Name: 腔内MCAOのマウスモデル：クレシルバイオレット染色による脳梗塞の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: 学ぶマウスにおける一過性脳虚血モデルの確立方法。シリコン被覆モノフィラメントを用いた腔内MCAO法とクレシルバイオレット染色による脳梗塞評価を解説。神経学的スコアリングと遺伝学的ツールを活用した脳卒中研究に有用です。

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本研究では、CIHRチームグラント＃82946のCTP、CIHR助成＃102741、MOP、ならびにカナダの椅子＃216684とストラウス財団によってサポートされていました。 ERは、カナダのハート＆ストローク財団からフェローシップによってサポートされていました。

一過性中大脳動脈閉塞（MCAO） 1。手術の手順（ 図1） 一過性中大脳動脈閉塞（tMCAO）が2日に行われる - 3ヶ月の雄のC57BL / 6マウス（22〜28グラム）まで。このプロトコルは、IRCM生命倫理委員会の動物のケアにより承認された。手術器具はオートクレーブ（60分、15 psiで121°C）で滅菌した。それぞれの動物の間に、彼らは熱いビーズ滅菌器（15秒）を使用して滅菌した。手術テーブルと他の機器を70％エタノールを用いて消毒されています。 手術2時間前に、マウスをブプレノルフィン（0.03 mg / kgでbwip）でanalgesizedた。 図1A。 <ol><li>深くイソフルラン5％のマウスをanaesthetizeその後イソフルラン2.5％で麻酔を維持している。マウスの体温は、加熱パッドを備えた手術中に一定に保たれる。 </li><li>毛皮やSKを消毒70％エタノールまたはベタジンとインチシェービングは、脳卒中病態に影響を与える可能性があり毛髪断片リリース、microabrasionsや炎症を生成するので、我々は、マウスの毛皮を剃っていません。 </li><li>正中頸部切開を加え、穏やかに軟組織を引き離す。 </li><li>ステレオ顕微鏡（STEMI 2000、ツァイス）の下では、鈍的切開、気管を露出し、頸動脈を見つけるために筋肉を撤回するために実行されます。 </li><li>左総頸動脈（CCA）を慎重に周囲の組織から解剖され、CCAは、一時的に20ミリメートルのセグメントに5から0絹縫合糸のカットを使用して、一時的な縫合（1）で閉塞されています。細心の注意が迷走神経を害しないよう注意が必要である。 </li><li>左内総頸動脈（ICA）と外部の総頸動脈（ECA）の分岐を分ける。永久的な縫合糸（2）のように遠位になるべく、ECAの周囲に配置されており、ややタイトな別の一時的な縫合（3）から遠位ECAの上に置かれる分岐。 </li><li>出血を避けるために逆作用ピンセットを使用して、左のICA（4）クリップ。細心の注意が迷走神経を害しないよう注意が必要である。 </li><li>永久的な（2）と一時的な（3）縫合糸の間にECA（5）に小さな穴を開けます。 </li></ol>図1B。 <ol start="9"><li> 、12ミリメートル、長さ6から0シリコン被覆（9-10mm程度被覆したシリコンです）ECA（6）にモノフィラメント縫合糸（Doccol株式会社）を導入し、完全に永久的な縫合糸の遠位にECAをカットし、ICAにオクルダーを反転。縫合糸は、しっかりと出血を防ぐためにモノフィラメントの周り縛られ、逆作用ピンセットは削除されます。 </li><li>オクルダーはウィリス動脈輪におけるMCAの起点を閉塞するために導入される。 ECAとCCAの分岐を越えて9〜10ミリメートルの周りにその挿入を停止します。オクルーダは遮断され、もはや移動することはできません。ケアは、翼口蓋動脈を貫通していない注意しなければなりません。 ECAの縫合（3）TIGですhtly位置にモノフィラメントを修正するために接続されています。 </li><li> autoclip創傷閉鎖システムで皮膚を閉じます。 </li><li>皮下に生理食塩水の1ミリリットルを注入し、すべての閉塞後期間（60分）の間、赤外線加熱ランプの下にマウスを置きます。 </li></ol> 2。中大脳動脈の血流の回復 reanesthesia前に、neuroscoreは、手術の成功を評価するためにチェックすることができます。 <ol><li>前述のようにマウスを麻酔し、オートクリップを取り外します。 </li><li>少しモノフィラメント撤退や血液灌流を可能にするためのECAに縫合（3）を開きます。 </li><li>永久に失血を防ぐために、ECAの一時的な縫合糸を結紮する。モノフィラメントは再使用のために保持されます。 </li><li>血液の循環を可能にするために、CCAへの一時的な縫合（1）を取り外します。 </li><li>傷口を閉じます。マウスは、皮下に別の1ミリリットル生理食塩水を受けるべきである。 </li><li> 1時間赤外線加熱ランプ下でマウスを置きます。動物は移動性を取り戻していることを確認した後、マウスをそのケージに戻され、72時間加熱パッドとタオルの下に残しました。ケージの半分だけがマウスは自分の環境を選択できるように加熱パッド上に配置されることに注意してください。手術後の体重減少は、一般的に観察されているので、マッシュポテト食べ物は食べ奨励するペトリ皿に置かれます。 十二時間後に手術、マウスは、ブプレノルフィン（0.03 mg / kgでbwip）の別の投与を受けた。 </li></ol> 3。偽手術偽の操作は、すべての手順がオクルーダーが挿入されていないことを除いて同一である。 4。 Neuroscore 神経障害は、単に再灌流後tMCAOの成功の評価を可能にし、後で傷害の重症度の推定。前述のように神経学的欠損は、5 &lt;を採点される/ sup&gt;の、1、24、48および72時間後に再灌流に出演。拡張された6点スケールは使用されています： <ul><li> 0：正常。 </li><li> 1：軽度の尾が拾うとき、または矛盾した回転せずに動作を旋回、対側に回転させるための&lt;50％の試み。 </li><li> 2：軽度の旋回、一貫性のある反対側に回転させるための&gt; 50％の試み。 </li><li> 3：強力な一貫性と旋回即時、マウスはその鼻がほぼその尾に達して、以上の1〜2秒の回転位置を保持しています。 </li><li> 4：バレルに進んで深刻な回転、反射を歩いたり、立ち直りの損失。 </li><li> 5：昏睡状態または瀕死。 </li></ul> 5。クレジルバイオレット染色（ 図2） PBS溶液灌流後、脳を素早くイソペンタン中で凍結されており、-80℃で保存C.マウスの脳はまた、計画された免疫組織化学の研究に応じて4％パラホルムアルデヒド（PFA）で灌流することができる。冠状脳切片（17μm）のクライオスタット·カットが実行されます。すべての30の1つのセクションのうち、代表的な脳損傷を持っているために、同じスライド上で収集されます。ボリュームの定量のために、2スライドはクレシルバイオレット染色によって染色されており、画像解析システム（サイオン社、フレデリック、メリーランド州）は病変を評価するために使用されていました。傷害ボリュームは任意の単位（ピクセル）で計算され、各セクションの反対側の非病変領域の割合として表した。他のスライドは、免疫組織化学的研究のために-80℃に保たれている。あるいは、PFA固定脳はビブラトームととしてHan ら （2009）6が推奨する測定梗塞体積を用いて30から50μmでカットすることができます。

<ol><li>Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+studies+of+ischemic+brain+edema%2C+I%3A+a+new+experimental+model+of+cerebral+embolism+in+rats+in+which+recirculation+can+be+introduced+in+the+ischemic+area%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn.+J.+Stroke%22%5BJournal%5D)">Experimental studies of ischemic brain edema, I: a new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area.</a> Jpn. J. Stroke. 8, 1-8 (1986).</li>
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</ol>

