腔内MCAOのマウスモデル：クレシルバイオレット染色による脳梗塞の評価

この手順の全体的な目標は、マウスの虚血性脳卒中を模倣することです。まず、総頸動脈は一時的に結紮されますが、外頸動脈は可能な限り遠位に永久に結紮されます。わずかにきつい別の一時的な縫合糸が分岐部の上のECAに配置されます。

2番目のステップは、出血を避けるためにリバースアクションピンセットを使用して内頸動脈をクランプすることです。次に、恒久的な合字と一時的な合字の間のECAを切断します。次に、シリコーンコーティングされたモノフィラメントをECAに導入します。

次に、ECAを反転させてモノフィラメントをICAに導入し、中大脳動脈の基部が含まれるようにします。1時間後、モノフィラメントを抜くことで血流が回復し、ヒトの血栓塞栓性爪の溶解後の血流の回復を模倣します。最終的に、T-M-C-A-Oの成功と梗塞の重症度を反映する神経学的欠損は、再灌流直後と再灌流後とは異なる時間で評価できます。

NIHのシアン画像ソフトウェアは、クレスタルバイオレットで染色された代表的な脳スライスの梗塞体積を計算するために使用されます。管腔内フィラメント技術を使用した一過性中大脳動脈閉塞術の主な利点の1つは、血流の回復を伴う患者の虚血性脳卒中を模倣することであり、マウスでのこの手順の開発は、標識遺伝学ツールを使用して標的タンパク質の役割を特定する可能性を提供します。脳卒中では、一過性中大脳動脈閉塞は、体重 22 グラムから 28 グラムの生後 C 57 黒 6 匹の雄マウスに対して行われます。

このプロトコルは、梗塞容積の再現性を高めるために、IRCM Bioethics Care Committeeによって承認されました。私たちは、Doco Corporationのリユーザブルな長さ12ミリメートル、6 OHシリコンコーティングモノフィラメントを使用しています。手術の2時間前。

マウス腹腔内にブプレノルフィンを0.03ミリグラム/キログラムの用量で注射します。.手順を開始するには、マウスに5%isofフッ素で麻酔をかけ、麻酔を2.5%ISOフッ素で維持し、手術中にマウスの体温を一定に保つために加熱パッドを使用し、マウスのシダの皮膚を70%エタノールまたはベタジンで消毒します。次に、首に正中線を切開し、実体顕微鏡で軟部組織を引き離します。

気管を露出させるために、マウスの首を鈍く解剖します。次に、筋肉を引っ込めて頸動脈を見つけます。周囲の組織から左総頸動脈を慎重に解剖します。

動脈の周りの20ミリメートルのセグメントにカットされた一時的な5 OHシルク縫合糸を配置します。迷走神経を傷つけないように注意してください。次に、左内総頸動脈またはICAと外部総頸動脈またはECAの分岐部を分離し、ECAの周囲にできるだけ遠位に永久縫合糸を配置します。

そして、分岐部の上のECAに別の一時的な縫合糸があります。次に、出血を防ぐために、リバースアクションピンセットを使用して左側のICAをクリップします。繰り返しになりますが、迷走神経を傷つけないように十分注意してください。

ECAとICAへの分岐点の前、および以前に配置された永久縫合糸と一時的な縫合糸の間に、ECAに小さな穴を開けます。次に、12ミリメートルの6 OHシリコンコーティングモノフィラメント縫合糸をECAに導入し、ECAを完全に切断し、モノフィラメントをICAに反転させます。出血を防ぐために縫合糸をしっかりと結び、リバースアクションピンセットを取り外します。

次に、モノフィラメントがMCAストップの基部を閉塞するまで、モノフィラメントをウィリスの円に導入します。ECAとCCAの分岐点を約9〜10ミリメートル超えて挿入されています。一般的に、モノフィラメントはブロックされ、移動できなくなります。

口蓋動脈を貫通しないように注意してください。フィラメントを所定の位置に固定するために、ECAに縫合糸をしっかりと結びます。次に、自動クリップ創傷閉鎖システムで皮膚を閉じます。

