しわコロニーの開発を使用したバイオフィルム形成を評価するための半定量的アプローチ

この手順の全体的な目標は、時間の経過とともにしわのあるコロニー形成の進行を評価することにより、バイオフィルム形成の変化を特定および測定することです。これは、液体培養で関心のある細菌株を最初に増殖させることによって達成されます。2番目のステップは、培養物を栄養寒天にスポットすることです。

次に、スポットを経時的に監視して、しわのあるコロニー形成の開始を示す3次元構造を発達させ始める時間を特定します。コロニー形態の発達は、それ以上の変化が視覚化されなくなるまで監視されます。最終的に、スポットの顕微鏡検査を使用して、特定の菌株または特定の条件下でのバイオフィルムの経時的な発達の違いを半定量的な方法で示します。

この手法が既存の方法よりも優れている点は、しわのあるコロニー形態の発達を利用して、細菌のバイオフィルム形成を半定量的に分析できることです。この方法は、ビレオ漁業におけるバイオフィルム形成に関する洞察を提供することができますが、basc、slus、pseudomonas osa、バイアルコレラなどの他の細菌系におけるバイオフィルム表現型の特性評価にも適用できます。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、しわのあるコロニー形成の発達を遅らせる細菌の変異体を特定したときでした。

バイオフィルムの形成は、一般に細胞密度と成長率の影響を受けます。したがって、しわのあるコロニーの形態を評価する前に、関心のある菌株の成長率と収量を決定して、成長率を決定する必要があります。各株の光学密度またはODの経時的な増加を測定し、成長曲線をプロットして、収量または最終的な細胞数を決定します。

細胞プレーティングアッセイを使用することができます。目的の細菌株を液体培養で増殖させ、培養物の希釈液を寒天プレートに播種します。インキュベーション後、生細胞の数を計算し、ここに示すようにグラフで表します。

また、コントロールと目的の変異体との間に最も明確な違いを明らかにする条件を見つけるための最良の条件を特定することも重要です。これを達成するために、異なる培地や温度などのさまざまな条件下で、また指数関数的または固定相などのさまざまな成長段階下で、液体培養中の増殖株を見つける前に、さまざまな細胞密度の10マイクロリットルの培養物を適切な培地にスポットし、コロニーの形態が明らかになるまで所望の温度でインキュベートしました。このようにして、特定のひずみまたは条件のセットに対する最適な開始ODを決定して、この手順を開始できます。

寒天プレートから5ミリリットルのLB塩または必要な抗生物質を含むLBS培地にVフィッシャーアイ細胞を接種し、翌朝に摂氏28度で一晩振とうしながらインキュベートし、5ミリリットルの新鮮なLBS培地に1〜100希釈して細胞にインキュベートし、細胞が600ナノメートルで所望のODに達するまで同じ条件下でインキュベートします。ビブリオfiiの場合、ODが約0.2の培養物からスポットが生成されると、最良の結果が得られます。次にピペットで、各培養物1ミリリットルをマイクロフージチューブに入れ、最高速度で遠心分離します。

1分間、吸引によってsupinateを取除き、無菌、70%人工海水またはSW遠心分離機の1ミリリットルにペレットを再懸濁します。細胞は、再び、この洗浄ステップは、残留培地および細胞外成分を除去する。遠心分離後、穿蔽液を取り出し、洗浄したペレットを1ミリリットルの70%A SWに再懸濁して、各サンプルに OD.At 600ナノメートルで推定される細胞数が含まれていることを確認します。

抗生物質を含むLBSプレートに、各培養物の10マイクロリットルである70%A SWスポットを追加でより濃縮したサンプルを希釈することにより、必要な調整を行います。寒天表面のすぐ上で指でピペットを観察し、斜めではなく垂直にスポットしてください。スポットを均一に分布させるために液体をゆっくりと排出し、同じプレートに適切なポジティブコントロールとネガティブコントロールを含めます。

しわのあるコロニー形成をマイナープレートとして評価する場合、AFLの変動はバイオフィルムの発達に影響を与える可能性があります。この手順の最も難しい側面は、しわのあるコロニー形成の始まりを特定することです。時には、開発が進んだ後に初めて明らかになることもあります。

しわのコロニー開発の開始を捉えるために、特定の時間枠内で1時間ごとの時点を取ります。これにより、開発が始まった後に戻って比較することもできます。斑点のある培養物が均一に分布するように、プレートをインキュベーターに移動する前にスポットを乾燥させ、プレートを反転させて摂氏28度でインキュベートします。