著者らは、開示することは、競合する利害関係はありません。 この記事への生産とフリーアクセスがツァイス社が主催している

異なるストロークモデルは患者の脳卒中の影響を模倣するために開発されてきた。ストロークモデルの選択は、生物学的な問題に応じて異なります。腔内MCAOモデルは、患者における虚血性脳卒中の最も一般的なタイプのいずれかを模倣し、田村モデル4,7と比較して低侵襲、より一貫性があります。それは、神経保護、neurorepairと細胞死の解析のための本当に興味深いモデルです。腔内モデルの成功は、制御されなければならないような動物の性別、年齢、体重、体温、麻酔や手術の時のような多くの要因に依存します。オクルーダ（先端径、長さ、形状及びfexibility）の物理的な礼儀はMCAO 4の整合性を保つために重要です。ここで、我々はDoccolコーポレーション9〜10ミリメートル上にシリコンでコーティングされた12ミリメートル、長さ6から0モノフィラメントを使用しています。その長さはすべてのICAを覆ったので、このモノフィラメントの大きな利点は、くも膜下出血を減少させることであると長さは、ウィリスとPPAのサークルの前部と後部の通信動脈から来る残留血流が防止及び梗塞体積が減少する（我々の手の変動の15％）8の変動しています。 CCAの縫合も梗塞容積9の変動を減少させます。 tMCAO後の脳損傷の程度は様々な方法によって評価することができる。前述したように神経学的欠損を測定することができます。しかし、それはこのようにすることで、効率的な対策を持っていることは困難である。梗塞の範囲は、一般的にTTC染色によって実行されます。さらに最近では、磁気共鳴技術はまた、神経保護治療のために特に興味深い技術を使用しています。そのようなneurorepair、細胞死や細胞増殖、脳卒中に関与基礎細胞のメカニズムを理解するために、免疫組織化学によって異なるマーカーの研究は重要で非常に有益です。したがって、我々のprotoc脳切片標本のOLは、これらの分析を可能にするという大きな利点を持っており、使用したマウスの数を最小限に抑えます。また、Tureyen ら 10クレシルバイオレット染色とTTCとの間に良好な相関関係があることが報告されています。

<table border="1"&gt;<tr&gt;<td<strong&gt;説明</strong</td&gt;<td<strong&gt;会社概要</strong</td&gt;<td<strong&gt;カタログ番号</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;ステレオ顕微鏡</td&gt;<td&gt;ツァイス</td&gt;<td&gt; STEMI 2000</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;ファイバーライト高輝度イルミ</td&gt;<td&gt;ドーラン - ジェナー工業株式会社</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<tdイソフルラン用&gt;麻酔システム</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;イソフルラン</td&gt;<td&gt; CDMV</td&gt;<td&gt; 108737</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;暖房ブランケット</td&gt;<td&gt; Gaymar Medsearch</td&gt;<td&gt; TP22G</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;赤外線加熱ランプ</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;超微細なピンセット、スタイル5</td&gt;<td&gt;電子顕微鏡学</td&gt;<td&gt; 78320-5TI</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Vannasはさみ3ミリメートルのCutting Edge、ストレート</td&gt;<td&gt;電子顕微鏡学</td&gt;<td&gt; 72932から01</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;スタイルLA-1およびMPF-1すべての滑らかなブレード</td&gt;<td&gt;電子顕微鏡学</td&gt;<td&gt; 77926-5S</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;ネガティブな作用ピンセット、スタイルKOPINC 5</td&gt;<td&gt;電子顕微鏡学</td&gt;<td&gt; 72850-F</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<tdストレート&gt;解剖ハサミ5 1/2 &quot;</td&gt;<td&gt; Cedarlane</td&gt;<td&gt; 72960</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Autoclipスターターセット</td&gt;<td&gt;ハーバード装置</td&gt;<td&gt; 34から0557</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; BD Autoclipは閉会ブローネを巻いた。、9mmの長い、100個</td&gt;<td&gt;フィッシャー</td&gt;<td&gt; 01-804-5</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 5から0縫合</td&gt;<td&gt;ハーバード装置</td&gt;<td&gt; 517763</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;縫合材料のPDS IIのモノフィラメントバイオレット、5-0、RB-1; Z303H</td&gt;<td&gt; CDMV</td&gt;<td&gt; 6167</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 12ミリメートル、長さ6から0、シリコンコーティングされたモノフィラメント縫合糸</td&gt;<td&gt; Doccol株式会社</td&gt;<td&gt; 60SPRePK5</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Seringes 1ミリリットル</td&gt;<td&gt;フィッシャー</td&gt;<td&gt; 14-823-2F</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;針26G1 / 2</td&gt;<td&gt;フィッシャー</td&gt;<td&gt; BD-305111</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td<em&gt; C57BL / 6</em&gt;マウス</td&gt;<td&gt; IRCM</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;</table

