腔内MCAOのマウスモデル：クレシルバイオレット染色による脳梗塞の評価

本手順の全体的な目的は、マウスにおいて虚血性脳卒中を模倣することである。まず、総頸動脈を一時的に結紮し、外頸動脈は可能な限り遠位側で永久結紮する。さらに、分枝点より上方の外頸動脈に、わずかに締め付けた状態で別の一次結紮を施す。

第2のステップは、出血を防ぐためにリバースアクションピンセットを用いて内頸動脈をクランプすることです。次に、恒久的結紮糸と一時的結紮糸の間で外頸動脈を切断します。続いて、シリコンコーティングされたモノフィラメントを外頸動脈に挿入します。

その後、ECAを反転させ、中大脳動脈の基部を含むまでICAにモノフィラメントを挿入します。1時間後、モノフィラメントを除去して血流を再開させ、ヒトにおける血栓塞栓性の血栓溶解後の血流再開を模倣します。最終的に、T-M-C-A-Oの成功と梗塞の重症度を反映する神経学的欠損を、再灌流直後および再灌流後の異なる時点で評価することができます。

NIHのCyanイメージソフトウェアを使用して、クレシルバイオレットで染色した代表的な脳切片の梗塞体積を算出します。管腔内フィラメント法を用いた一過性中大脳動脈閉塞の主な利点の一つは、血流の再開を伴う患者の虚血性脳卒中を模倣できることであり、この手法をマウスで展開することで、標的タンパク質の役割を特定するための遺伝学的ラベルツールを利用できる可能性があります。脳卒中モデルにおいて、一過性中大脳動脈閉塞は、体重22から28 gの2〜3ヶ月齢の雄性C 57 black sixマウスを用いて実施されます。

このプロトコルは、梗塞体積の再現性を高めるため、IRCMバイオエシックスケア委員会の承認を受けています。Doco Corporation製の、長さ12 mm、6-0シリコンコーティングモノフィラメントを再利用して使用します。手術の2時間前に。

マウスにブプレノルフィンを0.03 mg/kgの用量で腹腔内投与します。処置を開始するために、5% isof fluorineでマウスを麻酔し、2.5% ISO fluorineで麻酔を維持します。手術中はヒーティングパッドを使用してマウスの体温を一定に保ち、マウスの皮膚を70% ethanolまたはベタジンで消毒します。その後、頸部正中線に切開を加え、実体顕微鏡下で軟部組織を剥離します。

マウスの頸部を鈍的に切開し、気管を露出させます。次に、筋肉を牽引して総頸動脈を確認します。周囲の組織から左総頸動脈を慎重に剥離します。

20 millimeterに切断した5-0シルク縫合糸を、動脈の周囲に一時的に留置します。この際、迷走神経を損傷しないよう注意してください。次に、左内頸動脈（ICA）と外頸動脈（ECA）の分岐部を分離し、ECAの可能な限り遠位側に永久的な縫合糸を留置します。

次に、分岐点より上方のECAに別の暫定的な結紮を行います。その後、出血を避けるため、リバースアクションツイーザーを用いて左ICAをクリップします。ここでも、迷走神経を損傷しないよう十分に注意してください。

外頸動脈（ECA）の分枝点より手前で、かつ先に配置した永久結紮糸と一時結紮糸の間に、小さな穴を開けます。次に、12 mmの6-0シリコンコーティング・モノフィラメント縫合糸をECAに挿入してECAを完全に切断し、モノフィラメントを内頸動脈（ICA）側へと反転させます。出血を防ぐために縫合糸をきつく結び、リバースアクションピンセットを取り除きます。

次に、モノフィラメントをウィリス動脈輪に挿入し、中大脳動脈（MCA）の基部を閉塞させます。挿入深さは、外頸動脈（ECA）と総頸動脈（CCA）の分枝点から約9〜10 mm先までとします。通常、モノフィラメントが突き当たり、それ以上進まなくなります。

口蓋動脈を貫通させないよう注意してください。フィラメントを固定するため、外頸動脈（ECA）の結紮をしっかりと行います。最後に、オートクリップ創閉鎖システムを用いて皮膚を閉じます。

