しわコロニーの開発を使用したバイオフィルム形成を評価するための半定量的アプローチ

この手順の目的は、しわ状コロニー形成の経時的な発達を評価することにより、バイオフィルム形成の変化を特定し測定することです。まず、目的の細菌株を液体培地で培養します。次に、その培養液を栄養寒天培地にスポットします。

次に、スポットを経時的に観察し、しわ状コロニー形成の開始を示す三次元構造が発達し始める時間を特定します。コロニー形態の発達は、それ以上の変化が見られなくなるまで観察します。最終的に、スポットの顕微鏡観察を用いて、特定の菌株による、あるいは特定の条件下でのバイオフィルム形成の経時的な違いを半定量的に示します。

既存の手法に対する本手法の主な利点は、しわ状のコロニー形態の発達を利用して、細菌バイオフィルム形成の半定量的な解析が可能である点にあります。この方法はVireo fisheryにおけるバイオフィルム形成の知見を提供できるだけでなく、basc、slus、pseudomonas osa、vial choleraなどの他の細菌系におけるバイオフィルム表現型の特性解析にも応用可能です。私たちは、しわ状コロニー形成の発達に遅延を示す細菌変異体を同定した際に、初めてこの手法を着想しました。

バイオフィルムの形成は、一般的に細胞密度と増殖速度の影響を受けます。したがって、しわ状のコロニー形態を評価する前に、目的の株の増殖速度と収量を測定し、増殖速度を確定させる必要があります。各株の吸光度（OD）の経時的な増加を測定し、増殖曲線をプロットして、収量または最終細胞数を決定してください。

細胞平板塗布法を用いることができます。目的の細菌株を液体培養し、その後、培養液を希釈してアガープレートに塗布します。培養後、生存細胞数を算出し、ここに示すようにグラフで表します。

コントロール群と目的の変異株との間で最も明確な差が現れる、最適なスポット条件を特定することも重要です。これを達成するため、異なる培地や温度などの様々な条件や、対数増殖期または定常期などの異なる増殖段階で液体培養した菌株をスポットする前に、様々な細胞密度の培養液を10 µLずつ適切な培地にスポットし、コロニーの形態が明確になるまで目的の温度で培養します。このようにして、特定の菌株セットや条件において、本手順を開始するための最適な開始ODを決定することができます。

アガープレートからv Fisher眼細胞を、必要な抗生物質を含む5 mLのLB塩またはLBS培地に接種し、28 °Cで一晩振盪培養します。翌朝、細胞を新鮮なLBS培地5 mLに1:100の割合で希釈して継代し、細胞が目的のOD 600 nmに達するまで同条件で培養します。Vibrio fiiの場合、ODが約0.2の培養液からスポットを作成すると最良の結果が得られます。次に、各培養液を1 mLずつマイクロ遠心チューブに分注し、最大速度で遠心分離します。

1分間遠心分離した後、上清を吸引して除き、ペレットを1 mLの滅菌済み70%人工海水またはSW遠心分離用溶液で再懸濁します。この洗浄ステップにより、残留した培地および細胞外成分が除去されます。遠心分離後、上清を除去し、洗浄したペレットを1 mLの70% SWで再懸濁して、各サンプルにOD₆₀₀で推定された細胞数が含まれていることを確認します。

より高濃度のサンプルについては、70%A SWで希釈して必要な調整を行ってください。各培養液10 µLを、必要な抗生物質を含むLBSプレートにスポットします。ピペットをアガロース表面のわずか上の位置で指で保持し、斜めではなく垂直にスポットするように注意してください。スポットを均一に分散させるため、液体をゆっくりと排出してください。また、同じプレートに適切なポジティブコントロールとネガティブコントロールを含めてください。

マイナープレートとしてしわ状コロニー形成を評価する場合、AFLの変異がバイオフィルムの発達に影響を及ぼす可能性があります。この手順で最も困難な点は、しわ状コロニー形成の開始時期を特定することです。場合によっては、発達が進んだ後でなければ判明しないことがあります。

しわ状コロニー形成の開始時期を捉えるため、特定の時間枠内で1時間ごとにサンプリングを行います。これにより、形成開始後の比較検討も可能になります。スポット培養が均一に分散した状態を維持するため、プレートをインキュベーターに移動させる前にスポットを乾燥させ、プレートを倒置して28 °Cでインキュベートします。