腔内mcaoのマウスモデル：クレシルバイオレット染色による脳梗塞の評価

Mouse Model of Intraluminal MCAO: Cerebral Infarct Evaluation by Cresyl Violet Staining

脳卒中は死亡率と世界の障害の主要な原因の3番目の原因である。すべてのストロークの約80％、虚血性脳卒中を占めています。しかし、血栓溶解組織プラスミノーゲンアクチベーター（tPA）が存在する急性虚血性脳卒中の唯一の治療法です。これは、研究者は、様々な種のいくつかの虚血性脳梗塞モデルを開発するために導いた。齧歯類モデルの2つの主要なタイプが開発されている：全脳虚血または限局性脳虚血のモデル。患者における虚血性脳卒中を模倣するために、誰に約80％の血栓または塞栓性脳卒中が中大脳動脈（MCA）の領土で発生し、管腔内中大脳動脈閉塞（MCAO）モデルでは、脳卒中の研究に大いに関係があります。このモデルは第一小泉らがラットで開発された、1986年1インチそのため、マウスにおける遺伝子操作のしやすさのために、これらのモデルは、この種の2-3に開発されてきた。 このような先端径、長さ、形状、柔軟性などオクルダーの物性は梗塞容積4の再現のために重要であることをコンテンツ&quot;&gt;ここで、我々はC57/BL6マウスにおける過渡MCA閉塞手順を紹介します。これまでの研究で報告されています。ここで、商用シリコンコーティングされたモノフィラメント（Doccolコーポレーション）が使用されている。もう一つの大きな利点は、このモノフィラメントは、くも膜下出血を誘発する危険性を減少させるということです。ツァイスステレオ顕微鏡STEMI 2000を使用し、シリコンコーティングされたモノフィラメントは内頚動脈に導入されました（ICA）を外頸動脈（ECA）のカット経由モノフィラメントは、MCAのベースを閉塞するまで血流は血栓塞栓症における血栓の溶解後の血流の回復を模倣するためにモノフィラメントを除去して1時間後に復元されました人間。脳梗塞の範囲は、神経学的スコアにより、梗塞体積の測定によって最初に評価することができる。虚血マウスは、このように異なる後再灌流時々彼らの神経学的スコアを分析した。 2,3,5 - トリフェニルテトラゾリウムクロライド（TTC）で染色し、梗塞体積を評価するために通常行われた。それは免疫組織化学によって多くの重要なマーカーをテストする機会を提供していますのでここで、我々はクレシルバイオレット染色を使用していました。このビデオでは、MCAO手順を報告し、神経学的スコアとクレシルバイオレット染色による梗塞体積の評価。

