ヒト膵臓の収集プロトコル

この手順の全体的な目的は、解剖学的方向性を維持した状態でヒトの膵臓を解剖することです。これは、膵臓から十二指腸と脾臓を取り除き、次に膵臓から過剰な脂肪と血管を除去することで達成されます。第2段階では、前表面を青色インクで、後表面を黒色インクで染色します。

次に、膵臓を3つの領域に分けます。各領域を等分に横断的にスライスし、パラフィンカセットまたはOCT埋込用モールドに配置するか、さらに細かく刻んでバイアルに入れます。最終的に、今後の解析に向けて正しい解剖学的方向を維持しながら、膵臓の3つの領域すべてからサンプルを回収します。

この手法は、ベータ細胞の質量の減少や機能喪失の根底にあるメカニズム、あるいは免疫細胞による攻撃の性質など、1型糖尿病研究における重要な問いに対処するのに役立ちます。膵臓のin vivoでの方向性を維持するには細心の注意が必要であるため、膵臓の処理方法を視覚的に提示することが不可欠です。本手順のデモンストレーションは、私の研究室の組織技術者であるLinda Snyderと生物学者であるEmily Montgomeryが行います。

まず、処置に必要なすべての材料を準備します。最初に、パラフィンブロックを保持するカセットに、ドナー識別子、サンプルタイプ、分注番号、およびその他の追加情報を記載してラベルを貼ります。次に、OCTモールドにも同様にラベルを貼ります。

各OCTコンパウンドブロックを包むのに十分な大きさのアルミホイルを切り、後で使用するために取り置いておきます。新鮮なサンプルおよび凍結サンプルを保存するために必要なバイアルをすべて準備します。必要に応じて、RNAlaterおよびRPMI培地を添加してください。

次に、作業エリアを準備し、解剖ボード、滅菌済みの器具、および手順に必要なその他のすべての備品を、バイオセーフティフード内とカウンタートップ上の両方に配置します。すべてのカセットとOCT埋込型を、使用順に近くに並べておきます。スタイロフォーム製のボックスの底にあるドライアイスが浸るまで十分な量のイソペンタンを加え、凍結バスを作成します。

解剖を開始するために、十二指腸と脾臓を取り除きます。まず、端の方で十二指腸と膵臓を分離し始め、完全に切り離されるまで続けます。脾臓は緩く付着しているため、脂肪と膵臓から容易に取り除くことができます。

次に、鈍的および鋭的に剥離することを組み合わせて、膵臓から余分な脂肪、血管、神経を除去して清浄にします。脂肪とリンパ節は、後で処理するために取り分けておきます。清浄後、膵臓をペーパータオルを敷いた解剖台の上に置きます。

膵臓の正しい方向性を維持することは、この手技において最も困難な点です。確実に成功させるため、前表面と後表面に異なる色のインクで印を付けます。綿棒を青色インクに浸し、膵臓の前表面にインクを塗布し、余分なインクを拭き取ります。

次に、新しいアプリケーターを黒色インクに浸し、膵臓の後面に塗布します。膵臓を元の向きに戻します。前面を上にした状態で、膵臓を3つのセクションに切断する準備が整いました。

まず、頭部と体部の境界部を切断します。次に、残りの部分をほぼ等分に分割して体部と尾部を分離し、膵臓の各部位の重量を記録します。まず、頭部から行います。

パンの塊を切るように、各領域を横方向に切断し、約0.5 centimeterのセクションに分割します。膵臓の各領域のスライスが完了したら、頭部領域の最後のセクションである頭身接合部セクションを取り出し、別の解剖ボードに置きます。このセクションを細かく刻み、RNA用と非RNA用のラベルを貼ったクライオバイアルに均等に分注します。

その後、バイアルを凍結します。標準的な手順に従い、この操作を体尾部接合部セクションに対しても繰り返します。

刻片サンプルを回収後、すべての横断切片を右側に傾けます。各領域の切片を交互に除去します。パラフィンおよびOCTブロックの場合、パラフィン封入用の最初の切片を除去してください。

切片が大きすぎる場合は、半分に切断します。カセットにAおよびBとラベルを貼ります。それでもまだ大きすぎる場合は、各切片を前の切断線に対して垂直に切断し、カセットに時計回りにAからDまでラベルを貼ります。ここで示すように、ラベルが左側にくるようにカセットを配置してください。

次に、組織をカセットに入れ、蓋を閉じます。カセットを中性緩衝ホルマリンが入った容器に移します。OCTブロックの場合は、最も内側のセクションから始めて、各領域内でブロックに連番を付してください。

あらかじめラベルを貼った型に、OCTコンパウンドを薄く注ぎます。組織を導入する前に、組織をOCTコンパウンドで覆い、後で使用するためにサンプルを急速凍結させます。先に取り分けておいた組織に戻ります。結節被膜周囲の脂肪および結合組織を切り取り、膵リンパ節を単離します。リンパ節をDMEF containingの入った滅菌ディッシュに入れ、大きな結節は0.5 cm以下の大きさに細切にします。

膵リンパ節を単離したら、組織を準備したバイアルとカセットに分配し、さらなる処理を行います。リンパ節の処理が終わったら、脾臓を細切し、同様の方法で保存します。十二指腸を処理する場合、湿らせたガーゼパッドを使用して粘膜の粘液を拭き取り、粘膜を切り出した後、これを切断して分節します。

先に示した通りに粘膜サンプルを分割します。この手順を用いることで、ここで見られるように、膵臓の各部位の代表的なサンプルを採取できます。頭部、体部、尾部領域の重量はほぼ等しくなりました。

このビデオを視聴することで、ヒト膵臓をさまざまなサンプル形式に処理する方法、特に方向性を維持する能力、および膵周囲脂肪からリンパ節を単離する方法について十分に理解することができます。