スポッティングカルチャーの形態を評価する1つの方法は、しわのあるコロニー形成とスポッティング後の所定の時点の評価を含むエンドポイントアッセイによるものです。これは、しわのあるコロニー形成が評価されたエンドポイントアッセイの代表的な結果です。スポッティングから40時間後、ビブリオFIIの非バイオフィルム形成株が左側に、バイオフィルム形成株が右側に示されています。

エンドポイントアッセイは、バイオフィルム形成において重大な欠陥を示す、または示すことが提案されている株に有用です。コロニーの形態を評価するための別のアッセイは、しわのあるコロニー形成がスポッティング後の一定期間にわたって評価され、スポッティング後の時間を簡単に追跡する時間経過アッセイである。カウントアップするタイマーをセットします。

このデモンストレーションでは、成長スポットの形態を1時間ごとに監視し、その後12〜15時間後に、カメラアタッチメントを使用して解剖スコープを見つけ、画像取得と画像分析を行います。ソフトウェアプログラムは、コロニーの形態を観察して文書化し、しわのあるコロニー形成の開始と進行を評価するために使用されます。斑点のある培養物をイメージングする前に、通常、最も鮮明な画像を得るためにペトリプレートの蓋を取り外します。

ここでは、冷たい光源を備えた透明なガラスステージを通じてスポットを下から照らし、上から画像をキャプチャします。この設定は、ビブリオフィッシャーアイコロニーが半透明であるため、しわのあるコロニーの発達のイメージングに最適です。しわのあるコロニーの発達を最もよく視覚化するには、発生中のバイオフィルムの3次元形態を識別できるように、バクテリアコロニーの下の照明強度と反射角度の両方を調整します。

斑点のあるコロニーと周囲の寒天の背景との間に最も強いコントラストを提供する最適な照明条件を決定します。カメラの背面にあるレバーを使用して実験全体で画像を収集するときは、同じ倍率を使用し、顕微鏡の接眼レンズからコンピューター画面にビューを切り替え、ビューを調整し、それに応じて焦点を合わせてから、画像をキャプチャし、しわのあるコロニー形成の開始と進行を記録するための適切な画像をキャプチャします。実験の終了は、バイオフィルムのさらなる発達がなくなったときに行われます。

取得した実験の最後に、画像を図に統合して、各ひずみまたは条件の経時的なパターン展開を視覚化します。接種からシワコロニー形成開始までの経過時間は、パターニングと3D構造の形成が最初に明らかになる時点で定義されるシワコロニー形成の開始に注目してください。この例では、バイオフィルム形成の開始は、上部パネルに描かれているビブリオFIIのバイオフィルムコンピテントコントロール株について12時間で明らかです。

下のパネルは、ビブリオFIIの変異株の代表的な画像で、シワのあるコロニー形成の開始に時間の経過とともに4時間の遅延を示し、バイオフィルム形成は接種後16時間で開始されます。これらの菌株間の微妙な違いは、40時間という早い時点で観察されますが、しわのあるコロニー形成の開始後の各時点でのバイオフィルム形成の強度とパターン化において、菌株は類似しているように見えることに注意してください。しわのあるコロニーの発達パターンに注意する必要があります。

アーキテクチャは、パネルAに示すように外側から内側に発展する場合もあれば、パネルBに示すように内側から外側に発展する場合もあります。バイオフィルム形成の2番目の半定量的測定は、時間の経過とともに発達中のコロニーのコロニー直径が変化することを利用します。上のパネルに示すように、代表的なバイオフィルムコンピテンス株が形成され、複雑さと直径が増加するコロニーが形成されます。

対照的に、下のパネルに示されている別の株はバイオフィルムを形成しません。最後に、この図は、時間の経過に伴うコロニー直径の増加をグラフで表したものです。同じ2つの株では、バイオフィルムコンピテンス株は白い円で表されます。

バイオフィルムを形成しない株は黒い四角で表されます。この分析により、バイオフィルムコンピテントコロニーのサイズはバイオフィルムネガティブコロニーよりも大きな速度で増加し、終了時点では、両者はほぼ2倍異なることが明らかになりました。この手順を実行する際には、各株を慎重に特定し、各株のスターターシワコロニー形成を文書化することを忘れないでください。

このプロトコルに従って、iCalアッセイまたは結晶ワイド染色などの他の方法を実行して、プロセスおよび関与するバイオフィルム形成に関する追加の質問に答えることができます。