スポット培養の形態を評価する方法の一つにエンドポイントアッセイがあり、これはスポット後、あらかじめ設定した時点でしわ状コロニーの形成を評価するものです。これは、しわ状コロニーの形成を評価したエンドポイントアッセイの代表的な結果です。スポットから40時間後、左側にVibrio FIIの非バイオフィルム形成株、右側にバイオフィルム形成株が示されています。

エンドポイントアッセイは、バイオフィルム形成に深刻な欠陥がある、またはあると想定される株に有用です。コロニー形態を評価するためのもう一つのアッセイはタイムコースアッセイであり、スポット後の時間を容易に追跡できるよう、スポット後一定期間にわたってしわ状コロニーの形成を評価します。タイマーをカウントアップに設定してください。

本デモンストレーションでは、スポット接種から12～15時間後より、カメラ付き解剖顕微鏡を用いた画像取得および画像解析により、成長するスポットの形態を1時間ごとにモニタリングします。ソフトウェアプログラムを用いてコロニー形態を観察および記録し、しわ状コロニー形成の開始と進行を評価します。スポット培養の撮像前には、通常、最も鮮明な画像を得るためにペトリ皿の蓋を取り除きます。

ここでは、透明なガラスステージを通して、冷光源を用いてスポットを下から照明し、上から画像をキャプチャします。Vibrio fischeriのコロニーは半透明であるため、このセットアップはしわ状コロニーの形成をイメージングするのに最適です。しわ状コロニーの形成を最適に可視化するには、形成中のバイオフィルムの三次元的な形態が判別できるよう、細菌コロニー下の照明強度と反射角の両方を調整してください。

斑点状のコロニーと周囲の寒天背景とのコントラストが最も強くなる最適な照明条件を決定します。カメラ背面のレバーを使用して、実験全体を通して同じ倍率で画像を収集することが重要です。顕微鏡の接眼レンズからの視界をコンピュータ画面に切り替え、視野を調整し、適切に焦点を合わせてから画像をキャプチャします。しわ状コロニー形成の開始と進展を記録するために、適切な画像をキャプチャしてください。バイオフィルムのさらなる進展が見られなくなった時点で実験終了となります。

得られた実験の最後に、各株または条件における時間経過に伴うパターンの発達を可視化するため、画像をまとめて図を作成します。接種からしわ状コロニーの形成が開始されるまでに、どのくらいの時間が経過したかを確認してください。しわ状コロニー形成の開始は、パターニングと3D構造の形成が最初に認められた時点と定義されます。この例では、上パネルに示されているバイオフィルム形成能を持つVibrio FIIのコントロール株において、バイオフィルム形成の開始が12時間で確認できます。

下段のパネルには、しわ状コロニー形成の開始が4時間遅延し、接種後16時間からバイオフィルム形成が開始されるVibrio FII変異株の代表的な画像を示しています。40時間までの早い時点では、これらの株の間にわずかな差が見られますが、しわ状コロニー形成が開始された後の各時点においては、バイオフィルム形成の強度とパターンが同様であることに注目してください。しわ状コロニーの発達パターンを確認してください。

構築プロセスは、パネルAに示されているように外側から内側に向かって進行する場合と、パネルBに示されているように内側から外側に向かって進行する場合があります。この評価法により、異なる菌株や異なる条件下で形成されたバイオフィルムを区別するメカニズムが提供されます。バイオフィルム形成のもう一つの半定量的な測定法として、成長するコロニーの直径の時間的な変化を利用する方法があります。上パネルに示すように、代表的なバイオフィルム形成能を有する菌株は、複雑さと直径が増大するコロニーを形成します。

対照的に、下パネルに示されている別の菌株はバイオフィルムを形成しません。最後に、この図はコロニー径の経時的な増加をグラフで表したものです。同じ2つの菌株において、バイオフィルム形成能を持つ菌株は白丸で示されています。

一方、バイオフィルムを形成しない株は黒い四角で示されています。この解析により、バイオフィルム形成能を持つコロニーのサイズは、バイオフィルム非形成コロニーよりも速い速度で増大し、最終時点では両者の間にほぼ2倍の差があることが明らかになりました。この手順を行う際は、各株を慎重にスポットすること、および各株の初期のしわ状コロニー形成を記録しておくことが重要です。

本プロトコルに続き、バイオフィルム形成に関与するプロセスについてさらに詳細に検討するために、iCalアッセイやクリスタルバイオレット染色などの他の手法を実施することができます。