neuroscore評価がtMCAO脳卒中後の成功を確認しtMCAO後再灌流の効率を決定する。我々の手では、すべてのマウスは、少なくとも軽度の一貫カーリング（neuroscore 2）、神経障害、最大72時間まで、一般的に安定している提示腔内手続きを行った。ほとんどのマウスは、軽度の一貫カーリング（neuroscore 2）を示す。カーリングの不在を示すマウスは研究から除外されます。しかし、neuroscoreの評価は、私たちは負傷した海馬とそのまま海馬とのそれらを持つマウスを区別することはできません。 死亡例は、くも膜下出血が発生しなかったことを示唆し、手術日の間に観察されなかった。くも膜下出血は、マウスで同定されている場合、このいずれかを系統的に分析から除外されます。自宅に準備モノフィラメントよりスムーズですDoccol株式会社からシリコンコーティングされたモノフィラメントの使用はの成功を増加させるtMCAOとくも膜下出血を減らすことができます。 24時間と72時間の間での死亡率は、一般的に咬合の60分間報告したように、このモデルでは14％です。観察された死亡率は、おそらくこのマウス系統の大梗塞体積が原因です。強い病変の再現性もその効果（s）は、モデルのばらつきによって隠される可能性が神経保護分子を勉強することは非常に興味深いものである（標準偏差が15％）が観察されている。 tMCAO後の脳損傷の程度を評価するために、我々は、関連するマーカー6をテストするための材料の多くを持っているために、むしろTTCよりクレシルバイオレット染色（ 図2）を使用することにしました。病変の程度は比較的一貫している。しかし、我々はいくつかのマウスでは、海馬が（マウスの約30％）負傷したことに気づいた。これは、クレシルバイオレット染色は後1週間まで適用可能であることは興味深いことです。文献では、脳梗塞の割合が1から変化お互いに勉強しています。それは、マウス系統、麻酔、脳切片の厚さ、使用モノフィラメント、または6、7を使用し染色の選択に依存します。 <img src="/files/ftp_upload/4038/4038fig1.jpg" alt="図1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4038/4038fig1highres.jpg" /> 図1。シリコン被覆管腔内モノフィラメントを用いて中大脳動脈の閉塞のスキーム。マウス脳とシリコンコーティングされたモノフィラメントの導入を準備するために連続した縫合糸およびクリップを示す脳動脈の簡略化した方式を採用しています。B.は、ウィリス動脈輪を介してモノフィラメントの位置が表されます。ますが、BA、脳底動脈、、CCA、総頸動脈、C.ウィリス、ウィリスのサークル、モノフィラメントは、MCA、ACA、前大脳動脈の根元を閉塞するECA を介してのICAに導入され、ECA、外頸動脈アルテRY、ICA、内頚動脈、MCA、中大脳動脈、PCAは、後交通動脈、PPAは、翼口蓋動脈。 <img src="/files/ftp_upload/4038/4038fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。 72時間後の再灌流後クレシルバイオレットで染色したマウスの脳の代表的な冠状断面。梗塞領域（主に線条体、皮質と隣接する脳領域）（クレシルバイオレットで染色さ）白で表示されます。傷害ボリューム（白い部分、右半球）が区切りだったと反対側の非病変領域（左半球）の割合として表される。

マウスにおける腔内中大脳閉塞モデルは、本明細書に提示されます。脳梗塞の程度は、神経学的スコアとクレジルバイオレット染色は、TTCに代わる染色、並列多くの関心マーカーでテストする大きな利点を提供することによって評価されます。

腔内MCAOのマウスモデル：クレシルバイオレット染色による脳梗塞の評価

脳卒中は世界における死因の第3位であり、障害の主要な原因となっています。全脳卒中の約80%を虚血性脳卒中が占めています。...