生理食塩水1 mLを皮下注射し、閉塞後期間である60分間、マウスを赤外線加熱ランプの下に置きます。前述と同様にマウスを麻酔し、オートクリップを取り除いてECAの縫合糸をわずかに緩め、モノフィラメントを抜去して血流を再灌流させます。その後、出血を防ぐためにECAの一時的な縫合糸を永久的に結紮します。

脳卒中誘発から1時間後、モノフィラメントを抜去し、再利用のために保管します。次に、血流を再開させるため、総頸動脈（CCA）の暫定的な結紮を解除します。その後、創部および皮下組織を縫合して閉じます。

マウスに生理食塩水をさらに 1 mL 注射します。動物の可動性が回復したことを確認した後、ケージに戻し、ケージの半分をヒーティングパッドの上に置いて、マウスが環境を選択できるようにします。手術から 12 時間後、すべてのシャム手術個体にブプレノルフィンを再度投与します。

術後にモノフィラメントを挿入しない点を除き、すべての手順は同一である。T-M-C-A-Oの成功を確認し、その効率スコアを決定するために神経学的欠損を評価する。灌流後1、24、48、72時間におけるマウスの神経学的欠損を、以下の6段階のスケールで判定する。0は正常、1は軽度であり、尾を持って持ち上げた際に、不規則な回転を伴うか、または伴わない回転が見られる。50%以上の試行で対側への回転を試みる。

2は、50%以上の試行において対側への軽度で一貫したカールが見られる状態とする。3は、一貫して強力かつ即座にカールが生じる状態とする。マウスがカールした姿勢を1〜2秒以上保持することを条件とする。

鼻がほぼ尾に届いている状態。4は重度の丸まり（curling）に相当する。さらに進行して、歩行反射や書き込み反射が消失するバレル状（barreling）となり、5は昏睡または盛り上がり（mound）の状態に相当する。

PBS溶液で灌流した後、脳をイソペンタンで速やかに凍結させ、-80°Cで保存します。計画している免疫組織化学研究に応じて、マウスの脳を4%パラホルムアルデヒドで灌流させる場合があることに注意してください。次に、クライオスタットを用いて、30枚のスライドを使用し、17µmの冠状断脳切片を作成します。

30切片ごとに1枚のスライドに配置します。次に、1枚目と15枚目のスライドをクリスタルバイオレットで染色します。より正確な損傷体積の推定を行うために、NIHのScion imageなどの画像解析システムを用いて、左右の大脳半球で白く見える梗塞領域である病変部位を評価します。

すべての脳切片に対して、このDの制限を繰り返します。梗塞体積を任意単位で算出し、各切片について対側非病変領域に対する割合（％）として表します。その他のスライドは、免疫組織化学研究のために−80 °Cで保存してください。

神経スコア評価により、管腔内処置を施した被験個体においてT-M-C-A-Oが成功したことが確認されます。ここで見られるように、一貫した強い、あるいは中程度の curling（体が丸まる動作）が観察され、マウスは鼻がほぼ尾に届く状態で1〜2秒以上丸まった姿勢を維持します。本実験では、すべてのマウスに少なくとも軽度の一貫した curling が認められ、これは試験期間中を通じて神経スコア2に相当します。

脳梗塞の範囲を評価するために、クレッセルバイオレット染色を行いました。ここに示すT-M-C-A-O後、再灌流から72時間経過したマウス脳の代表的な冠状断切片をクレッセルバイオレットで染色しました。ラベル付けされた梗塞領域（主に線条体、皮質、および隣接する脳領域）は、クレッセルで染色されないため白く現れます。

ここに示されている紫色の部分は損傷体積であり、右半球の白い部分を対側の左半球の非病変領域に対する割合（%）として表したものです。虚血性脳卒中後のC 57 black six雄マウスにおける梗塞体積は、非病変半球の約70%に相当します。この手法により、高い病変再現性が得られます。

このビデオを視聴することで、マウスにおける一過性脳虚血モデルの作製方法について十分に理解できたはずです。さらに、梗塞体積を測定するためのquiz violアプローチは、免疫化学的に関連マーカーを検査するための材料を大量に確保できるという大きな利点があります。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。