1ミリリットルの生理食塩水を皮下に注入し、閉塞後60分間にマウスを赤外線加熱ランプの下に置きます。前と同じようにマウスに麻酔をかけ、オートクリップを取り外し、ECAの縫合糸を少し開いて、モノフィラメントを引き出し、血液を再灌流できるようにします。次に、ECAの一時的な縫合糸を永久に結び付けて、失血を防ぎます。

ストロークの1時間後、モノフィラメントを引き出し、再利用のために保管します。次に、CCAの一時的な縫合糸を取り外して、血液が再循環できるようにします。傷口を閉じ、皮下投与します。

さらに1ミリリットルの生理食塩水をマウスに注入します。動物が動きやすいようになったことを確認したら、ケージに戻し、ケージの半分を加熱パッドに置いて、マウスが自分の環境を選択できるようにします。手術の12時間後、マウスはすべての偽手術のためにブプレノルフィンの別の用量を受け取ります。

手術後にモノフィラメントを挿入しないことを除いて、すべての手順は同じです。神経学的欠損は、T-M-C-A-Oの成功を確認し、その効率スコアを決定するために評価されます 1、24、48、および72時間後のマウスの神経学的欠損 灌流後 次のように6段階スケールで、ゼロは正常、1は軽度に等しく、尾に拾われたときに一貫性のないカールの有無にかかわらず回転します。50%以上が反対側にカールしようとします。

2つは、50%以上のマイルドで一貫したカールに相当し、反対側にカールしようとします。3つは、一貫性があり、強く、即時のカーリングに相当します。マウスは、カールした位置を1〜2秒以上保持します。

鼻が尻尾に届きそうになっている。4は激しいカーリングに相当します。歩いたり書いたりする反射神経の5のバレルの喪失に進行すると、昏睡状態またはマウンドに相当します。

PBS溶液による灌流後、脳をisop pentaneで素早く流し、マイナス80°Cで保存します。マウスの脳は、計画された免疫組織化学研究によっては、4%パラホルムアルデヒドでも灌流される可能性があることに注意してください。次に、クライオスタットを使用して、30枚のスライドを使用して17ミクロンの冠状脳切片を切断します。

30個ごとに1つのセクションを同じスライドに配置します。次に、最初と15番目のスライドをクレスタルバイオレットで染色します。より正確な傷害量の推定のためには、NIHのScion画像などの画像解析システムを使用して、左脳半球と右脳半球に白く見える梗塞領域である病変デリを評価します。

このD制限をすべての脳スライスで繰り返します。梗塞の体積を任意の単位で計算し、それらを各セクションの反対側の非病変領域のパーセンテージとして表します。他のスライドは、免疫組織化学研究のために摂氏マイナス80度に保ちます。

ニューロスコアの評価は、私が管腔内処置を受けた際に T-M-C-A-O が成功したことを確認しています。ここで見られるように、一貫した、強く、中間のカールが観察され、マウスは鼻が尾にほぼ届く状態で1〜2秒以上カールした位置を保持します。私たちの実験では、すべてのマウスが少なくとも軽度の一貫したカールを示し、これはテスト期間を通じて2の神経スコアに相当します。

クレッセルバイオレット染色は、脳梗塞の程度を評価するために行われました。ここに示されているT-M-C-A-Oに続いて、再灌流後72時間後にクレストバイオレットで染色されたマウス脳の代表的な冠状切片。梗塞領域、主に線条体と皮質、および隣接する脳領域とラベル付けされた領域は、稜に汚れていないため、白く見えます。

ここに示されている紫色は損傷体積であり、これは右半球の白い部分であり、左半球の反対側の非病変領域の割合として表されます。虚血性脳卒中後のC 57黒色6雄マウスの梗塞容積は、非リーシュ半球の約70%を占めている。この手順により、病変の再現性が高くなります。

このビデオを見た後、マウスで一過性脳虚血性脳卒中を実行する方法についてよく理解しているはずです。さらに、実際の脳の体積を測定するクイズバイオルアプローチは、免疫化学によって関連するマーカーをテストするための多くの材料を持っているという大きな利点を提供します。ご覧いただきありがとうございます、そして実験の頑張りを祈ります。