本手順の全体的な目的は、マウスにおいて虚血性脳卒中を模倣することである。まず、総頸動脈を一時的に結紮し、外頸動脈は可能な限り遠位側で永久結紮する。さらに、分枝点より上方の外頸動脈に、わずかに締め付けた状態で別の一次結紮を施す。第2のステップは、出血を防ぐためにリバースアクションピンセットを用いて内頸動脈をクランプすることです。次に、恒久的結紮糸と一時的結紮糸の間で外頸動脈を切断します。続いて、シリコンコーティングされたモノフィラメントを外頸動脈に挿入します。その後、ECAを反転させ、中大脳動脈の基部を含むまでICAにモノフィラメントを挿入します。1時間後、モノフィラメントを除去して血流を再開させ、ヒトにおける血栓塞栓性の血栓溶解後の血流再開を模倣します。最終的に、T-M-C-A-Oの成功と梗塞の重症度を反映する神経学的欠損を、再灌流直後および再灌流後の異なる時点で評価することができます。NIHのCyanイメージソフトウェアを使用して、クレシルバイオレットで染色した代表的な脳切片の梗塞体積を算出します。管腔内フィラメント法を用いた一過性中大脳動脈閉塞の主な利点の一つは、血流の再開を伴う患者の虚血性脳卒中を模倣できることであり、この手法をマウスで展開することで、標的タンパク質の役割を特定するための遺伝学的ラベルツールを利用できる可能性があります。脳卒中モデルにおいて、一過性中大脳動脈閉塞は、体重22から28 gの2〜3ヶ月齢の雄性C 57 black sixマウスを用いて実施されます。このプロトコルは、梗塞体積の再現性を高めるため、IRCMバイオエシックスケア委員会の承認を受けています。Doco Corporation製の、長さ12 mm、6-0シリコンコーティングモノフィラメントを再利用して使用します。手術の2時間前に。マウスにブプレノルフィンを0.03 mg/kgの用量で腹腔内投与します。処置を開始するために、5% isof fluorineでマウスを麻酔し、2.5% ISO fluorineで麻酔を維持します。手術中はヒーティングパッドを使用してマウスの体温を一定に保ち、マウスの皮膚を70% ethanolまたはベタジンで消毒します。その後、頸部正中線に切開を加え、実体顕微鏡下で軟部組織を剥離します。マウスの頸部を鈍的に切開し、気管を露出させます。次に、筋肉を牽引して総頸動脈を確認します。周囲の組織から左総頸動脈を慎重に剥離します。20 millimeterに切断した5-0シルク縫合糸を、動脈の周囲に一時的に留置します。この際、迷走神経を損傷しないよう注意してください。次に、左内頸動脈（ICA）と外頸動脈（ECA）の分岐部を分離し、ECAの可能な限り遠位側に永久的な縫合糸を留置します。次に、分岐点より上方のECAに別の暫定的な結紮を行います。その後、出血を避けるため、リバースアクションツイーザーを用いて左ICAをクリップします。ここでも、迷走神経を損傷しないよう十分に注意してください。外頸動脈（ECA）の分枝点より手前で、かつ先に配置した永久結紮糸と一時結紮糸の間に、小さな穴を開けます。次に、12 mmの6-0シリコンコーティング・モノフィラメント縫合糸をECAに挿入してECAを完全に切断し、モノフィラメントを内頸動脈（ICA）側へと反転させます。出血を防ぐために縫合糸をきつく結び、リバースアクションピンセットを取り除きます。次に、モノフィラメントをウィリス動脈輪に挿入し、中大脳動脈（MCA）の基部を閉塞させます。挿入深さは、外頸動脈（ECA）と総頸動脈（CCA）の分枝点から約9〜10 mm先までとします。通常、モノフィラメントが突き当たり、それ以上進まなくなります。口蓋動脈を貫通させないよう注意してください。フィラメントを固定するため、外頸動脈（ECA）の結紮をしっかりと行います。最後に、オートクリップ創閉鎖システムを用いて皮膚を閉じます。生理食塩水1 mLを皮下注射し、閉塞後期間である60分間、マウスを赤外線加熱ランプの下に置きます。前述と同様にマウスを麻酔し、オートクリップを取り除いてECAの縫合糸をわずかに緩め、モノフィラメントを抜去して血流を再灌流させます。