向かって進行する場合があります。この評価法により、異なる菌株や異なる条件下で形成されたバイオフィルムを区別するメカニズムが提供されます。バイオフィルム形成のもう一つの半定量的な測定法として、成長するコロニーの直径の時間的な変化を利用する方法があります。上パネルに示すように、代表的なバイオフィルム形成能を有する菌株は、複雑さと直径が増大するコロニーを形成します。対照的に、下パネルに示されている別の菌株はバイオフィルムを形成しません。最後に、この図はコロニー径の経時的な増加をグラフで表したものです。同じ2つの菌株において、バイオフィルム形成能を持つ菌株は白丸で示されています。一方、バイオフィルムを形成しない株は黒い四角で示されています。この解析により、バイオフィルム形成能を持つコロニーのサイズは、バイオフィルム非形成コロニーよりも速い速度で増大し、最終時点では両者の間にほぼ2倍の差があることが明らかになりました。この手順を行う際は、各株を慎重にスポットすること、および各株の初期のしわ状コロニー形成を記録しておくことが重要です。本プロトコルに続き、バイオフィルム形成に関与するプロセスについてさらに詳細に検討するために、iCalアッセイやクリスタルバイオレット染色などの他の手法を実施することができます。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

アッセイは、細菌および真菌の早期のバイオフィルム形成を測定する迅速な手段を説明します。このメソッドは、微生物のバイオフィルム形成のための基層としてのマイクロタイタープレートを使用し、バイオフィルムは、クリスタルバイオレットの菌株を用いて可視化です。アッセイは、どちらかの初期のバイオフィルム形成のための定性的または定量的なアッセイを提供する。...

マイクロタイター皿のバイオフィルム形成アッセイ

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8ウェルチャンバースライドを用いたin vitro のバイオフィルム形成における

出典: Bucher, T.ら 、 『B. subtilisバイオフィルムを小分子バイオフィルム阻害剤の特徴付けモデルとして研究する方法論』。 J. Vis.

形態学的解析のための細菌バイオフィルムコロニーの準備

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バイオフィルム形成を評価するための固相接着アッセイ

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レプトスピラバイオフィルムの定量的、構造的、機能的分析のためのモジュール式ワークフロー

学ぶバイオフィルム形成の半定量評価法。しわコロニー発達を顕微鏡観察し、細菌株間のバイオフィルム発達差を時系列で評価する技術です。Vibrio属など多様な細菌系に応用可能です。

しわコロニーの開発を使用したバイオフィルム形成を評価するための半定量的アプローチ

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