その後、出血を防ぐためにECAの一時的な縫合糸を永久的に結紮します。脳卒中誘発から1時間後、モノフィラメントを抜去し、再利用のために保管します。次に、血流を再開させるため、総頸動脈（CCA）の暫定的な結紮を解除します。その後、創部および皮下組織を縫合して閉じます。マウスに生理食塩水をさらに 1 mL 注射します。動物の可動性が回復したことを確認した後、ケージに戻し、ケージの半分をヒーティングパッドの上に置いて、マウスが環境を選択できるようにします。手術から 12 時間後、すべてのシャム手術個体にブプレノルフィンを再度投与します。術後にモノフィラメントを挿入しない点を除き、すべての手順は同一である。T-M-C-A-Oの成功を確認し、その効率スコアを決定するために神経学的欠損を評価する。灌流後1、24、48、72時間におけるマウスの神経学的欠損を、以下の6段階のスケールで判定する。0は正常、1は軽度であり、尾を持って持ち上げた際に、不規則な回転を伴うか、または伴わない回転が見られる。50%以上の試行で対側への回転を試みる。2は、50%以上の試行において対側への軽度で一貫したカールが見られる状態とする。3は、一貫して強力かつ即座にカールが生じる状態とする。マウスがカールした姿勢を1〜2秒以上保持することを条件とする。鼻がほぼ尾に届いている状態。4は重度の丸まり（curling）に相当する。さらに進行して、歩行反射や書き込み反射が消失するバレル状（barreling）となり、5は昏睡または盛り上がり（mound）の状態に相当する。PBS溶液で灌流した後、脳をイソペンタンで速やかに凍結させ、-80°Cで保存します。計画している免疫組織化学研究に応じて、マウスの脳を4%パラホルムアルデヒドで灌流させる場合があることに注意してください。次に、クライオスタットを用いて、30枚のスライドを使用し、17µmの冠状断脳切片を作成します。30切片ごとに1枚のスライドに配置します。次に、1枚目と15枚目のスライドをクリスタルバイオレットで染色します。より正確な損傷体積の推定を行うために、NIHのScion imageなどの画像解析システムを用いて、左右の大脳半球で白く見える梗塞領域である病変部位を評価します。すべての脳切片に対して、このDの制限を繰り返します。梗塞体積を任意単位で算出し、各切片について対側非病変領域に対する割合（％）として表します。その他のスライドは、免疫組織化学研究のために−80 °Cで保存してください。神経スコア評価により、管腔内処置を施した被験個体においてT-M-C-A-Oが成功したことが確認されます。ここで見られるように、一貫した強い、あるいは中程度の curling（体が丸まる動作）が観察され、マウスは鼻がほぼ尾に届く状態で1〜2秒以上丸まった姿勢を維持します。本実験では、すべてのマウスに少なくとも軽度の一貫した curling が認められ、これは試験期間中を通じて神経スコア2に相当します。脳梗塞の範囲を評価するために、クレッセルバイオレット染色を行いました。ここに示すT-M-C-A-O後、再灌流から72時間経過したマウス脳の代表的な冠状断切片をクレッセルバイオレットで染色しました。ラベル付けされた梗塞領域（主に線条体、皮質、および隣接する脳領域）は、クレッセルで染色されないため白く現れます。ここに示されている紫色の部分は損傷体積であり、右半球の白い部分を対側の左半球の非病変領域に対する割合（%）として表したものです。虚血性脳卒中後のC 57 black six雄マウスにおける梗塞体積は、非病変半球の約70%に相当します。この手法により、高い病変再現性が得られます。このビデオを視聴することで、マウスにおける一過性脳虚血モデルの作製方法について十分に理解できたはずです。さらに、梗塞体積を測定するためのquiz violアプローチは、免疫化学的に関連マーカーを検査するための材料を大量に確保できるという大きな利点があります。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。

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